식품의약품안전청 공고 제2012-279호

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안) 행정예고

2012. 12. 28

식품의약품안전청

식품의약품안전청 공고 제2012-279호

「건강기능식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전청고시 제2012-108호, 2012. 11. 7.)을 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 수렴하고자 그 취지, 개정 이유 및 주요 내용을 「행정절차법」 제46조에 따라 다음과 같이 공고합니다.

2012년 12월 28일

식품의약품안전청장

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안) 행정예고

1. 개정 이유
건강기능식품 기능성 원료의 기준 및 규격 신설과 세균수 기준 및 시험법을 명확히하여 다양한 건강기능식품 생산을 유도하는 등 건강기능식품산업의 활성화에 도움을 주고, 건강기능식품에 사용할 수 없는 원료를 추가하여 국민에게 안전한 건강기능식품을 제공하고자 함.

2. 주요 내용

가. 세균수 기준 적용의 명확화(안 제 2.4)

1) 유(油)상은 수분활성이 낮아 미생물이 증식할 수 없음에도, 제형상 액상에 해당하여 세균수 규격을 적용하고 있어 이에 대한 개정 필요

2) 액상 중 유상인 경우는 세균수 기준 적용을 제외함.

3) 유(油)상 건강기능식품에 세균수 기준 적용을 제외함으로 규격검사를 위한 비용절감 등 건강기능식품산업체에 도움

나. 기능성 원료별 기준 및 규격 추가 등재 [안 제 3. 개별 기준 및 규격 중 2-56, 2-57]

1) 「건강기능식품의 기준 및 규격」총칙 기능성원료별추가등재에 따라 기능성원료 추가필요

2) 청국장균배양분말 및 표고버섯균사체추출물에 대한 기준 및 규격 신설

- 청국장균배양분말 [안 제 3, 2-56]

- 표고버섯균사체추출물 [안 제 3, 2-57]

3) 건강기능식품 기능성 원료를 확대하여 다양한 건강기능식품 생산 등 건강기능식품산업 활성화에 도움

다. ‘영양소 기준치’ 변경에 따른 영양소의 일일섭취량 변경

1) 「식품등의 표시기준」에서 ‘영양소기준치’가 개정됨에 따라 이를 일치시키기 위하여 필요

2) 영양소섭취기준 및 영양소의 일일섭취량 변경

- 영양소 기준치 [안 [별표 2]]

- 영양소의 일일섭취량 [안 제 3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-11, 1-12, 1-16, 1-17, 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22]

3) 영양소 기준치 및 영양소의 일일섭취량을 명확히 하여 건강기능식품산업활성화에 도움

라. ‘은행잎 추출물’의 규격 추가

1) 저급의 은행잎 추출물이 유통되지 않도록 규격 추가 설정 필요

2) 기능성분(또는 지표성분)의 함량은 플라보놀 배당체가 240～300 mg/g 함유되어 있어야 하며, 퀘르세틴과 켐페롤의 비율이 0.8～1.2 이어야 함

3) 안전한 건강기능식품이 유통되도록 하여 국민에게 안전한 식품을 공급

마. 건강기능식품에 사용할 수 없는 원료 확대[안 [별표 5]]

1) 안전한 건강기능식품의 보급을 위하여 건강기능식품에 사용할 수 없는 원료 확대 필요

2) 건강기능식품에 사용할 수 없는 원료 목록에 뇌하수체, 벌독, 전립선 추가

3) 식품으로서 건전성이 확보되지 않는 원료를 건강기능식품에 사용하지 않도록 하여 국민에게 안전한 식품을 공급

바. 영양소 등 시험법 개정[안 제 4. 건강기능식품 시험법 중 3-3, 3-5, 3-11-2, 3-45, 3-67, 3-72]

1) 분석의 효능을 높이기 위하여 시험법 개정 필요

2) 클로렐라와 스피루리나의 시험법을 명확히 하고, 비타민 D, 비타민 K, 엽산(제2법), 루테인, 깅콜릭산, 실리마린, MSM의 시험법 개정

3) 시험법을 효율적으로 개정하여 산업체의 건강기능식품 기준 규격 관리에 도움

3. 의견 제출

「건강기능식품의 기준 및 규격」 일부개정고시(안)에 대하여 의견이 있는 단체 또는 개인은 2013년 1월 31일까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전청장(우편번호 : 363-700, 주소 : 충청북도 청원군 오송읍 오송생명2로 187(연제리 643번지) 오송보건의료행정타운 식품의약품안전청, 참조 : 건강기능식품기준과, 전화 043-719-2454, 팩스 043-719-2450)에게 제출하여 주시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 항목별 의견(찬․반 여부와 그 이유)

나. 성명(단체의 경우 단체명과 그 대표자의 성명), 주소 및 전화번호

다. 기타 참고사항

식품의약품안전청 고시 제2012-279호

「건강기능식품에 관한 법률」 제14조 및 제15조에 따른 「건강기능식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전청 고시 제2011-68호, 2011.11.17)을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2013년 12월 28일

식품의약품안전청장

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안)

건강기능식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제 2. 공통 기준 및 규격 4 건강기능식품의 기준 및 규격 적용 [표1]을 다음과 같이 개정한다.

			<적용해야할 규격>
1. 공통규격 중 제형별 규격 적용	액상인 경우2)	→	∘세균수

2) 프로바이오틱스를 기능성 원료로 사용한 경우와 유(油)상인 경우에는      제외함

제 3, 1-4 비타민 E 일일섭취량 “3～400 mg α-TE” 을 “3.3～400 mg α-TE” 로 하고, 1-5 비타민 K 일일섭취량 “16.5～1,000 μg 을 21～1,000 μg으로 하고, 1-6 비타민 B1 일일섭취량 0.3～100 mg 을 0.36～100 mg 으로 하고, 1-7 비타민 B2 일일섭취량 0.36～40 mg을 0.42～40 mg 으로 하고, 1-8 나이아신 일일섭취량 니코틴산인 경우 3.9～23 mg, 니코틴산아미드인 경우 3.9～670 mg 을 니코틴산인 경우 4.5～23 mg 으로 하고, 니코틴산아미드인 경우 4.5～670 mg 으로 하고, 1-11 엽산 일일섭취량 75～400 μg을 120～400 μg 으로 하며 1-12 비타민 B12 일일섭취량 0.3～2000 μg을 0.72～2000 μg 으로 한다.

제 3, 1-16 마그네슘의 일일섭취량 66～250 mg 을 94.5～250 mg 으로 하고 1-17 철 일일섭취량 4.5～15 mg 을 3.6～15 mg 으로 하고 1-18 아연 일일섭취량 3.6～12 mg 을 2.55～12 mg 으로 하고 1-19 구리 일일섭취량 0.45～7.0 mg 을 0.24～7.0 mg 으로 하고 1-20 셀레늄(또는 셀렌) 일일섭취량 15～135 μg 을 16.5～135 μg 으로 하고 1-21 요오드의 일일섭취량 22.5～150 μg 을 45～150 μg 으로 하며 1-22 망간의 일일섭취량 0.6～3.5 mg 을 0.9～3.5 mg  으로 한다.

제 3, 2-4 클로렐라 4) 시험법 중 (1) 총 엽록소 : 제 4. 3-56 총 엽록소를 제4. 3-56-1 총 엽록소(제1법)으로,  2-5 스피루리나 4) 시험법 중 (1) 총 엽록소 : 제 4. 3-56 총 엽록소를 제4. 3-56-2 총 엽록소(제2법)으로 하고 2-24 공액리놀레산 1) (3) 제조방법 중 글리세라이드를 트리글리세라이드로 한다.

제 3, 2-13 은행잎 추출물의 1) 제조기준 (3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량의 플라보놀 배당체(flavonol glycoside)가 240～300 mg/g 함유되어 있어야 함을  플라보놀 배당체(flavonol glycoside)가 240～300 mg/g 함유되어 있어야 하며 퀘르세틴과 켐페롤의 비율이 0.8～1.2 이어야 함으로 한다.

제 3, 2-56 표고버섯균사체 추출물을 다음과 같이 신설한다.

1) 제조기준

(1) 원재료 : 표고버섯(Lentinus edodes)의 균사체

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 열수로 추출한 후 여과․농축하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 베타글루칸을 35 mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 베타글루칸

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ～ 120 %

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 간건강에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일 섭취량

베타글루칸으로서 50 ～ 130 mg

4) 시험법

(1) 베타글루칸 : 제4. 3-25 베타글루칸

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

제 3, 2-57 청국장균배양정제분말을 다음과 같이 신설한다.

1) 제조기준

(1) 원재료 : 고초균(Bacillus subtilis 및 Bacillus subtilis chungkookjang)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 배양하고 여과하거나 칼륨, 칼슘, 나트륨, 마그네슘의 염을 단독 또는 복합으로 충분히 중화시킨 후 결정화하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 폴리감마글루탐산을 700 mg/g이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 폴리감마글루탐산

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ～ 120%

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 1.0 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.5 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 0.5 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 체내 칼슘흡수 촉진에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일 섭취량

폴리감마글루탐산으로서 60～70 mg

[별표 2] 영양소 기준치를 다음과 같이 한다.

영양소	기준치	영양소	기준치	영양소	기준치
탄수화물(g)	330	철분(㎎)	12	판토텐산(㎎)	5
식이섬유(g)	25	비타민D(㎍)	5	인(㎎)	700
단백질(g)	55	비타민E(㎎α-TE)	11	요오드(㎍)	150
지방(g)	51	비타민K(㎍)	70	마그네슘(㎎)	315
포화지방(g)	15	비타민B1(㎎)	1.2	아연(㎎)	8.5
콜레스테롤(㎎)	300	비타민B2(㎎)	1.4	셀렌(㎍)	55
나트륨(㎎)	2,000	나이아신(㎎ NE)	15	구리(㎎)	0.8
칼륨(㎎)	3,500	비타민B6(㎎)	1.5	망간(㎎)	3.0
비타민A(㎍ RE)	700	엽산(㎍)	400	크롬(㎍)	50
비타민C(㎎)	100	비타민B12(㎍)	2.4	몰리브덴(㎍)	25
칼슘(㎎)	700	비오틴(㎍)	30

[별표 5] 건강기능식품 제조에 사용할 수 없는 원료 중 2. 동물성 원료에 뇌하수체, 벌독, 전립선을 추가한다.

