식품의약품안전청 공고 제2012-58호

식품의 기준 및 규격 일부개정고시안

행정예고

2012. 3. 30.

식품의약품안전청

식품의약품안전청 공고 제2012-58호

「식품의 기준 및 규격」을 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 수렴하고자 그 취지, 개정 이유 및 주요 내용을 「행정절차법」 제46조에 따라 다음과 같이 공고합니다.

2012년 3월 30일

식품의약품안전청장

식품의 기준 및 규격 일부개정고시안 행정예고

1. 개정 이유

현재 방사선 조사처리기술로 통칭되는 식품조사(Food Irradiation) 처리기술에 사용하는 선종을 유럽 등 외국에서 사용하고 있는 전자선 조사처리 방식도 포함하도록 확대하고, 식품조사기술을 위생적으로 취급·보관된 식품에 한하여 살균, 살충, 발아억제 또는 숙도조절용으로만 사용할 수 있도록 하며, 기타 용도로의 사용을 제한하는 내용으로 식품조사처리기준을 명확히 하면서 국제적인 사용현황과의 조화를 추진하고자 함.

또한 식품조사처리기술이 병원성 미생물의 살균 등의 유용한 용도로 제한된 조건과 범위 내에서 사용하고 있는 점 등을 감안하여 선종(감마선(60Co), 전자선)과 사용목적(살균, 살충 등)이나 처리방식(조사)을 함께 병기하여 세부적으로 구분하여 방사선 조사, 방사선 살균, 감마선 조사, 감마선 살균, 전자선 조사, 전자선 살균, 방사선 살충, 전자선 살충 등으로 명시할 수 있도록 하며, 제조원료용 또는 2차 살균용 등으로 한정하였던 곡류, 두류, 전분, 환자식 등의 품목별 식품조사 용도 제한을 삭제하고자 함.

또한 곰팡이독소 기준 적용 대상식품을 명확하게 하고 식중독균 기준을 개정하며 일반시험법을 개선하여 국민에게 안전한 식품을 공급하고자 함

2. 주요 내용

가. 방사선 조사기준 개정[안 제 2, 5, 6)]

1) 식품조사처리기준의 명확화 및 이용되는 선종의 국제적인 조화 추진

2) 식품조사 선종 확대 및 품목별 조사 용도제한 삭제

가) 식품조사처리에 사용할 수 있는 선종에 전자선을 추가하고 방사선 조사기준을 “식품조사처리 기준”으로 개정함

나) 위생적으로 취급·보관된 식품에 한하여 살균, 살충, 발아억제, 숙도조절용도로만 식품조사처리를 할 수 있도록 하고, 정해진 용도이외의 식품조사처리를 제한함

다) 식품조사 처리기술의 명칭을 사용하는 선종과 사용목적이나 처리방식을 함께 병기하여 세부적으로 구분할 수 있도록 함

라) 전자선을 이용한 식품조사 처리시 전자선 가속기를 10 Mev 이하로 사용하여 조사처리 하도록 하고, 품목별 흡수선량을 초과하지 않도록 규정함

마) 곡류, 두류, 전분, 환자식 등에 적용했던 품목별 식품조사 용도제한 규정을 삭제함

바) 국가표준기본법 시행령 규정에 따라 흡수선량의 단위를 KGy에서 kGy로 변경함

3) 식품 조사처리에 사용하는 선종을 확대하여 산업 활성화 및 국제기준과의 조화

나. 곰팡이독소 기준 적용 대상 식품 개정[안 제 2, 5, 8), 제 5, 20, 5)]

1) 동일한 규격이 구분되어 있어 불필요한 혼동 발생

2) 메주의 식품별 기준 및 규격 중 아플라톡신 기준을 삭제하고 식품일반에 대한 기준 및 규격 중 아플라톡신 기준 개정

3) 동일한 규격을 통합하여 기준 적용에 대한 이해도 향상

다. 식품 중 식품첨가물기준을 「식품첨가물의 기준 및 규격」과  일치 [안 제 5, 20, 5) 및 제 5, 24, 5)]

1) 식품 중 식품첨가물 규격이 「식품첨가물의 기준 및 규격」과 맞지 않은 오류 개선

2) 장류의 소르빈산 규격 및 젓갈류의 타르색소 규격을 해당 식품첨가물의 사용기준으로 개정

3) 식품 중 식품첨가물 규격을 「식품첨가물의 기준 및 규격」과 통일

라. 식품 중 식중독균 기준 개정[안 제 5, 29-18, 5), (5), 제 6, 1, 1), (4), 제 8, 4, (5)]

1) 여름철 발생하는 어패류에 의한 식중독의 원인인 장염비브리오균은 인체 위해성 및 식품의 식중독 발생균량 등을 고려한 안전관리 기준 필요

2) 장염비브리오균의 규격을 일부 식품류에서 g당 100 이하로 완화

3) 인체 위해성을 고려한 합리적인 규격 운영

마. 일반시험법 개정 및 삭제

1) 일반성분 시험법 개정[안 제 10, 1.1.4]

당질 및 식이섬유 시험법 개정

2) 아황산, 차아황산 그 염류 시험법 개정 [안 제 10, 2.5.2]

3) 미생물시험법 개정 [안 제 10, 3.4～3.5, 제 10, 3.7 ～ 3.9, 제 10, 3.13～ 3.14]

미생물 배지 및 장염비브리오균 정량시험법 신설, 세균수, 대장균군, 대장균, 유산균 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 시험법 개정,

4) 곰팡이독소 시험법 개정[안 제 10, 6.1.2]

5) 중금속 시험법 개정[안 제 10, 7.1.2]

비소 시험법의 건식회화법 삭제

6) 방사능 시험법 개정[안 제 7.2 ]

7) 금속성이물 시험법 개정[안 제10, 9, 9.2, 9.2.1]

소금의 정상성분인 무기화합물이 금속성이물(쇳가루)로 오인되는 것을 방지하고자 금속성이물(쇳가루) 시험법 개정

바. 대마의 사용부위 명확화[안 [별표 1]]

1) 대마의 껍질을 구체적으로 명시하지 않아 원료 사용의 혼동 발생

2) 대마의 사용부위인 ‘껍질이 완전히 제외된 씨앗’에서 껍질의 정의를 포엽과 종피로 구분

3) 사용부위의 명확화로 국민에게 안전한 식품 공급

사. 원재료 명칭의 중복 또는 오기 수정 [안 [별표 1], [별표 3]]

1) [별표 1] “식품에 사용할 수 있는 원료”의 목록에서 속단 삭제

2) [별표 3] “식품에 사용할 수 없는 원료”의 목록에서 담즙, 담낭을 쓸개(쓸개즙)로 수정하고 멧돼지쓸개 삭제

3) 곰부차의 부위 항목 삭제

3. 의견 제출

「식품의 기준 및 규격」 일부개정고시(안)에 대하여 의견이 있는  단체 또는 개인은 2012년 5월 30일까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전청장(우편번호 : 363-700, 주소 : 충청북도 청원군 오송읍 오송생명로2로 187(연제리 643번지) 오송보건의료행정타운 식품의약품안전청, 참조 : 식품기준과, 전화 043-719-2426, 팩스 043-719-2400)에게 제출하여 주시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 항목별 의견(찬․반 여부와 그 이유)

나. 성명(단체의 경우 단체명과 그 대표자의 성명), 주소 및 전화번호

다. 기타 참고사항

식품의약품안전청 고시 제2012-   호

「식품위생법」 제7조제1항에 따른 「식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전청 고시 제2012-1호, 2012. 1. 20)을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2012년   월   일

식품의약품안전청장

식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안) 행정예고

식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제 2, 1, 4), 제 2, 2, 1), (4), 제 5, 11, 2), (1), 제 5, 19-1, 1), 제 5, 19-2, 1) 중 “축산물가공처리법”을 “축산물위생관리법”으로 한다.

제 2, 5, 5), (3) 중 “농산물 중 중금속 기준”을 “농산물의 중금속 기준”으로 한다.

제 2, 5, 5), (5) 중 “축산물 중 중금속 허용기준”을 “축산물의 중금속 기준”으로 한다.

제 2, 5, 6)을 다음과 같이 한다.

6) 식품조사처리기준

식품조사(Food Irradiation)처리 기술이란 감마선, 전자선에서 방출되는 에너지를 복사(radiation)의 방식으로 식품에 조사하여 식품 등의 발아억제, 살균, 살충 또는 숙도조절에 사용하는 기술로, 선종과 사용목적 또는 처리방식(조사)에 따라 감마선 살균, 전자선 살균, 감마선 살충, 전자선 살충, 감마선 조사, 전자선 조사 등으로 구분하거나, 통칭하여 방사선 살균, 방사선 살충, 방사선 조사 등으로 구분할 수 있다.

(1) 식품조사처리에 사용할 수 있는 선종은 감마선 또는 전자선으로 한다.

(2) 감마선을 방출하는 선원으로는 60Co을 사용할 수 있고, 전자선을 방출하는 선원으로는 전자선 가속기를 사용할 수 있다.

(3) 60Co에서 방출되는 감마선 에너지를 사용할 경우 식품조사처리가 허용된 품목별 흡수선량을 초과하지 않도록 하여야 한다.

(4) 전자선 가속기를 사용하여 식품조사처리를 할 경우 방출되는 에너지량을 10 MeV이하로 조사처리 하여야 하며, 식품조사처리가 허용된 품목별 흡수선량을 초과하지 않도록 하여야 한다.