2. 동물성 원료

원료명	비 고
뇌하수체
벌독
전립선

제 4, 3-3 비타민 D 1. 시험방법의 요약중 ‘벤젠용액을 이용하여 추출 후’를 ‘헥산으로 추출한 후’로 하고 2. 장비와 재료 중 2.1.7 여과지(FH Type, pore size 0.5 μm)는 삭제하고 2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 7.5 mm, 길이300 mm, 충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것을 육방전환밸브시스템으로 하고 2.2.4 순상형 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 Silica gel) 또는 이와 동등한 것을 칼럼으로 하며 2.2.4.1부터 2.2.4.3을 신설한다.

2.2.4.1 전처리 컬럼 : Capcellpak MF C8 SG80(4.6mm x 150mm, 5um) 또는 이와 동등한 것

2.2.4.2 농축컬럼 : Capcellpak C18 120V(2.0mm x 35mm, 5um) 또는 이와 동등한 것

2.2.4.3 분석컬럼 : Capcellpak C18 UG 120V(4.6mm x 250mm, 5um) 또는 이와 동등한 것

제 4, 3-3 비타민 D 2. 중 2.3 분석장비의 준비를 다음과 같이 한다.

2.3 분석장비의 준비

전처리 컬럼에서 비타민 D의 피크 용출시간을 확인한 후 농축을 위한 육방전환밸브의 조작시간을 설정하여 분석할 수 있도록 한다.

제 4, 3-3 비타민 D 3. 중 3.1.1은 삭제하고, 3.1.2는 3.1.1로 하며 3.2.2 벤젠(Benzene)은 증류수로 하고 3.2.3 아세토니트릴(Acetonitrile)은 수산화칼륨(Potassium hydroxide)로 하며 3.2.7 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride)을 신설한다.

제 4, 3-3 비타민 D 4. 시험과정을 다음과 같이 한다.

4. 시험과정

4.1 시약 제조

4.1.1 이동상 A

메탄올 900 ml에 에탄올 100 mL을 혼합한 용액을 830 mL 취하여 물로 1L가 되도록 조제하고 탈기하여 사용한다(메탄올/에탄올/물: 74.7/8.3/17 (v/v/v)).

4.1.1 이동상 B

메탄올 900 ml에 에탄올 100 mL을 혼합하여 사용한다(메탄올/에탄올:9/1(v/v)).

4.2 표준용액 제조

4.2.1 비타민 D3 100mg을 메탄올 100mL에 녹여 조제한다(1,000ug/mL).

4.3 시험용액 제조

4.3.1 시료가 고체인 경우 초고속마쇄기로 잘게 마쇄한다.

4.3.2 비타민 D를 2 IU(0.05 μg) 이상 함유한 시료를 증류플라스크에 정밀히 취한다.

4.3.3 피로갈롤 : 에탄올(1→10)용액 40 mL을 가하여 약하게 진탕 혼합한다.

(고체시료의 경우, 물 3mL로 충분히 녹인 후 혼합)

4.3.4 90% 수산화칼륨 10 mL을 가하고 환류냉각기에 부착하여 수욕중에서 30분간 가열 비누화한다.

4.3.5 냉각 후 헥산 50 mL을 가하여 10분간 강하게 진탕 혼합한다. 침전이 생기면 이것이 가라앉을 때까지 방치한다(3회 추출)

4.3.6 헥산층을 250 mL 분액깔대기에 옮겨 1 N 수산화칼륨 100 mL을 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다.

4.3.7 이를 방치하여 층분리 한 후(헥산층은 투명하지 않아도 됨) 혼탁한 물층을 버린다.

4.3.8 헥산층에 0.5 N 수산화칼륨 40 mL을 넣어 진탕 혼합한 후 물층을 다시 버린다.

4.3.9 헥산층에 적어도 4회(매회 15초씩) 물 40 mL로 세척한다. 세척액이 페놀프탈레인시액으로 알칼리반응을 나타내지 않을 때까지 세척한다.

4.3.10 수세한 헥산층을 무수황산나트륨으로 탈수하여 갈색 플라스크로 옮기고 무수황산나트륨을 헥산 10 mL로 2회 세척한 후 탈수한 헥산용매와 합하고 이를 40℃이하에서 감압 농축한다.

4.3.11 잔류물에 메탄올 5 mL를 가한 후 이를 membrane filter로 여과한 후 시험용액으로 한다.

제 4, 3-3 비타민 D 5. 분석 및 계산 중 표 1을 다음과 같이 하고 표 2는 삭제한다.

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	210 uL
칼럼온도	35℃
이동상	전처리컬럼 : 이동상 A 분석컬럼: 이동상 B
검출기 파장	254 nm
유량	전처리컬럼 : 300 uL/min 분석컬럼 : 500uL/min

제 4, 3-5 비타민 K를 3-5 비타민 K1, 3-5-1 비타민 K1(제1법)으로 하고 1. 시험방법의 요약을 다음과 같이 한다.

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료에 있는 trans형 비타민K1을 유기용매로 용해하여 추출하고 건고한 추출물을 2차 용매에 녹여 실리카겔 오픈컬럼으로 정제하고 순상컬럼을 이용한 액체크로마토그래피에서 자외부검출기로 정량하는 방법이다.

제 4, 3-5-1 비타민 K1(제1법) 4. 시험과정 중 4.3.4부터 4.3.15를 다음과 같이 하고 4.3.16을 신설한다.

4.3.4 위의 용액에 메탄올 60 mL의 메탄올을 가하고 30초간 혼합한다.

4.3.5 혼합 후 디클로로메탄 100 mL와 이소옥탄 50 mL 혼합액을 가하여 잘 흔들어 추출한다.

4.3.6 층 분리 후 하층액을 250 mL 증류플라스크에 옮긴다.

4.3.7 [4.3.5]의 과정을 반복하여 하층액을 [4.3.6]의 용액과 합한다.

4.3.8 위의 용액을 75℃이하에서 감압 농축한다.

4.3.9 증류플라스크를 아세톤 20 mL로 씻고 다시 농축시킨다.

4.3.10 [4.3.8]의 과정을 3회 반복 후 질소로 충전하여 차광한 채로 밀봉한다.

4.3.11 정제칼럼에 conditioning 용액 20 mL을 주입하고 천천히 용출 시킨 후 그 액을 버린다.

4.3.12 위의 잔류물에 conditioning 용액 10 mL로 녹인 후 칼럼에 통과시켜 비타민 K1을 흡착시킨다.

4.3.13 Conditioning용매를 5 mL씩 2회에 걸쳐 증류플라스크를 씻어 정제칼럼에 통과시킨다.

4.3.14 시료의 지방 함량에 따라 용출용매를 칼럼에 통과시킨다. 시료의 지방함량이 0.72～0.80 g이면 100 mL의 용매를, 0.72 g 이하이면 예비실험을 통해 용출액의 양을 결정한다.

4.3.15 용출액을 250 mL 증류플라스크에 받아 75℃이하로 감압 농축한다.

4.3.16 농축액을 이소옥탄 1～2 mL로 수 회 나누어 씻어 5 mL로 정용한다.

제 4, 3-5-1 비타민 K1(제1법) 5. 분석 및 계산 중 표 1을 다음과 같이 하고 표 2는 삭제한다.

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	35℃
이동상	이동상
검출기 파장	254 nm
유량	0.5 mL/분

제 4, 3-5-2 비타민 K1(제2법)을 다음과 같이 신설한다.

3-5-2 비타민 K1(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 지방을 효소적으로 분해하여 지방산으로 침전시킨 후 헥산으로 비타민 K1을 추출하여 역상컬럼으로 분리하고 포스트 컬럼으로 환원시켜 형광을 이용하여 정량하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 증류플라스크(250 mL)

2.1.5 분액깔대기(500 mL)

2.1.7 감압농축기

2.1.8 정제칼럼(1.0 cm id×30 cm, 유리 칼럼)

2.1.9 시험관(200×24 mm ID)

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD)

2.2.3 컬럼

2.2.3.1 분석컬럼 : 옥타데실실릴화한 칼럼으로 carbon loading량이 10% 이상인 것(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 Silica gel) 또는 이와 동등한 것

2.2.3.2 포스트 컬럼 : 안지름 4.0mm, 길이 20mm 또는 이와 동등한 것 혹은 내경 2.0～4.0mm 및 길이 30～50mm의 액체크로마토그래피 컬럼관에 아연분말을 채워 제작한 것으로 분석컬럼과 형광검출기 사이에 장착한다.

※ 포스트 컬럼 제작 시 빈 공간이 생기지 않도록 주의하여 아연분말을 채우고 장착하기 전 30분간 이동상을 약 1 mL/min의 유속으로 흘려 평형이 이루어지는지 확인하고 장착 후 30~60분 이상 시스템을 안정화하여 분석한다.

2.3 분석장비의 준비

이동상 용매를 분당 0.8 mL씩 흘려줌으로써 기기와 칼럼을 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 Vitamin K1(2-Methyl-3-phytyl-1,4-naphthoquinone; 3-Phytylmenadione; Phylloquinone; Vitamin K1(20))

분자식 : C31H46O2, 분자량 : 450.70, CAS No. : 84-80-0

3.2 일반시약

3.2.1 증류수(Distilled water)

3.2.2 리파아제(Lipase)

3.2.3 수산화칼륨(Potassium hydroxide)

3.2.4 인산이수소칼륨(Potassium dihydrogen phosphate)

3.2.5 에탄올(Ethanol)

3.2.6 메탄올(Methanol)

3.2.7 헥산(Hexane)

3.2.8 디클로로메탄(Dichloromethane)

3.2.9 이소프로판올(Isopropanol)

3.2.10 염화아연(Zinc chloride)

3.2.11 무수초산나트륨(Sodium acetate)

3.2.12 무수탄산칼륨(Potassium carbonate)

3.2.13 초산(Acetic acid)

3.2.14 아연분말(Zinc powder)

4. 시험과정

4.1 시약 제조

4.1.1 증류수

3차증류수로 18 MΩ 이상인 것

4.1.2 Lipase

Candida rugosa를 기원으로 하는 것으로써 약 1,000unit/mg(Type VII)의 활성이 있는 것 또는 동등한 효소 활성을 가진 것으로써 Pseudomonas와 Rhizopus를 기원으로 하는 것

4.1.3 40% 수산화칼륨용액

40 g KOH를 증류수로 녹여 100 mL로 하여 조제한다.