(5) 식품조사처리는 승인된 원료나 품목 등에 한하여 위생적으로 취급·보관된 경우에만 실시할 수 있으며, 발아억제, 살균, 살충 또는 숙도조절 이외의 목적으로는 식품조사처리기술을 사용하여서는 아니 된다.

(6) 조사처리된 식품은 다음의 기준에 적합하여야 한다.

① 허용대상 식품별 흡수선량

품 목	조사목적	선량(kGy)
감자, 양파, 마늘	발아억제	0.15 이하
밤	살충․발아억제	0.25 이하
생버섯 및 건조버섯	살충․숙도조절	1 이하
난분 곡류, 두류 및 그 분말 전분	살균 살균․살충 살균	5 이하 5 이하 5 이하
건조식육 및 어패류 분말 된장, 고추장, 간장분말 건조채소류 효모ㆍ효소식품 조류식품 알로에 분말 인삼(홍삼 포함) 제품류	살균 살균 살균 살균 살균 살균 살균	7 이하 7 이하 7 이하 7 이하 7 이하 7 이하 7 이하
건조향신료 및 이들 조제품 복합조미식품 소스류 침출차 분말차 환자식	살균 살균 살균 살균 살균 살균	10 이하 10 이하 10 이하 10 이하 10 이하 10 이하

(7) 한번 조사한 식품은 다시 조사하여서는 아니되며 조사식품을 원료로 사용하여 제조․가공한 식품도 다시 조사하여서는 아니 된다.

(8) 조사식품은 용기에 넣거나 또는 포장한 후 판매하여야 한다.

제 2, 5, 8), (1) 중 “장류(메주 제외)”를 “장류”로 한다.

제 5, 20, 5), (3)과 제 5, 20, 6), (3)을 삭제하고 제 5, 20, 5) 및 6)의 “(4) 대장균군” 및 “(5) 보존료”를 “(3) 대장균군” 및 “(4) 보존료”로 한다.

제 5, 20, 5), (4)를 다음과 같이 한다.

(4) 보존료(g/kg 다만, 간장은 g/L) : 다음에서 정하는 것 이외의 보존료가 검출되어서는 아니 된다.

소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	1.0 이하(소르빈산으로서, 한식된장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장(비건조 제품에 한함), 혼합장에 한한다)
안식향산 안식향산나트륨 안식향산칼륨 안식향산칼슘	0.6 이하(간장에 한한다. 파라옥시안식향산에틸 및 파라옥시안식향산메틸과 병용할 때에는 안식향산으로서 사용량과 파라옥시안식향산으로서 사용량의 합계가 0.6g/kg 이하이어야 하며, 그 중 파라옥시안식향산으로서의 사용량은 0.25g/kg 이하)
파라옥시안식향산메틸 파라옥시안식향산에틸	0.25 이하(간장에 한한다. 안식향산, 안식향산나트륨, 안식향산칼륨 및 안식향산칼슘과 병용할 때에는 파라옥시안식향산으로서 사용량과 안식향산으로서 사용량의 합계가 0.6g/kg 이하이어야 하며, 그 중 파라옥시안식향산으로서의 사용량은 0.25g/kg이하)

제 5, 24, 5), (3)을 다음과 같이 한다.

(3) 타르색소 : 검출되어서는 아니 된다.(다만, 명란젓은 제외한다.)

제5, 29-18, 5), (5)을 다음과 같이 한다.

(5) 장염비브리오균 : g당 100이하(즉석섭취식품, 신선편의식품 중 해산물 함유 제품에 한한다).

제6, 1, 1), (4)를 다음과 같이 한다.

더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 수산물에서는 살모넬라(Salmonella spp.), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)가 음성, 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 1 g당 100 이하이어야 한다.

제8, 4, 가), (5)를 다음과 같이 한다.

(5) 식중독균

식품접객업소(집단급식소 포함)에서 조리된 식품은 살모넬라(Salmonella spp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 캠필로박터 제주니(Camplyobacter jejuni), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 등 식중독균이 검출되어서는 아니되며, 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) g당 100 이하, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) g당 10,000 이하이어야 한다. 다만, 조리과정 중 가열처리를 하지 않거나 가열 후 조리한 식품의 경우 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 g당 100 이하이어야 한다.

제10, 1.1.4.1.4 기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량을 다음과 같이 한다.

1.1.4.1.4 기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량

1) 시험법 적용범위

식품의 전반에 적용이 가능하다.

2) 장치

액체크로마토그래프-시차굴절계검출기(RI)

3) 시약 및 시액

가) 당류 혼합 표준용액

각 각의 당류 표준품(과당, 포도당, 설탕, 맥아당, 유당)을 60℃ 진공오븐에서 12시간 건조하여 각각을 증류수에 녹여 혼합 조제한다. 이때 검량선용 표준용액의 농도는 시험용액의 피크면적이 각 당류 표준물질의 직선성을 만족할 수 있도록 조정하여 조제한다.

나) 이동상

아세토니트릴과 증류수를 80:20의 부피비율로 혼합하여 조제한다. 이때 이동상은 유리섬유필터(Whatman GF/F 0.7um 또는 이와 동등한 것) 또는 나일론 66필터(Pall 0.45um 또는 이와 동등한 것)로 여과한 후, 사용 전에 초음파 처리하여 가스를 제거하고 사용한다.

※ 아세토니트릴 및 증류수를 테프론과 셀룰로오즈 에스테르 멤브레인 필터로 각각 여과하여 사용할 수 있다.

4) 시험용액의 조제

가) 시료 중 지방 제거

시료를 균질화한 후, 50 mL 원심분리관에 균질화된 검체 5 g을 정밀히 달아 넣고 25 mL 석유에테르로 분산시킨다. 이를 2,000 rpm에서 약 10분간 원심분리한 후, 고형분이 제거되지 않도록 조심스럽게 석유에테르를 제거한다. 이를 반복하고 질소를 이용하여 석유에테르를 완전히 증발시킨다. 이때, 지방이 없는 것으로 확인된 시료의 경우 시료 중 지방 제거과정을 생략한다.

나) 당류의 추출

지방이 제거된 시료에 증류수 25 mL 혹은 50% 에탄올 용액을  가하여 무게를 확인한다. 이를 85℃ 수조에서 25분간 가온하여 당류를 추출하고 실온으로 냉각하여 최초 기록한 추출용매의 무게가 될 수 있도록 추출용매를 첨가한다. 이를 0.45 μm의 나일론 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 이때, 시험용액이 혼탁할 경우, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 여과한다.

5) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 조건

※ (3) 이동상 및 (4) 유속의 조건은 (1)컬럼의 용량요인과 분해능을 만족하는 범위에서 조정할 수 있다.

(1) 칼럼：길이 300 mm, 안지름 4 mm, μ-Bondapak Carbohydrate칼럼 또는 이와 동등한 것

※ 칼럼은 다음의 용량요인과 분해능을 만족해야 한다.

- 과당에 대한 용량요인(Capacity factor, K') = (tR-t0)/t0 ≥ 5

․tR : 주입 후 과당의 최대 피크높이까지의 머무름 시간

․t0 : 주입 후 용매의 최대 피크높이까지의 머무름 시간

- 과당과 포도당의 분해능(Resolution, Rs) = (t2-t1)/0.5(tw1+tw2) ≥ 1

․t1 : 주입 후 과당의 최대 피크높이까지의 머무름 시간

․t2 : 주입 후 포도당의 최대 피크높이까지의 머무름 시간

․tw1 : 과당의 베이스라인에서의 피크넓이(Width)

․tw2 : 포도당의 베이스라인에서의 피크넓이(Width)

(2) 검출기：시차굴절계검출기(RI)

(3) 이동상 : 아세토니트릴:증류수(80:20, w/w)

(4) 유속：1.0 mL/분

(5) 칼럼온도：실온

6) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10 μL씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 각각의 당류의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 검체 중 당류의 함량(mg/100 g)을 산출한다. 이때 표준용액 검량선의 농도범위는 시험용액 중 각각의 당류의 농도에 대한 직선성이 만족될 수 있도록 조정한다.

가) 계산방법

당함량(mg/100 g) ＝ S ×	a×b	×	100
	검체채취량(g)		1,000

S：시험용액 중의 당류의 농도(μg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：희석배수

제 10, 1.1.4.3. 식이섬유 가. 제1법을 다음과 같이 한다.

가. 효소-중량법

1) 시험법 적용범위

가공식품, 과일 및 채소 등에 적용한다.

2) 분석원리

건조된 시료 두 개를 준비하고 이를 내열성 α-아밀라아제, 프로테아제, 아밀로글루코시다제 효소로 연속적으로 분해하여 전분과 단백질을 제거한다. 이때 10% 이상의 지방을 함유한 식품은 건조 전에 지방을 제거하여 시험한다. 총 식이섬유(TDF) 정량은 효소분해물에 녹아 있는 식이섬유를 에탄올로 처리하여 침전시켜 여과하고 에탄올과 아세톤으로 세척한 후, 건조하여 그 무게를 확인한다. 물불용성 식이섬유(IDF)는 효소분해물을 여과하여 잔사를 따뜻한 물로 세척하고 그 무게를 확인하여 정량한다. 수용성식이섬유(SDF)는 IDF의 전처리과정에서 얻은 여과액과 세척액을 합하여 에탄올로 침전시킨 후 여과하여 잔류물을 건조하고 무게를 확인하여 정량한다. 총 식이섬유, 물불용성 및 수용성식이섬유 함량계산 시 잔사의 무게 중 단백질 및 회분량은 보정해준다.