4.1.4 0.8 M 인산완충용액

54.0 g KH2PO4를 물 350 mL에 녹여 40% 수산화칼륨용액으로 pH를 7.9~8.0으로 조정하여 증류수로 희석하여 500 mL로 하여 조제한다.

4.1.5 알콜혼합용매

에탄올과 메탄올을 95:5의 부피비로 혼합하여 조제한다.

4.1.6 아연분말

입자 60um 이하인 것 또는 이와 동등한 것으로 개봉 후 즉시 사용한다.

4.1.7 이동상

메탄올 900 mL에 디클로메탄 100 mL을 혼합한 용매에 염화아연 1.37 g과 무수초산나트륨 0.41 g 및 초산 0.30 g을 메탄올 5 mL에 녹여 첨가하고 0.45 um 여지로 여과하고 탈기하여 조제한다.

4.2 표준용액 제조

4.2.1 비타민 K1 표준물질 100 mg을 100 mL 이소프로판올에 녹인 후 표준원액으로 한다.

4.2.2 위의 용액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

4.3 시험용액 제조

※ 시험용액 조제시 직접적인 태양광에 노출되지 않도록 실험을 진행한다.

4.3.1 고체 시료는 약 1.0 g, 액체시료는 약 10.0 g을 시험관에 정밀하게 취한다.

4.3.2 40℃ 이하의 증류수 15 mL을 가한 후 혼합한다.

(액체시료의 경우 미지근한 물 5 mL를 첨가한다.)

4.3.3 인산완충용액 5.0 mL을 첨가하여 혼합한다.

4.3.4 위의 용액에 1.0 g의 lipase 분말을 넣고 혼합한다.

4.3.5 시험관 마개를 막고 고르게 균질화 될 수 있도록 30~60초간 진탕한다.

4.3.6 위의 용액을 37±2℃에서 20분 간격으로 15초간 진탕하며 총 2시간 분해한다.

4.3.7 분해 후 수욕상에서 냉각한다.

4.3.8 위의 용액에 10 mL 알콜혼합용액을 가한 후 혼합한다.

4.3.9 위의 용액에 1.0 g의 무수탄산칼륨을 첨가하여 혼합한다.

4.3.10 분해가 완료된 시험관에 30 mL 헥산을 첨가하여 마개를 막고 10분간 격렬히 진탕한다(냉암소에 보관하여 층이 분리되도록 하며, 층분리가 잘 되지 않을 때에는 약 1,000 rpm(200 g)로 10분간 원심분리 함).

4.3.11 헥산 상층액을 시료의 특성에 따라 1.0～5.0 mL 취하여 바이얼로 옮기고 질소 농축한다.

4.3.12 농축 후 메탄올 1 mL으로 용해하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	30℃
이동상	이동상
검출기 파장	여기파장 243 nm, 측정파장 430 nm
유량	0.8 mL/분

5.2 계산

5.2.1 비타민 K1 함량(μg/100g)＝C × [eqn: rm {30} over {V} TIMES {1} over {S} TIMES {100} over {1000}]

C :	시험용액의 농도(μg/L)

V :	시표특성에 따라 취한 헥산의 부피(mL)

S :	시료 채취량(g)

제 4, 3-11-2 엽산(제2법) 의 1. 시험방법의 요약을 다음과 같이 한다.

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 10 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 추출하고 역상 분배형 컬럼을 이용하여 액체크로마토그래프에서 분리하고 UV 280nm에서 측정한다.

제 4, 3-11-2 엽산(제2법) 의 3. 표준물질 및 일반시약 중 3.2.1 수산화나트륨(Sodium chloride)을 인산수소이나트륨(Disodium hydrogen phosphate)으로 하고 3.2.3 헥산설폰산나트륨(Sodium hexane sulfonate)를 인산이수소나트륨(Sodium dihydrogen phosphate)으로 하고 3.2.4 초산(Acetic acid)을 아세토니트릴(Acetonitrile)롤 하며 3.2.5 메탄올(Methanol)을 테트라부틸암모늄 브로마이드(Tetrabutylammonium bromide)로 한다.

제 4, 3-11-2 엽산(제2법) 의 4. 시험과정을 다음과 같이 한다.

4. 시험과정

4.1 시약 제조

4.1.1 10 mM 인산완충용액(pH 8.0)

10 mM 인산수소이나트륨 용액에 10mM 인산이수소나트륨 용액을 가하여 pH 8.0로 조정하여 제조한다.

4.1.2 이동상 A

Tetrabutylammonium bromide  1.6120 g (5 mM)을 pH 7.2로 조정한 인산완충용액을 가하여 1 L가 되게 한 뒤 0.22μm필터로 여과하여 조제한다.

4.2 표준용액의 조제

4.2.1 엽산 표준품(99.9%)를 0.1 N NaOH 수용액에 녹여 1000 mg/L가 되도록 조제한다.

4.2.2 표준원액을 이동상 A로 희석하여 10 mg/L로 조제한다.(사용 시 제조)

4.3 시험용액의 조제

4.3.1 시료 일정량을 정밀히 취한다.

4.3.2 위의 시료를 50 mL 갈색 부피플라스크에 넣고 10 mM 인산완충용액(pH 8.0)을 넣는다.

4.3.3 30분 동안 초음파 추출한다.

4.3.4 10 mM 인산완충용액(pH 8.0)을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3.5 35,000 G로 10분간 원심분리를 하고 상등액을 취해 0.2 um 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

제 4, 3-11-2 엽산(제2법) 5 분석 및 계산 중 표 1을 다음과 같이 하고 표 2는 삭제한다.

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항 목	조 건
주입량	20 μL
칼럼온도	40 ℃
이동상	이동상 A: 아세토니트릴=8:2
검출기파장	280 nm
유속	1.0 mL/분

제 4. 3-45 루테인 1. 시험방법의 요약 중 ‘용매혼합용액으로’를 ‘증류수로 분산시킨 루테인 원료를 에틸아세테이트로’로 한다.

제 4. 3-45 루테인 2. 장비와 재료의 2.1을 다음과 같이 하고 2.1.7부터 2.1.11을 신설한다.

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 원심분리관(PP, 50 mL)

2.1.2 피펫(30 mL)

2.1.3 부피플라스크(갈색, 50 mL)

2.1.4 피펫(1000 μL, 250 μL)

2.1.5 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.6 부피플라스크(100 mL)

2.1.7 질소농축기

2.1.8 질소가스

2.1.9 초음파 추출기

2.1.10 Quartz cuvette(3 mL, 1 cm)

2.1.11 원심분리기

제 4. 3-45 루테인 2. 장비와 재료의 2.2.4의 ‘충진제 silica gel’을 ‘충진제 silica gel, 5 μm’로 하고 2.3의 ‘1’은 ‘1.5’로 하며 3. 표준물질 및 일반시약의 3.2.3 아세톤(Acetone)은 염화나트륨(Sodium chloride)으로 하고 3.2.4 톨루엔(Ethanol)은 증류수(Water)로 한다.

제 4. 3-45 루테인 4. 시험과정은 다름과 같이 한다.

4. 시험과정

4.1 추출용액 제조

4.1.1 아래와 같이 시료를 정밀하게 칭량하여 원심분리관에 옮겨담는다.

※ 루테인 원료 : Lutein 5%, Lutein 10% : 약 30 mg, Lutein 15% : 약 15 mg, 루테인 제품 : 약 70 mg

4.1.2 준비된 원심분리관에 증류수 15 mL을 첨가한다.

4.1.3 30분간 초음파 처리하여 시료를 완전히 분산시킨다.

4.1.4 30 mL 에틸아세테이트를 첨가한다.

4.1.5 원심분리관에 염화나트륨 약 3 g을 넣고 마개를 한 후, 진탕하여 추출한다.

4.1.6 2,000rpm으로 5분간 원심분리한다.

4.1.7 이때 상층액은 주황색임을 확인하고 하층액이 엷은 노랑색 혹은 무색이 되어야 한다. 필요 시 진탕과 원심분리를 다시 반복한다.

4.2 자외분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer) 분석

4.2.1 추출용액 중 상층액 1 mL을 취하여 25 mL 에탄올이 채워진 50 mL 정용플라스크에 취하고 이에 에탄올을 가하여 표선까지 채워 희석한다.

4.2.2 이를 20초간 진탕하여 혼합하고 에탄올을 대조액으로 하여 446 nm에서 그 흡광도를 자외분광광도계로 측정한다.

4.3 액체크로마토그래피 분석

4.3.1 4.1.7의 상층액 250 μL을 갈색 HPLC 바이알에 옮겨 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨 후 이동상 1 mL을 넣고 마개를 한 후 30초간 초음파로 진탕하여 녹인 후 이를 액체크로마토그래피로 분석한다.

제 4, 3-45 루테인 5. 분석 및 계산 중 5.2 계산은 다름과 같이 한다.

5.2 계산

5.2.1 총 카로티노이드 함량(%)=(A×Vd×Ve×100) /(α×Va×1×m)

A : 446 nm에서 측정한 흡광도

Vd : 희석용매의 부피(mL) ; 50 mL

Ve : 추출용매의 부피(mL) ; 30 mL

α : 흡광도 계수( 255 mL/mg․cm)

※ 1% 루테인 에탄올 용액(10 mg/mL)의 흡광도 : 2550

1 : Quartz cuvette의 규격(1 cm)

Va : 희석 시 사용한 추출용매의 부피(mL) ; 1 mL

m : 검체량(mg)

제 4, 3-67. 깅콜릭산(Ginkgolic acid) 의 1. 시험방법의 요약 중 ‘깅콜릭산 C15:1, C17:1의 합’을 ‘깅콜릭산 C13:1, C15:1, C17:1의 합’으로 한다.

제 4, 3-67. 깅콜릭산(Ginkgolic acid) 의 2. 장비와 재료의 ‘2.2.3 YMC C18 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것’을 ‘스위칭밸브’로 하고 2.2.4와 2.2.5를 다음과 같이 신설한다.

2.2.4 C8 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진입자크기 5 μm, 전처리 컬럼) 또는 이와 동등한 것

2.2.5 C18 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진입자크기 5 μm, 분석컬럼) 또는 이와 동등한 것

제 4, 3-67. 깅콜릭산(Ginkgolic acid) 의 5. 분석 및 계산 중 5.2.2의 ‘표준품을 이용한 RRT(relative retention time, 상대머무름시간)을 확인 하여 ginkgolic acid C15:1, C17:1의’ 을 ‘경우 표준품 C15:1의 표준품을 이용한 RRT(relative retention time, 상대머무름시간)을 확인 하여’ 로 하고 계산식을 다음과 같이 한다.

깅콜릭산 (ginkgolic acid C13:1, C15:1, C17:1) 함량(mg/kg)=	A × B × C
	D × 100

A : 시험용액 농도 (μg/mL)

B : 용액량 (mL)

C : 표준품 순도 (%)

D : 시료채취량 (g)

제 4, 3-68 실리마린(Silymarin)의 5.2 계산 중 5.2.1 ‘각 표준용액으로 실리크리스틴, 실리디아닌, 실리빈A, 실리빈B, 이소실리빈A, 이소실리빈 B의 위치를 확인한다.’를 다음과 같이 하고 5.2.2는 삭제한다.

5.2.1 실리마린의 6종(실리크리스틴, 실리디아닌, 실리빈 A, 실리빈 B, 이소실리빈 A, 이소실리빈 B)의 검량선을 작성한 후 시료 중의 실리마린 6종의 농도를 계산하여 아래 식을 이용하여 실리마린 함량을 계산한다.

실리마린 함량 mg/g =	A × B × P
	S

A = 시험용액 중의 실리크리스틴, 실리디아닌, 실리빈(실리빈A와 실리빈B), 이소실리빈(이소실리빈A와 이소실리빈B)의 농도의 합(μg/mL)

B = 시험용액의 전량 (mL)

P = 표준물질의 순도

S = 시료채취량 (mg)

제 4, 3-72 디메틸설폰(MSM) 3. 표준물질 및 일반시약 3.3 의 3.2.1을 3.3.1로 하고 4.2.2 중 ‘적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다.’를 ‘100 mL 부피플라스크에 적절히 취하고 내부표준용액 1.0 mL씩 가한 후 메탄올로 표선까지 맞춘 것을 표준용액으로 사용한다.’로 하며 4.2 시험용액의 조제를 4.3 시험용액의 조제로 4.2.1을 4.3.1로, 4.2.2를 4.3.2로 4.2.3을 4.3.3으로 4.2.4를 4.3.4로 한다.

제 4, 3-72 디메틸설폰(MSM) 5. 분석 및 계산 5.2 계산을 다음과 같이 하고 5.2.1을 삭제한다.

MSM 함량(mg/g) = STc × (SA/ST) × (STis/SAis) × V/S

STc : 시험용액중의 디메틸설폰의 농도(mg/mL)

SA : 시험용액내 표준물질의 피크면적

ST : 표준물질의 피크면적

STis : 표준물질용액내 내부표준물질 피크면적

SAis : 시험용액내 내부표준물질 피크면적

V : 최종희석용액(mL)

S : 시료 채취량(g)

부  칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날로부터 시행한다. 다만, 제 3 개별 기준 및 규격 중 1. 영양소의 일일섭취량 및 [별표 2] 영양소 기준치, 2-56 표고버섯균사체 추출물, 2-57 청국장균배양정제물은 2014년 1월 1일부터 시행한다.

제2조(적용례) 이 고시는 이 고시 시행 이후 최초로 제조·가공 또는 수입한 건강기능식품(원료를 포함한다)부터 적용한다.

제3조(경과조치) ① 이 고시 시행 당시 검사가 접수되어 진행 중인 사항에 대하여는 종전의 규정에 따른다.

② 이 고시 시행 당시 종전의 규정에 따라 제조․가공․수입(선적일을 기준으로 한다)한 건강기능식품은 종전의 규정에 따른다. 이 경우 해당 건강기능식품은 유통기한까지 판매할 수 있다.

현  행

개 정 안

제 2. 공통기준 및 규격

제 2. 공통기준 및 규격

4. 건강기능식품의 기준 및 규격 적용

1) ～ 4) (생  략)

[표1]건강기능식품의 기준 및 규격 적용 절차

			<적용해야할 규격>
1. 공통규격 중 제형별 규격 적용	액상인 경우2)	→	∘세균수

2) 프로바이오틱스를 기능성 원료로 사용한 경우에는 제외함

4. 건강기능식품의 기준 및 규격 적용

1) ～ 4) (현행과 같음)

[표1]건강기능식품의 기준 및 규격 적용 절차

			<적용해야할 규격>
1. 공통규격 중 제형별 규격 적용	액상인 경우2)	→	∘세균수

2) 프로바이오틱스를 기능성 원료로 사용한 경우와 유(油)상인 경우에는 제외함

제 3. 개별기준 및 규격

제 3. 개별기준 및 규격

1-4 비타민 E

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 3～400 mg α-TE

4) (생  략)

1-4 비타민 E

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 3.3～400 mg α-TE

4) (생  략)

1-5 비타민 K

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 16.5～1,000 μg

4) (생  략)

1-4 비타민 K

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 21～1,000 μg

4) (생  략)

1-6 비타민 B1

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 0.3～100 mg

4) (생  략)

1-4 비타민 B1

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 0.36～100 mg

4) (생  략)

1-7 비타민 B2

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 0.36～40 mg

4) (생  략)

1-4 비타민 B2

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 0.42～40 mg

4) (생  략)

1-8 나이아신

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) (생  략)

(가) (생  략) : 3.9～23 mg

(나) (생  략) : 3.9～670 mg

4) (생  략)

1-8 나이아신

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) (현행과 같음)

(가) (생  략) : 4.5～23 mg

(나) (생  략) : 4.5～670 mg

4) (현행과 같음)

1-11 엽산

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 75～400 μg

4) (생  략)

1-11 엽산

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 120～400 μg

4) (현행과 같음)

1-12 비타민 B12

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 0.3～2000 μg

4) (생  략)

1-12 비타민 B12

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 0.72～2000 μg

4) (생  략)

1-16 마그네슘

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 66～250 mg

4) (생  략)

1-16 마그네슘

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 94.5～250 mg

4) (현행과 같음)

1-17 철

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 4.5～15 mg

4) (생  략)

1-17 철

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 3.6～15 mg

4) (현행과 같음)

1-18 아연

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 3.6～12 mg

4) (생  략)

1-18 아연

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 2.55～12 mg

4) (현행과 같음)

1-19 구리

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 0.45～7.0 mg

4) (생  략)

1-19 구리

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 0.24～7.0 mg

4) (현행과 같음)

1-20 셀레늄(또는 셀렌)

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 15～135 μg

4) (생  략)

1-20 셀레늄(또는 셀렌)

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 16.5～135 μg

4) (현행과 같음)

1-21 요오드

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 22.5～150 μg

4) (생  략)

1-21 요오드

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 45～150 μg

4) (현행과 같음)

1-22 망간

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) 일일섭취량 : 0.6～3.5 mg

4) (생  략)

1-22 망간

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량 : 0.9～3.5 mg

4) (현행과 같음)

2-4 클로렐라

1) ～ 3) (생  략)

4) (생  략)

(1) 총 엽록소 : 제 4. 3-56 총 엽록소

(2) ～(4) : (생  략)

2-4 클로렐라

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) (현행과 같음)

(1) 총 엽록소 : 제 4. 3-56-1 총 엽록소(제1법)

(2) ～(4) : (현행과 같음)

2-5 스피루리나

1) ～ 3) (생  략)

4) (생  략)

(1) 총 엽록소 : 제 4. 3-56 총 엽록소

(2) ～(4) : (생  략)

2-5 스피루리나

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) (현행과 같음)

(1) 총 엽록소 : 제 4. 3-56-2 총 엽록소(제2법)

(2) ～(4) : (현행과 같음)

2-13 은행잎 추출물

1) (생  략)

(1) ～(2) : (생  략)

(3) 플라보놀 배당체(flavonol glycoside)가 240～300 mg/g 함유되어 있어야 함

2) ～ 4) (생  략)

2-13 은행잎 추출물

1) (현행과 같음)

(1) ～(2) : (현행과 같음)

(3) ------------------------
------------------------
-----하며, 퀘르세틴과 켐페롤의 비율이 0.8～1.2 이어야 함

2) ～ 4) (생  략)

2-24 공액리놀레산

1) (생  략)

(1) (생  략)

(2) (생  략)

(가) (생  략)

(나) 글리세라이드형태:------------------------------글리세라이드화한 후, ----------------------------------------

(3) (생  략)

2) ～ 4) (생  략)

2-24 공액리놀레산

1) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) (현행과 같음)

(가) (현행과 같음)

(나) 트리글리세라이드형태:----------------------------트리글리세라이드화한 후, ----------------------------------------

(3) (현행과 같음)

2) ～ 4) (현행과 같음)

<신  설>

2-56 표고버섯균사체 추출물

1) 제조기준

(1) 원재료 : 표고버섯(Lentinus edodes)의 균사체

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 열수로 추출한 후 여과․농축하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 베타글루칸을 100 mg/g 이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 베타글루칸

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ～ 120 %

(3) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 간건강에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일 섭취량

베타글루칸으로서 35 ～ 70mg

4) 시험법

(1) 베타글루칸 : 제4. 3-25 베타글루칸

(2) 대장균군 : [별표 4] 참조

<신  설>

2-57 청국장균배양정제분말

1) 제조기준

(1) 원재료 : 고초균(Bacillus subtilis 및 Bacillus subtilis chungkookjang)

(2) 제조방법 : 상기 (1)의 원재료를 배양하고 여과하거나 칼륨, 칼슘, 나트륨, 마그네슘의 염을 단독 또는 복합으로 충분히 중화시킨 후 결정화하여 식용에 적합하도록 함