3) 장치

가) 비커 : 400 또는 600 mL Tall-form.

나) 유리여과기 : 기공 40～60 μm(ASTM 기준)의 용융 유리디스크가 있는 Pyrex 60 mL(Corning No. 36060 Buchner 또는 이와 동등한 것). 525℃에서 하룻밤 동안 회화하고 회화로 온도가 130℃까지 떨어지면 유리여과기를 상온에서 방냉한 후, 2% 세척액에 1시간 동안 담근 후 물로 씻고 증류수로 헹군 다음 아세톤 15 mL을 사용하여 마지막으로 세척하고 바람을 불어 대기 중 방치하여 건조시킨다. 건조된 유리여과기에 규조토 약 1.0 g을 넣고 130℃에서 항량한 후, 데시케이터에서 1시간 동안 실온에 방냉하여 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg까지 칭량하여 기록한다.

다) 진공장치 : 조절장치를 갖춘 진공펌프나 아스피레이터, 1L 용량의 여과용 가지달린 플라스크 및 여과용 플라스크에 사용하는 고무 아답터

라) 진탕 항온수조 : 98±2℃까지 가온 및 온도의 유지가 가능하고 60℃로 일정하게 온도를 유지할 수 있는 것.

마) 저울 : 0.1 mg 까지 측정이 유효한 것.

바) 회화로 : 525±5℃ 유지할 수 있는 것.

사) 오븐 : 105℃와 130±3℃ 유지할 수 있는 것.

자) 데시케이터 : 실리카겔이나 이와 동등한 건조제가 있는 것. 건조제는 필요 시 130℃에서 하룻밤 동안 건조하여 사용한다.

차) pH meter : 온도 보정이 되고 pH 4, 7, 10 버퍼용액으로 표준화 된 것.

카) 피펫 : 일회용 팁이 사용가능한 것으로 용량 100～300 μL 및 5 mL.

타) 디스펜서 : 15±0.5 mL용 3개(78% ethanol, 95% ethanol, acetone용), 40±0.5 mL용 1개(버퍼용)

파) 자석 교반기 및 마그네틱바

4) 시약 및 시액

가) 증류수 : 3차 증류수

나) 에탄올 수용액

(1) 85% : 1L 정용 플라스크에 95% 에탄올 895 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

(2) 78% : 1L 정용 플라스크에 95% 에탄올 821 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

다) 내열성 α-아밀라아제 용액 : 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로 글리세롤이 없을 것, 0～5℃에서 보관하며 사용한다(Sigma사 Catalog No. A 3306 또는 이와 동등한 것)

※ (1) 가용성 전분을 기질로 하는 Nelson/Somogyi reducing sugar 방법에 기초하는 것 : 10,000±1000 units/mL(1 unit: pH 6.5, 40oC에서 1분당 1 μmole reducing sugar equivalents를 만드는 데 필요한 효소의 양)

(2) 내열성 α-글루코시다제의 존재 시 기질로 p-nitrophenyl -maltosaccharide를 사용하는 Ceralpha방법에 기초한 것 : 3,000±300 Ceralpha units/mL (1 unit: pH 6.5, 40oC에서 1분당 1 μmole p-nitrophenol을 만드는 데 필요한 효소의 양)

라) 프로테아제 효소용액: 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소 활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하고 MES/TRIS 완충액으로 희석하여 50 mg/mL로 사용 시 조제한다(Sigma사 Catalog No. P 3910 또는 이와 동등한 것)

※ (1) Casein assay : 300～400 units/mL (1 unit: pH 8.0, 40oC에서 가용성 casein으로부터 1분당 1 μmole tyrosine equivalents를 가수분해하는데 필요한 효소의 양) ; 7～15 units/mg (1 unit: pH 7.5, 37oC에서 casein으로부터 1분당 1.0 μmole tyrosine에 해당하는 색 (Folin-Ciocalteau reagent)을 내는데 필요한 효소의 양)

(2) Azo-casein assay : 300～400 units/mL (1 unit endo-peptidase activity: pH 8.0, 40oC에서 가용성 casein으로부터 1분당 1 μmole tyrosine equivalents를 가수분해하는데 필요한 효소의 양)

마) 아밀로글루코시다제 용액 - 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소 활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하며 사용한다. 글리세롤이 없을 것.(Sigma사 Catalog No. A 9913 또는 이와 동등한 것)

※ (1) Starch/glucose oxidase-peroxidase 방법 : 2,000～3,300 units/mL (1 unit: pH 4.5, 40oC에서 1분당 1 μmole 포도당을 만드는 데 필요한 효소의 양)

(2) PNPBM (p-nitophenyl β-maltosidase) 방법 : 130～200 units/mL (1 unit: β-글루코시다제가 과량 존재할 때, 40oC에서 1분당 p-nitrophenyl β-maltosidase가 1 μmole p-nitrophenol을 만드는 데 필요한 효소의 양).

바) 규조토(Diatomaceous earth) : 산세척한 것(Sigma사 Catalog No. C 8656 또는 Fisher Scientific사 Catalog No. C-211, 산세척 또는 그와 동등한 것)

사) 세척용액 : 실험실용 액체 계면활성 세정제(International products사의 Micro 혹은 그와 동등한 것)를 2% 수용액으로 조제한다.

아) MES : 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid(Sigma사 Catalog No. M-8250 또는 이와 동등한 것)

자) TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane(Sigma사 Catalog No. T-1503 또는 이와 동등한 것)

차) MES-TRIS 완충용액(0.05M MES, 0.05M TRIS, 24℃에서 pH 8.2) : MES 19.52 g과 TRIS 12.2 g을 물 1.7 L에 녹인 후 6M 수산화나트륨용액을 가하여 pH 8.2로 조절한 후, 물을 가하여 2 L가 되게 조제한다. (24℃에서 pH 8.2로 조절하는 것이 중요하다. 만약 버퍼용액의 온도가 20℃이면 pH 8.3으로 조절하고, 28℃이면 pH 8.1로 조절한다.)

카) 염산용액(0.561M) : 1 L 정용 플라스크에 물 약 700 mL를 넣고 6M HCl 93.5 mL을 혼합한 후 증류수로 표선까지 채워 조제한다.

5) 효소 활성 검증

효소 활성은 표 1.의 표준시료를 가. 효소-중량법에 따라 분석 시 총 식이섬유 함량에 대한 회수율을 만족하여야 한다. 이때 펙티나제, 헤미셀룰라제, β-글루카나제의 오염이 존재하지 않는지를 팩틴, 아라비노갈락탄, β-글루칸으로 확인하여야 한다. 개봉한 효소는 최대 6개월 마다 활성을 검증하여 사용한다.

표 1. 표준시료에 대한 식이섬유 회수율 만족범위

표준시료	활성검증 대상효소	표준시료 사용량, g	회수율, %
Wheat starch1)	내열성 α-아밀라아제 + 아밀로글루코시다제	1.0	0～1
Corn starch2)	내열성 α-아밀라아제 + 아밀로글루코시다제	1.0	0～1
Casein3)	프로테아제 효소	0.3	0～1
Pectin4)	팩티나제	0.1	95～100
Arabinogalactan5)	헤미셀룰라제	0.1	95～100
β-Glucan6)	β-글루카나제	0.1	95～100

1) Sigma사 Catalog No. S 1514 혹은 이와 동등한 것

2) Sigma사 Catalog No. S 2388 혹은 이와 동등한 것

3) Sigma사 Catalog No. C 7906 혹은 이와 동등한 것

4) Sigma사 Catalog No. P 7536 혹은 이와 동등한 것

5) Sigma사 Catalog No. A 9788 혹은 이와 동등한 것

6) Sigma사 Catalog No. G 7391 혹은 이와 동등한 것

6) 시험용액의 조제

가) 시료 균질화

건조된 시료의 총 식이섬유를 확인하기 위해서 시료를 균질화한 후, 70℃ 진공오븐에서 하룻밤 동안 건조시킨다. 시료를 데시케이터에서 방냉하고 0.3～0.5 mm mesh가 되도록 건식 분쇄한다. 열처리를 할 수 없는 시료의 경우 분쇄하기 전에 냉동건조한다. 지방함량이 높다면 (10% 이상) 분쇄하기 전에 석유에테르로 탈지한다(시료 1 g당 25 mL 씩 3번 처리). 지방제거로 인한 무게 손실을 기록하고 이에 대한 총 식이섬유 함량(%)을 보정한다. 분석 전까지 건조-분쇄된 시료는 마개가 있는 병에 담아 데시케이터에서 보관한다(만약 시료의 지방함량을 모른다면, 식이섬유를 측정하기 전에 탈지한다). 당 함량이 높은 제품은 식이섬유 측정 전에 85% 에탄올(10 mL/g)로 2～3회 추출한 다음 상등액을 제거하고 40℃에서 하룻밤 동안 건조한다.