(3) 기능성분(또는 지표성분)의 함량 : 폴리감마글루탐산을 700 mg/g이상 함유하고 있어야 함

2) 규격

(1) 성상 : 고유의 색택과 향미를 가지며 이미․이취가 없어야 함

(2) 폴리감마글루탐산

(가) 원료성 제품 : 표시량 이상

(나) 최종제품 : 표시량의 80 ～ 120 %

(3) 중금속

(가) 납(mg/kg) : 1.0 이하

(나) 카드뮴(mg/kg) : 1.0 이하

(다) 총수은(mg/kg) : 0.5 이하

(라) 총비소(mg/kg) : 0.5 이하

(4) 대장균군 : 음성

3) 최종제품의 요건

(1) 기능성 내용 : 체내 칼슘흡수 촉진에 도움을 줄 수 있음

(2) 일일 섭취량

폴리감마글루탐산으로서 60～70 mg

[별표 2] 영양소 기준치

영양소	기준치	영양소	기준치	영양소	기준치
탄수화물(g)	328	철분(㎎)	15	판토텐산(㎎)	5
식이섬유(g)	25	비타민D(㎍)	5	인(㎎)	700
단백질(g)	60	비타민E(㎎α-TE)	10	요오드(㎍)	75
지방(g)	50	비타민K(㎍)	55	마그네슘(㎎)	220
포화지방(g)	15	비타민B1(㎎)	1.0	아연(㎎)	12
콜레스테롤(㎎)	300	비타민B2(㎎)	1.2	셀렌(㎍)	50
나트륨(㎎)	2,000	나이아신(㎎ NE)	13	구리(㎎)	1.5
칼륨(㎎)	3,500	비타민B6(㎎)	1.5	망간(㎎)	2.0
비타민A(㎍ RE)	700	엽산(㎍)	250	크롬(㎍)	50
비타민C(㎎)	100	비타민B12(㎍)	1.0	몰리브덴(㎍)	25
칼슘(㎎)	700	비오틴(㎍)	30

[별표 2] 영양소 기준치

영양소	기준치	영양소	기준치	영양소	기준치
탄수화물(g)	330	철분(㎎)	12	판토텐산(㎎)	5
식이섬유(g)	25	비타민D(㎍)	5	인(㎎)	700
단백질(g)	55	비타민E(㎎α-TE)	11	요오드(㎍)	150
지방(g)	51	비타민K(㎍)	70	마그네슘(㎎)	315
포화지방(g)	15	비타민B1(㎎)	1.2	아연(㎎)	8.5
콜레스테롤(㎎)	300	비타민B2(㎎)	1.4	셀렌(㎍)	55
나트륨(㎎)	2,000	나이아신(㎎ NE)	15	구리(㎎)	0.8
칼륨(㎎)	3,500	비타민B6(㎎)	1.5	망간(㎎)	3.0
비타민A(㎍ RE)	700	엽산(㎍)	400	크롬(㎍)	50
비타민C(㎎)	100	비타민B12(㎍)	2.4	몰리브덴(㎍)	25
칼슘(㎎)	700	비오틴(㎍)	30

[별표 5] 건강기능식품 제조에 사용할 수 없는 원료

1. (생  략)

원료명	비 고
건조갑상선(Dried thyroid)
담즙·담낭(Bile & gall bladder)
맥각(麥角, Ergot)
반묘(斑猫, Blister beetle)	Cantharides, 칸타리스(Cantharis)
사독(蛇毒, Venom)
사람의 태반(Human placenta)
사람의 혈액(Human Blood)
사향(麝香, Musk)	Moschus
섬수(蟾酥, Toad Venom)	Bufonis Venenum, Toad Venom
오공(蜈蚣, Scolopendrae Corpus)	왕지네(Scolopendra subspinipes mutilans Linné Koch)의 충체

2. 동물성 원료

3. (생  략)

[별표 5] 건강기능식품 제조에 사용할 수 없는 원료

1. (현행과 같음)

원료명	비 고
건조갑상선(Dried thyroid)
담즙·담낭(Bile & gall bladder)
맥각(麥角, Ergot)
반묘(斑猫, Blister beetle)	Cantharides, 칸타리스(Cantharis)
사독(蛇毒, Venom)
사람의 태반(Human placenta)
사람의 혈액(Human Blood)
사향(麝香, Musk)	Moschus
섬수(蟾酥, Toad Venom)	Bufonis Venenum, Toad Venom
오공(蜈蚣, Scolopendrae Corpus)	왕지네(Scolopendra subspinipes mutilans Linné Koch)의 충체
뇌하수체
벌독
전립선

2. 동물성 원료

3. (현행과 같음)

제 4. 건강기능식품 시험법

제 4. 건강기능식품 시험법

3-3 비타민 D

1. (생  략)

본 시험법은 시료 중 비타민 D를 에탄올과 피로갈롤에탄올용액을 이용하여 비누화시키고 벤젠용액을 이용하여 추출 후 감압건조시켜 아세토니트릴 : 메탄올(1 : 1)용액으로 녹인 것을 옥타데실실릴화한 칼럼에서 비타민 D를 분리․농축시킨 후 실리카겔 칼럼을 이용하여 비타민 D를 분리하는 방법으로 자외부흡광광도검출기를 이용하여 최대흡수파장인 254 nm에서 분리하여 정량한다.

Ⅲ.3.1.3-1

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.1.1 ～ 2.1.6 (생  략)

2.1.7 여과지(FH Type, pore size 0.5 μm)

2.2 (생  략)

2.2.1 (생  략)

2.2.2  (생  략)

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 7.5 mm, 길이300 mm, 충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.2.4 순상형 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 Silica gel) 또는 이와 동등한 것

<신  설>

<신  설>

<신  설>

2.3 (생  략)

이 시험법에 사용되는 이동상은 2가지가 있다. 하나는 아세토니트릴과 메탄올을 1 : 1비율로 혼합한 용매인데 이것은 비타민 D를 칼럼안에 농축시키기 위해 비타민 D와 섞이지 않는 용매, 즉 분취용 이동상으로 쓰인다. 다른 또 하나의 용매는 0.4% 이소프로판올․헥산용액이다. 이것은 칼럼 안에 농축되어있는 비타민 D와 섞이는 용매, 즉 분석용 이동상으로 쓰인다. 처음에는 일단 칼럼에 농축을 비타민 D를 농축시켜야 하기 때문에 분취용 이동상인 아세토니트릴과 메탄올을 1 : 1비율로 섞은 용매를 분당 2.0 mL씩 흐르게 하여 기기와 칼럼을 안정화시킨다.

3. (생  략)

3.1 (생  략)

3.1.1 Ergocalciferol(Calciferol; Ercalciol; Ergocalciferol; Ergosterol irradiated; Irradiated ergosterol; Vitamin D2)

분자식 : C28H44O, 분자량 : 396.65, CAS No. : 50-14-6

Ⅲ.3.1.3-2

3.1.2 (생  략)

3.2 (생  략)

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 벤젠(Benzene)

3.2.3 아세토니트릴(Acetonitrile)

3.2.4 헥산(n-Hexane)

3.2.5 메탄올(Methanol)

3.2.6 피로갈롤(Pyrogallol)

<신  설>

Ⅲ.3.1.3-3

4. (생  략)

4.1 (생  략)

4.1.1 무알데히드에탄올

에탄올 1 L에 50% 수산화칼륨용액 5 mL 및 아연분말 5 g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%는 버린다.

<신  설>

4.2 (생  략)

4.2.1 비타민 D2 또는 D3를 무알데히드에탄올에 녹인 후 적절하게 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.3 (생  략)

4.3.1 ～ 4.3.2 (생  략)

4.3.3 (생  략)

<신  설>

4.3.4 (생  략)

4.3.5 냉각 후 벤젠 100 mL을 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다. 침전이 생기면 이것이 가라앉을 때까지 방치한다.

4.3.6 250 mL 분액깔대기에 옮기고 1 N 수산화칼륨 100 mL을 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다.

4.3.7 방치하여 층분리를 한후 혼탁한 물층은 버린다.

4.3.8 벤젠층에 0.5 N 수산화칼륨 40 mL을 넣어 진탕 혼합한다.

4.3.9 벤젠층에 적어도 4회 매회 15초씩 물 40 mL로 세척한다. 세척액이 페놀프탈레인시액으로 알칼리반응을 나타내지 않을 때까지 세척한다.

4.3.10 분액깔때기를 수 분간 방치하여 물 한방울까지 분리하여 물층을 제거한다.

4.3.11 벤젠용액 80 mL을 농축플라스크에 취하여 40℃이하에서 용매를 감압농축한다.

4.3.12 잔류물에 벤젠 5 mL을 가하여 녹이고 이 액 4.5 mL을 환저플라스크에 취하여 감압농축한다.

4.3.13 잔류물에 아세토니트릴 : 메탄올(1 : 1)용액 500 μL를 정확하게 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

5. (생  략)

5.1 (생  략)

표 1. 제 1단계(분취용) 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
칼럼온도	35℃
이동상	아세토니트릴 : 메탄올 = (1 : 1)
검출기 파장	254 nm
유량	2.0 mL/분

표 2. 제 2단계(분석용) 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
칼럼온도	35℃
이동상	0.4% 이소프로판올․헥산용액
검출기 파장	254 nm
유량	1.6 mL/분

Ⅲ.3.1.3-4

5.2 (생  략)

3-3 비타민 D

1. (현행과 같음)

----------------------------
------------------------------------------ 헥산으로 추출한 후 -------------------------

----------------------------
--------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

2. (현행과 같음)

2.1 (현행과 같음)

2.1.1 ～ 2.1.6 (현행과 같음)

<삭  제>

2.2 (현행과 같음)

2.2.1 (현행과 같음)

2.2.2 (현행과 같음)

2.2.3 육방전환밸브시스템

2.2.4 칼럼

2.2.4.1 전처리 컬럼 : Capcellpak MF C8 SG80(4.6mm x 150mm, 5um) 또는 이와 동등한 것

2.2.4.2 농축컬럼 : Capcellpak C18 120V(2.0mm x 35mm, 5um) 또는 이와 동등한 것

2.2.4.3 분석컬럼 : Capcellpak C18 UG 120V(4.6mm x 250mm, 5um) 또는 이와 동등한 것

2.3 (현행과 같음)

전처리 컬럼에서 비타민 D의 피크 용출시간을 확인한 후 농축을 위한 육방전환밸브의 조작시간을 설정하여 분석할 수 있도록 한다.