나) 효소분해

4개의 400 mL(또는 600 mL) tall-form 비커에 시료 1.000 ± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에  MES-TRIS 완충용액 40 mL씩 가하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산될 때까지 자석 교반하여 혼합한다. 저속으로 혼합하면서, 내열성 α-아밀라아제 용액 50 μL을 첨가한다. 비커를 알루미늄박으로 덮은 후 95∼100℃ 수욕에서 15분 동안 계속 교반하면서 반응한다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다(보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비커를 꺼내어 60℃로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비커의 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 프로테아제 효소용액 100 uL을 각 비커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비커를 덮고 60±1℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 알루미늄박을 제거한 후 비커를 잘 교반하면서 0.561M HCl 5 mL을 넣어준다. 60℃에서 1M NaOH, 1M HCl를 사용하여 용액을 pH 4.0-4.7로 조정한다(※ 참고 : pH는 낮은 온도에서 올라가기 때문에 60℃에서 pH를 조정하고 확인하는 것이 중요하다. 대부분의 곡류, 채소 시료의 경우, pH 조정이 없이도 pH조건을 만족할 수 있으므로 이전에 확인된 시료의 경우, pH 조정 과정을 생략할 수 있다. 단, 공시험의 pH를 예비단계로 확인하고 만약 공시험의 pH가 올바른 범위를 벗어난다면, 반드시 시료의 pH를 점검한다). 비커를 교반하면서 아미노글루코시다제 용액 300 uL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60±1℃ 수욕에서 교반하면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

7) 총 식이섬유(TDF) 함량 측정

실온 기준 225 mL 95% 에탄올을 60℃에서 효소 분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 1시간 침전시킨다. ☆미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에  78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약스푼를 이용하여 비커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 78% 에탄올, 95% 에탄올, 아세톤 순으로 각각 15 mL씩 2회 잔류물을 씻는다. ★105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 동안 건조시키고, 데시케이터에서 1시간 동안 방냉하여 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

8) 물불용성 식이섬유(IDF) 측정

미리 규조토를 넣어 항량하여 준비한 유리여과기에 물 3 mL을 가하여 규조토를 적시고 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층을 고르게 한다. 이에 시험용액 조제에서 얻어진 효소분해물을 유리여과기를 통해 여과용 플라스크로 여과한다. 비커를 세척하면서 잔류물을  70℃ 물 10 mL로 2회 세척한다. 여액과 물 세척액을 합치고, 미리 무게를 칭량한 600 mL 비커로 옮겨 9) 수용성 식이섬유 측정에 사용한다. 잔류물은 곧바로 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각각 15 mL씩 2회 세척한다(주의: 잔류물의 세척을 즉시 하지 않을 경우, IDF 값이 높아질 수 있다). 7) 총식이섬유 함량 측정 과정의 ★ 이하에 따라 IDF의 무게를 계산한다.

9) 수용성 식이섬유(SDF) 측정

8) 물불용성 식이섬유 측정에서 600 mL 비커로 옮긴 여액과 물 세척액의 무게를 확인하여 부피를 확인하고 미리 60℃로 가열된 95% 에탄올을 측정한 부피의 4배량을 가한다. 이때 60℃ 에탄올의 일부를 이용하여 여과용 플라스크에 남은 여액과 물 세척액을 세척한다. 여과액과 물 세척액에 에탄올을 4배량 가하기 위한 방법으로 물을 첨가하여 여과액과 물 세척액의 무게를 80 g으로 맞추고, 60℃의 95% 에탄올 320 mL을 가할 수도 있다. 그 후, 상온에서 1시간 침전시킨 후, 7) 총 식이섬유 함량 측정 중 ☆이하에 따라 SDF의 함량을 측정한다.

10) 식이섬유 함량의 계산

※ 총 식이섬유 함량은 7) 총 식이섬유(TDF) 함량 측정을 독립적으로 수행하여 결정하거나 8) 물불용성 식이섬유(IDF) 측정 및 9) 수용성 식이섬유(SDF) 측정에서 구한 IDF와 SDF의 합으로 결정할 수 있다.

가) 공시험 함량 (B, mg) 측정:

B = [(B1R + B2R) / 2] - PB - AB

․B1R, B2R: 공시험 2반복에 대한 잔사의 무게 (mg)

․PB: 공시험(B1)의 단백질 무게 (mg)

․AB: 공시험(B2)의 회분 무게 (mg)

나) 식이섬유 함량(DF, g/100g) 측정:

[eqn: DF= {{[M1R+M2R]} over {2} -P-A-B} over {{(M1`+M2)} over {2}} TIMES 100]

․M1R, M2R: 검체 2반복의 잔사 무게 (mg)

․P: 잔사(M1R) 중 단백질 무게 (mg)

․A: 잔사(M2R) 중 회분 무게 (mg)

․B: 공시험 함량 (mg)

․M1, M2: 검체의 무게 (mg)