3. (현행과 같음)

3.1 (현행과 같음)

<삭  제>

3.1.1 (현행 3.1.2와 같음)

3.2  (현행과 같음)

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 증류수

3.2.3 수산화칼륨(Potassium hydroxide)

3.2.4 헥산(n-Hexane)

3.2.5 메탄올(Methanol)

3.2.6 피로갈롤(Pyrogallol)

3.2.7 무수황산나트륨(Sodium sulfate anhydride)

4. (현행과 같음)

4.1 (현행과 같음)

4.1.1 이동상 A

메탄올 900 ml에 에탄올 100 mL을 혼합한 용액을 830 mL 취하여 물로 1L가 되도록 조제하고 탈기하여 사용한다(메탄올/에탄올/물: 74.7/8.3/17 (v/v/v)).

4.1.1 이동상 B

메탄올 900 ml에 에탄올 100 mL을 혼합하여 사용한다(메탄올/에탄올 :9/1(v/v)).

4.2  (현행과 같음)

4.2.1 비타민 D3 100mg을 메탄올 100mL에 녹여 조제한다(1,000ug/mL).

4.3 (현행과 같음)

4.3.1 ～ 4.3.2 (현행과 같음)

4.3.3 (현행과 같음)

(고체시료의 경우, 물 3mL로 충분히 녹인 후 혼합)

4.3.4 (현행과 같음)

4.3.5 냉각 후 헥산 50 mL을 가하여 10분간 강하게 진탕 혼합한다. 침전이 생기면 이것이 가라앉을 때까지 방치한다(3회 추출)

4.3.6 헥산층을 250 mL 분액깔대기에 옮겨 1 N 수산화칼륨 100 mL을 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다.

4.3.7 이를 방치하여 층분리 한 후(헥산층은 투명하지 않아도 됨) 혼탁한 물층을 버린다.

4.3.8 헥산층에 0.5 N 수산화칼륨 40 mL을 넣어 진탕 혼합한 후 물층을 다시 버린다.

4.3.9 헥산층에 적어도 4회(매회 15초씩) 물 40 mL로 세척한다. 세척액이 페놀프탈레인시액으로 알칼리반응을 나타내지 않을 때까지 세척한다.

4.3.10 수세한 헥산층을 무수황산나트륨으로 탈수하여 갈색 플라스크로 옮기고 무수황산나트륨을 헥산 10 mL로 2회 세척한 후 탈수한 헥산용매와 합하고 이를 40℃이하에서 감압 농축한다.

4.3.11 잔류물에 메탄올 5 mL를 가한 후 이를 membrane filter로 여과한 후 시험용액으로 한다.

<삭  제>

<삭  제>

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	210 uL
칼럼온도	35℃
이동상	전처리컬럼 : 이동상 A 분석컬럼: 이동상 B
검출기 파장	254 nm
유량	전처리컬럼 : 300 uL/min 분석컬럼 : 500uL/min

<삭  제>

5.2 (현행과 같음)

3-5 비타민 K

<신  설>

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 비타민 K를 비누화 및 추출하여 정제 칼럼을 통해 정제된 용액을 실리카겔을 충진된 칼럼을 이용하여 비타민 K를 분리하는 방법으로 자외부흡광광도검출기를 이용하여 비타민 K의 최대 흡수 파장인 254 nm에서 검출하여 정량한다.

2 ～ 3 (생  략)

4. (생  략)

4.1 (생  략)

4.1.1 ～ 4.1.2 (생  략)

4.1.3 (생  략)

60～200 메쉬 실리카 5.0 g (100℃ 오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 정제 칼럼(1.0 cm id×30 cm, 유리 칼럼)에 충전하고 그 위에 무수황산나트륨 2.0 g(100℃ 오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴)을 가한다.

4.2 (생  략)

4.3 (생  략)

4.3.1 ～ 4.3.3 (생  략)

4.3.4 위의 용액에 메탄올 60 mL을 가하여 혼합 후 디클로로메탄 100 mL과 이소옥탄 50 mL 혼합액을 가하여 잘 흔들어 추출한다.

4.3.5 층 분리 후 하층액을 250 mL증류플라스크에 옮긴다.

4.3.6 [4.3.4]의 과정을 반복하여 하층액을 [4.3.5]의 용액과 합한다.

4.3.7 위의 용액을 75℃이하에서 감압농축한다.

4.3.8 증류플라스크를 아세톤 20 mL로 씻고 다시 농축시킨다.

4.3.9 [4.3.8]의 과정을 3회 반복 후 질소로 충전하여 차광한 채로 밀봉한다.

4.3.10 정제칼럼에 conditioning 용액 20 mL을 주입하고 천천히 용출 시킨다.

4.3.11 위의 잔류물에 conditioning 용액 10 mL로 녹인 후 칼럼에 통화시켜 비타민 K1을 흡착시킨다.

4.3.12 conditioning용매를 5 mL씩 2회에 걸쳐 증류플라스크를 씻어 정제칼럼에 통과시킨다.

4.3.13 시료의 지방 함량에 따라 용출용매를 칼럼에 통과시킨다. 시료의 지방함량이 0.72～0.80 g이면 100 mL의 용매를, 0.72 g 이하이면 예비실험을 통해 용출액의 양을 결정한다.

4.3.14 용출액을 250 mL 증류플라스크에 받아 75℃이하로 감압 농축한다.

4.3.15 농축액을 이소옥탄 1～2 mL로 수 회 나누어 씻어 5 mL로 한다.

<신  설>

5. (생  략)

5.1 (생  략)

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	35℃
이동상	디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 30%, 0.02%가 되게 한다.
검출기 파장	254 nm
유량	0.5 mL/분

5.2 (생  략)

<신  설>

3-5 비타민 K1

3-5-1 비타민 K1(제1법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료에 있는 trans형 비타민K1을 유기용매로 용해하여 추출하고 건고한 추출물을 2차 용매에 녹여 실리카겔 오픈컬럼으로 정제하고 순상컬럼을 이용한 액체크로마토그래피에서  자외부검출기로 정량하는 방법이다

2 ～ 3 (현행과 같음)

4. (현행과 같음)

4.1 (현행과 같음)

4.1.1 ～ 4.1.2 (현행과 같음)

4.1.3 (현행과 같음)

----------------------
----------------------
-정제 칼럼-------------
----------------------------------------------------------------------------------------.

4.2 (현행과 같음)

4.3 (현행과 같음)

4.3.1 ～ 4.3.3 (현행과 같음)

4.3.4 위의 용액에 메탄올 60 mL의 메탄올을 가하고 30초간 혼합한다.

4.3.5 혼합 후 디클로로메탄 100 mL와 이소옥탄 50 mL 혼합액을 가하여 잘 흔들어 추출한다.

4.3.6 층 분리 후 하층액을 250 mL 증류플라스크에 옮긴다.

4.3.7 [4.3.5]의 과정을 반복하여 하층액을 [4.3.6]의 용액과 합한다.

4.3.8 위의 용액을 75℃이하에서 감압 농축한다.

4.3.9 증류플라스크를 아세톤 20 mL로 씻고 다시 농축시킨다.

4.3.10 [4.3.8]의 과정을 3회 반복 후 질소로 충전하여 차광한 채로 밀봉한다.

4.3.11 정제칼럼에 conditioning 용액 20 mL을 주입하고 천천히 용출 시킨 후 그 액을 버린다.

4.3.12 위의 잔류물에 conditioning 용액 10 mL로 녹인 후 칼럼에 통과시켜 비타민 K1을 흡착시킨다.

4.3.13 Conditioning용매를 5 mL씩 2회에 걸쳐 증류플라스크를 씻어 정제칼럼에 통과시킨다.

4.3.14 시료의 지방 함량에 따라 용출용매를 칼럼에 통과시킨다. 시료의 지방함량이 0.72～0.80 g이면 100 mL의 용매를, 0.72 g 이하이면 예비실험을 통해 용출액의 양을 결정한다.

4.3.15 용출액을 250 mL 증류플라스크에 받아 75℃이하로 감압 농축한다.

4.3.16 농축액을 이소옥탄 1～2 mL로 수 회 나누어 씻어 5 mL로 정용한다.

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	35℃
이동상	이동상
검출기 파장	254 nm
유량	0.5 mL/분

5.2 (현행과 같음)

3-5-2 비타민 K1(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 지방을 효소적으로 분해하여 지방산으로 침전시킨 후 헥산으로 비타민 K1을 추출하여 역상컬럼으로 분리하고 포스트 컬럼으로 환원시켜 형광을 이용하여 정량하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 증류플라스크(250 mL)

2.1.5 분액깔대기(500 mL)

2.1.7 감압농축기

2.1.8 정제칼럼(1.0 cm id×30 cm, 유리 칼럼)

2.1.9 시험관(200×24 mm ID)

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 형광검출기(Fluorescence Detector, FLD)

2.2.3 컬럼

2.2.3.1 분석컬럼 : 옥타데실실릴화한 칼럼으로 carbon loading량이 10% 이상인 것(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 Silica gel) 또는 이와 동등한 것

2.2.3.2 포스트 컬럼 : 안지름 4.0mm, 길이 20mm 또는 이와 동등한 것 혹은 내경 2.0～4.0mm 및 길이 30～50mm의 액체크로마토그래피 컬럼관에 아연분말을 채워 제작한 것으로 분석컬럼과 형광검출기 사이에 장착한다.

※ 포스트 컬럼 제작 시 빈 공간이 생기지 않도록 주의하여 아연분말을 채우고 장착하기 전 30분간 이동상을 약 1 mL/min의 유속으로 흘려 평형이 이루어지는지 확인하고 장착 후 30~60분 이상 시스템을 안정화하여 분석한다.

2.3 분석장비의 준비

이동상 용매를 분당 0.8 mL씩 흘려줌으로써 기기와 칼럼을 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 Vitamin K1(2-Methyl-3-phytyl
-1,4-naphthoquinone; 3-Phytyl
menadione; Phylloquinone; Vitamin K1(20))

분자식 : C31H46O2, 분자량 : 450.70, CAS No. : 84-80-0

3.2 일반시약

3.2.1 증류수(Distilled water)

3.2.2 리파아제(Lipase)

3.2.3 수산화칼륨(Potassium hydroxide)

3.2.4 인산이수소칼륨(Potassium dihydrogen
phosphate)

3.2.5 에탄올(Ethanol)

3.2.6 메탄올(Methanol)

3.2.7 헥산(Hexane)

3.2.8 디클로로메탄(Dichloromethane)

3.2.9 이소프로판올(Isopropanol)

3.2.10 염화아연(Zinc chloride)

3.2.11 무수초산나트륨(Sodium acetate)

3.2.12 무수탄산칼륨(Potassium carbonate)

3.2.13 초산(Acetic acid)

3.2.14 아연분말(Zinc powder)

4. 시험과정

4.1 시약 제조

4.1.1 증류수

3차증류수로 18 MΩ 이상인 것

4.1.2 Lipase

Candida rugosa를 기원으로 하는 것으로써 약 1,000unit/mg(Type VII)의 활성이 있는 것 또는 동등한 효소 활성을 가진 것으로써 Pseudomonas와 Rhizopus를 기원으로 하는 것

4.1.3 40% 수산화칼륨용액

40 g KOH를 증류수로 녹여 100 mL로 하여 조제한다.

4.1.4 0.8 M 인산완충용액

54.0 g KH2PO4를 물 350 mL에 녹여 40% 수산화칼륨용액으로 pH를 7.9~8.0으로 조정하여 증류수로 희석하여 500 mL로 하여 조제한다.

4.1.5 알콜혼합용매

에탄올과 메탄올을 95:5의 부피비로 혼합하여 조제한다.

4.1.6 아연분말

입자 60um 이하인 것 또는 이와 동등한 것으로 개봉 후 즉시 사용한다.

4.1.7 이동상 A용매

메탄올 900 mL에 디클로메탄 100 mL을 혼합한 용매에 염화아연 1.37 g과 무수초산나트륨 0.41 g 및 초산 0.30 g을 메탄올 5 mL에 녹여 첨가하고 0.45 um 여지로 여과하고 탈기하여 조제한다.

4.2 표준용액 제조

4.2.1 비타민 K1 표준물질 100 mg을 100 mL 이소프로판올에 녹인 후 표준원액으로 한다.

4.2.2 위의 용액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

4.3 시험용액 제조

※ 시험용액 조제시 직접적인 태양광에 노출되지 않도록 실험을 진행한다.

4.3.1 고체 시료는 약 1.0 g, 액체시료는 약 10.0 g을 시험관에 정밀하게 취한다.

4.3.2 40℃ 이하의 증류수 15 mL을 가한 후 혼합한다.

(액체시료의 경우 미지근한 물  5 mL를 첨가한다.)

4.3.3 인산완충용액 5.0 mL을 첨가하여 혼합한다.

4.3.4 위의 용액에 1.0 g의 lipase 분말을 넣고 혼합한다.

4.3.5 시험관 마개를 막고 고르게 균질화 될 수 있도록 30~60초간 진탕한다.

4.3.6 위의 용액을 37±2℃에서 20분 간격으로 15초간 진탕하며 총 2시간 분해한다.

4.3.7 분해 후 수욕상에서 냉각한다.

4.3.8 위의 용액에 10 mL 알콜혼합용액을 가한 후 혼합한다.

4.3.9 위의 용액에 1.0 g의 무수탄산칼륨을 첨가하여 혼합한다.

4.3.10 분해가 완료된 시험관에 30 mL 헥산을 첨가하여 마개를 막고 10분간 격렬히 진탕한다(냉암소에 보관하여 층이 분리되도록 하며, 층분리가 잘 되지 않을 때에는 약 1,000 rpm(200 g)로 10분간 원심분리 함).

4.3.11 헥산 상층액을 시료의 특성에 따라 1.0～5.0 mL 취하여 바이얄로 옮기고 질소 농축한다.

4.3.12 농축 후 메탄올 1 mL으로 용해하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	30℃
이동상	이동상
검출기 파장	여기파장 243 nm, 측정파장 430 nm
유량	0.8 mL/분

5.2 계산

5.2.1 비타민 K1 함량(μg/100g)＝C × [eqn: rm {30} over {V} TIMES {1} over {S} TIMES {100} over {1000}]

C : 시험용액의 농도(μg/L)

V : 시표특성에 따라 취한 헥산의
부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

3-11-2 엽산(제2법)

1. (생  략)

본 시험법은 이동상으로 시료 중 엽산을 충분히 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 280 nm에서 정량 분석한다.

2. (생  략)

3. (생  략)

3.1. (생  략)

3.2. (생  략)

3.2.1 수산화나트륨(Sodium chloride)

3.2.2 증류수(Distilled water)

3.2.3 헥산설폰산나트륨(Sodium hexane
sulfonate)

3.2.4 초산(Acetic acid)

3.2.5 메탄올(Methanol)

4. (생  략)

4.1 (생  략)

4.1.1 0.1 N 수산화나트륨 용액(Sodium
hydroxide)

1 N 수산화나트륨액을 취하여 증류수로 10배 용량으로 희석하여 사용하거나 수산화나트륨 4.5 g을 취하여 일정량의 증류수에 녹이고 1 L 부피플라스크에 옮겨 담은 후 증류수를 표선까지 채운 다음 표정하여 사용한다.

4.1.2 5 mM Sodium hexanesulfonate / 0.1% 초산 용액

Sodium hexanesulfonate 911.1 mg을 증류수 500 mL에 녹이고 초산 1 mL를 첨가한 후 증류수에 녹여 1 L가 되게 한다.

4.2 (생  략)

4.2.1 엽산 표준물질을 0.1 N 수산화나트륨 용액에 녹여 1000 mg/L가 되도록 조제한다.

4.2.2 표준원액을 증류수로 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.3 (생  략)

4.3.1 (생  략)

4.3.2 위의 시료를 50 mL 부피플라스크에 넣고 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액을 넣는다.

4.3.3 (생  략)

4.3.4 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3.5 (생  략)

5 (생  략)

5.1 (생  략)

표.1 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40 ℃
이동상	A : 5 mM sodium hexanesulfonate /0.1% 초산 용액 B : 5 mM sodium hexanesulfonate /0.1% 초산 용액 : 메탄올(35:65)
검출기파장	280 nm
유속	1.0 mL/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간(분)	A용액(%)	B용액(%)
0	70	30
5	70	30
15	60	40

5.2 (생  략)

3-11-2 엽산(제2법)

1. (현행과 같음)

본 시험법은 10 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 추출하고 역상 분배형 컬럼을 이용하여 액체크로마토그래프에서 분리하고 UV 280nm에서 측정한다.

2. (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

3.1. (현행과 같음)

3.2. (현행과 같음)

3.2.1 인산수소이나트륨(Disodium hydrogen phosphate)

3.2.2 증류수(Distilled water)

3.2.3 인산이수소나트륨(Sodium dihydrogen phosphate)

3.2.4 아세토니트릴(Acetonitrile)

3.2.5 테트라부틸암모늄 브로마이드
(Tetrabutylammonium bromide)

4. (현행과 같음)

4.1 (현행과 같음)

4.1.1 10 mM 인산완충용액(pH 8.0)

10 mM 인산수소이나트륨 용액에 10mM 인산이수소나트륨 용액을 가하여 pH 8.0로 조정하여 제조한다.

4.1.2 이동상 A

Tetrabutylammonium bromide  1.6120 g (5 mM)을 pH 7.2로 조정한 인산완충용액을 가하여 1 L가 되게 한 뒤 0.22μm필터로 여과하여 조제한다.

4.2 (현행과 같음)

4.2.1 엽산 표준품(99.9%)를 0.1 N NaOH 수용액에 녹여 1000 mg/L가 되도록 조제한다.

4.2.2 표준원액을 이동상 A로 희석하여 10 mg/L로 조제한다.(사용 시 제조)

4.3 (현행과 같음)

4.3.1 (현행과 같음)

4.3.2 위의 시료를 50 mL 갈색 부피플라스크에 넣고 10 mM 인산완충용액(pH 8.0)을 넣는다.

4.3.3 (현행과 같음)

4.3.4 10 mM 인산완충용액(pH 8.0)을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3.5 (현행과 같음)

5 (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	40 ℃
이동상	이동상 A:아세토니트릴 = 8:2
검출기파장	280 nm
유속	1.0 mL/분

< 삭  제 >

5.2 (현행과 같음)

3-45 루테인

1. (생  략)

본 시험법은 용매혼합용액으로 추출하고 에탄올로 희석한 용액을 자외분광광도계 446 nm에서 총 카로티노이드 함량을 구하고 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 446 nm에서 검출하여 정량분석 한다.

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인필터 및 디스크형 멤브레인필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 부피플라스크(100 mL)

2.1.5 질소농축기

2.1.6 질소가스

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

2.2 (생  략)

2.2.1 ～ 2.2.3 (생  략)

2.2.4 silica 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진제 silica gel) 또는 이와 동등한 것

2.2.5 (생  략)

2.3 (생  략)

Ⅲ.3.5.14-1

이동상은 헥산과 에틸아세테이트를 70:30으로 혼합한 용액을 분당 1 mL씩 충분한 시간동안 흘려서 안정화 시킨다.

3. (생  략)

3.1 (생  략)

3.2 (생  략)

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 헥산(Hexane)

3.2.3 아세톤(Acetone)

3.2.4 톨루엔(Ethanol)

3.2.5 에틸아세테이트(Ethyl Acetate)

4. (생  략)

4.1 용매혼합용액 제조

4.1.1 헥산 1000 mL, 에탄올 600 mL, 아세톤 700 mL, 톨루엔 700 mL을 2000 mL 부피플라스크에 담아 흔들어 섞는다.

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료(루테인으로서) 80～120 mg을 100 mL 부피플라스크에 담는다.

4.2.2 용매혼합용액(헥산:에탄올: 아세톤:톨루엔 10:6:7:7)을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.2.3 위 시료혼합액 중 1 mL을 취하여 100 mL 부피플라스크에 담고 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3 정량시험

4.3.1 에탄올을 대조액으로 하여 4.2.3 용액을 자외분광광도계 446 nm에서 흡광도를 측정한다.

Ⅲ.3.5.14-2

4.3.2 4.2.3용액 1 mL을 취한 후 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨 후 이동상 2 mL을 넣어 충분히 용해시킨 것을 액체크로마토그래프로 측정한다.

5. (생  략)

5.1 (생  략)

5.2 계산

5.2.1 총카로티노이드 함량(%)
=(A×10,000) /(B×2,550)

A : 446 nm에서 측정된 흡광도시료의 농도(μg/mL)

B : 시료의 채취량(g)

2,550 : 에탄올 분산 제형에서 루테인의 계수(1%, 1cm)

10,000 : 희석배수

Ⅲ.3.5.14-3

5.2.2 (생  략)

3-45 루테인

1. (현행과 같음)

----------증류수로 분산시킨 루테인 원료를 에틸아세테이트로 ---
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

2. (현행과 같음)

2.1 (현행과 같음)

2.1.1 원심분리관(PP, 50 mL)

2.1.2 용량 피펫(30 mL)

2.1.3 부피플라스크(갈색, 50 mL)

2.1.4 피펫(1000 μL, 250 μL)

2.1.5 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.6 부피플라스크(100 mL)

2.1.7 질소농축기

2.1.8 질소가스

2.1.9 초음파 추출기

2.1.10 Quartz cuvette(3 mL, 1 cm)

2.1.11 원심분리기

2.2 (현행과 같음)

2.2.1 ～ 2.2.3 (현행과 같음)

2.2.4 ------------------------
---- 충진제 silica gel, 5 μm) ---------------------.

2.2.5 (현행과 같음)

2.3 (현행과 같음)

---------------------------
--------------------1.5 ----
---------------------------------------------.

3. (현행과 같음)

3.1 (현행과 같음)

3.2 (현행과 같음)

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 헥산(Hexane)

3.2.3 염화나트륨(Sodium chloride)

3.2.4 증류수(Water)

3.2.5 에틸아세테이트(Ethyl acetate)

4. 시험과정

4.1 추출용액 제조

4.1.1 아래와 같이 시료를 정밀하게 칭량하여 원심분리관에 옮겨담는다.

※ 루테인 원료 : Lutein 5%, Lutein 10% : 약 30 mg, Lutein 15% : 약 15 mg, 루테인 제품 : 약 70 mg

4.1.2 준비된 원심분리관에 증류수 15 mL을 첨가한다.

4.1.3 30분간 초음파 처리하여 시료를 완전히 분산시킨다.

4.1.4 30 mL 에틸아세테이트를 정용피펫으로 첨가한다.

4.1.5 원심분리관에 염화나트륨 약 3 g을 넣고 마개를 한 후, 진탕하여 추출한다.

4.1.6 2,000rpm으로 5분간 원심분리한다.

4.1.7 이때 상층액은 주황색임을 확인하고 하층액이 엷은 노랑색 혹은 무색이 되어야 한다. 필요 시 진탕과 원심분리를 다시 반복한다.

4.2 자외분광광도계(UV/Visible Spectro
photometer) 분석

4.2.1 추출용액 중 상층액 1 mL을 취하여 25 mL 에탄올이 채워진 50 mL 정용플라스크에 취하고 이에 에탄올을 가하여 표선까지 채워 희석한다.

4.2.2 이를 20초간 진탕하여 혼합하고 에탄올을 대조액으로 하여 446 nm에서 그 흡광도를 자외분광광도계로 측정한다.

4.3 액체크로마토그래피 분석

4.3.1 4.1.7의 상층액 250 μL을 갈색 HPLC 바이알에 옮겨 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨 후 이동상 1 mL을 넣고 마개를 한 후 30초간 초음파로 진탕하여 녹인 후 이를 액체크로마토그래피로 분석한다.

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

5.2 계산

5.2.1 총 카로티노이드 함량(%)
=(A×Vd×Ve×100) /(α×Va×1×m)

A : 446 nm에서 측정한 흡광도

Vd : 희석용매의 부피(mL) ; 50 mL

Ve : 추출용매의 부피(mL) ; 30 mL

α : 흡광도 계수( 255 mL/mg․cm)

※ 1% 루테인 에탄올 용액(10 mg/mL)의 흡광도 : 2550

1 : Quartz cuvette의 규격(1 cm)

Va : 희석 시 사용한 추출용매의 부피(mL) ; 1 mL

m : 검체량(mg)

5.2.2 (현행과 같음)

3-67. 깅콜릭산(Ginkgolic acid)

1. 시험방법의 요약
본 시험법은 시료 중 깅콜릭산(깅콜릭산 C15:1, C17:1의 합)을 50% 에탄올과 클로로포름을 이용하여 2회 추출 후 클로로포름 층을 감압 농축한 것을 액체크로마토그래피/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 210 nm에서 정량분석한다.

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.2 (생  략)

2.2.1 ～ 2.2.2 (생  략)

2.2.3 YMC C18 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

3 (생  략)

4 (생  략)

5 (생  략)

5.1 (생  략)

5.2 (생  략)

5.2.1 (생  략)

5.2.2 Ginkgolic acid C13:0의 표준품을 이용한 RRT(relative retention time, 상대머무름시간)을 확인 하여 ginkgolic acid C15:1, C17:1의 함량을 계산한다.

깅콜릭산 (ginkgolic acid C15:1, C17:1) 함량(mg/kg)
=	A × B × C
	D × 100

A : 시험용액 농도 (μg/mL)

B : 용액량 (mL)

C : 표준품 순도 (%)

D : 시료채취량 (g)

3-67. 깅콜릭산(Ginkgolic acid)

1. 시험방법의 요약
------------------------(깅콜릭산 C13:1, C15:1, C17:1의 합)---
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

2. (현행과 같음)

2.1 (현행과 같음)

2.2 (현행과 같음)

2.2.1 ～ 2.2.2 (현행과 같음)

2.2.3 스위칭밸브

2.2.4 C8 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진입자크기 5 μm, 전처리 컬럼) 또는 이와 동등한 것

2.2.5 C18 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진입자크기 5 μm, 분석컬럼) 또는 이와 동등한 것

3 (현행과 같음)

4 (현행과 같음)

5 (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

5.2 (현행과 같음)

5.2.1 (현행과 같음)

5.2.2 Ginkgolic acid C13:0의 경우 표준품 C15:1의 표준품을 이용한 RRT(relative retention time, 상대머무름시간)을 확인 하여 함량을 계산한다.

깅콜릭산 (Ginkgolic acid C13:1, C15:1, C17:1) 함량(mg/kg)
=	A × B × C
	D × 100

A : 시험용액 농도 (μg/mL)

B : 용액량 (mL)

C : 표준품 순도 (%)

D : 시료채취량 (g)

3-68 실리마린(Silymarin)

1 ～ 4. (생  략)

5. (생  략)

5.1 (생  략)

5.2 계산

5.2.1 각 표준용액으로 실리크리스틴, 실리디아닌, 실리빈A, 실리빈B, 이소실리빈A, 이소실리빈 B의 위치를 확인한다.

5.2.2 실리빈 A, 실리빈 B의 피크면적으로 검량선을 작성하고, 검량선 식을 이용하여 시험용액 중의 실리빈A, 실리빈B 농도를 구한다. 아래의 식을 이용하여 실리마린 함량을 계산한다.

실리마린 함량 mg/g =	A × B × P
	S

A = 시험용액 중의 실리마린의 농도 (ug/mL)

[실리빈 A, 실리빈 B 농도의 합]
B = 시험용액의 전량  (mL)
P = 표준물질의 순도
S = 시료채취량 (mg)

3-68 실리마린(Silymarin)

1 ～ 4. (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

5.2 계산

5.2.1 실리마린의 6종(실리크리스틴, 실리디아닌, 실리빈 A, 실리빈 B, 이소실리빈 A, 이소실리빈 B)의 검량선을 작성한 후 시료 중의 실리마린의 농도를 계산하여 아래 식을 이용하여 실리마린 함량을 계산한다.

실리마린 함량 mg/g =	A × B × P
	S

A = 시험용액 중의 실리크리스틴, 실리디아닌, 실리빈(실리빈A와 실리빈B), 이소실리빈(이소실리빈A와 이소실리빈B)의 농도의 합(μg/mL)

B = 시험용액의 전량 (mL)

P = 표준물질의 순도

S = 시료채취량 (mg)

3-72 디메틸설폰(MSM)

1 ～ 2. (생  략)

3. (생  략)

3.1～3.2 (생  략)

3.3 (생  략)

3.2.1 (생  략)

4. (생  략)

4.1 (생  략)

4.2 (생  략)

4.2.1 (생  략)

4.2.2 위의 표준원액을 적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2 (생  략)

4.2.1 (생  략)

4.2.2 (생  략)

4.2.3 (생  략)

4.2.4 (생  략)

5. (생  략)

5.1 (생  략)

5.2 (생  략)

5.2.1 디메틸설폰 표준용액의 피크면적으로 검량선을 작성하고, 검량선 식을 이용하여 시험용액 중의 디메틸설폰 농도를 구한 후 아래 식을 이용하여 디메틸설폰 함량을 계산한다.

MSM 함량(mg/g) =	A × B × C
	D

A : 시험용액중의 디메틸설폰의
농도(mg/mL)
B : 시험용액의 전량(mL)
C : 희석배수
D : 시료 채취량(g)

3-72 디메틸설폰(MSM)

1 ～ 2. (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

3.1～3.2 (현행과 같음)

3.3 (현행과 같음)

3.3.1 (현행 3.2.1과 같음)

4. (현행과 같음)

4.1 (현행과 같음)

4.2 (현행과 같음)

4.2.1 (현행과 같음)

4.2.2 위의 표준원액을 100 mL 부피플라스크에 적절히 취하고 내부표준용액 1.0 mL씩 가한 후 메탄올로 표선까지 맞춘 것을 표준용액으로 사용한다.

4.3 (현행 4.2와 같음)

4.3.1 (현행 4.2.1과 같음)

4.3.2 (현행 4.2.2와 같음)

4.3.3 (현행 4.2.3과 같음)

4.3.4 (현행 4.2.4와 같음)

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

5.2 (현행과 같음)

MSM 함량(mg/g) = STc × (SA/ST) × (STis/SAis) × V/S
STc : 시험용액중의 디메틸설폰의 농도(mg/mL)
SA : 시험용액내 표준물질의 피크면적
ST : 표준물질의 피크면적
STis : 표준물질용액내 내부표준물질 피크면적
SAis : 시험용액내 내부표준물질 피크면적
V : 최종희석용액(mL)
S : 시료 채취량(g)

신․구조문대비표