나. 액체크로마토그래피를 이용한 수용성 식이섬유의 정량

1) 시험법 적용범위

난소화성 말토덱스트린 등 알코올 수용액에 의해 일부만이 침전되는 식이섬유를 함유하는 식품

2) 분석원리

난소화성 말토덱스트린(RMD) 등을 함유한 식품에 인산완충액을 이용한 효소-중량법을 적용하여 에탄올에 의해 침전되는 고분자의 난소화성 말토덱스트린과 같은 수용성 식이섬유(HMWSDF)를 확인하고 에탄올에 녹는 저분자의 난소화성 말토덱스트린과 같은 수용성 식이섬유(LMWSDF)를 탈염하여 농축한 후, 액체크로마토그래피로 확인하는 방법이다. 이 방법에서 총 식이섬유는 물불용성 식이섬유(IDF) 및 HMWSDF와 액체크로마토그래피로 확인한 LMWSDF의 합으로 계산되어진다. 즉 효소-중량법으로 구한 식이섬유의 함량에 알코올에 녹는 수용성 식이섬유의 함량을 합하여 총 식이섬유의 함량으로 한다.

3) 장치

가) 저울 : 0.1 mg 까지 측정이 유효한 것.

나) 비커 : 500 mL Tall-form.

다) 진탕 항온수조 : 98±2℃까지 가온하여 온도 유지가 가능하고 60℃로 일정하게 온도를 유지할 수 있는 것.

라) 유리여과기 :  기공 40～60 μm(ASTM 기준)의 용융 유리디스크가 있는 Pyrex 60 mL(Corning No. 36060 Buchner 또는 이와 동등한 것). 525℃에서 하룻밤 동안 회화하고 회화로 온도가 130℃까지 떨어지면 유리여과기를 상온에서 방냉한 후, 2% 세척액에 1시간 동안 담근 후 물로 씻고 증류수로 헹군 다음 아세톤 15 mL을 사용하여 마지막으로 세척하고 바람을 불어 건조시킨다. 건조된 유리여과기에 규조토 약 1.0 g을 넣고 130℃에서 항량한 후, 데시케이터에서 1시간 동안 실온에 방냉하여 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg까지 칭량하여 기록한다.

마) 유리 또는 플라스틱 칼럼관 : 이온교환수지를 채우기 위한 것으로 40∼70 cm × 15 mm 내경의 칼럼관

바) 유리막대 : 20 cm 길이로 끝을 열처리한 것

사) 일회용 주사기 : 10 mL

아) 파스퇴르 피펫, 10 mL 정용피펫

자) 저울 : 4,000 g 용량

차) 테프론 막대 : 비커의 침전물을 모을 수 있는 것

카) 용량플라스크 : 10, 50, 250 및 1,000 mL

타) 감압농축기

4) 시약 및 시액

가) 증류수 : 3차 증류수

나) 에탄올 : 95% Technical grade

다) 에탄올 수용액(78%) : 1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 821 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

라) 인산수소나트륨(Na2HPO4) 및 인산이수소나트륨(NaH2PO4)

마) 인산 완충용액(0.08M, pH 6.0) : 무수 인산수소나트륨 1.4 g (또는 2수화물 1.753 g)과 9.68 g 인산이수소나트륨·1수화물 (또는 2수화물 10.94 g)을 700 mL 증류수에 녹인 후 증류수를 가하여 1 L로 조제한다. 이때 pH를 확인한다.

바) 액체크로마토그래피 머무름 시간 확인용 표준물질 : 저분자의 난소화성 말토덱스트린에 해당하는 올리고당([DP(Degree of polymerization)≥3])을 포함한 DE(Dextrose equivalent) 25 또는 16.5～19.5의 말토덱스트린(Sigma사 419699 또는 이와 동등한 것)

사) 내열성 α-아밀라아제 용액 : Termamyl 120 또는 이와 동등한 것, 글리세롤이 없을 것, 0～5℃에서 보관하며 사용한다(Sigma사 Catalog No. A 3403 또는 이와 동등한 것)

아) 프로테아제 효소용액: 1.1.4.3. 가. 4)시약 및 시액 라)의 효소분해능을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하고 인산 완충용액으로 희석하여 10 mg/mL로 사용 시 조제한다.(Sigma사 Catalog No. P 3910 또는 이와 동등한 것)

자) 아밀로글루코시다제 용액 : 1.1.4.3. 가. 4)시약 및 시액 마)의 효소분해능을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하며 사용한다. 글리세롤이 없을 것(Sigma사  Catalog No. A 9913 또는 이와 동등한 것)

차) 규조토(Diatomaceous earth.) : 산세척한 것(Sigma사 Catalog No. C 8656 또는 Fisher Scientific사 Catalog No. C-211, acid washed 또는 이와 동등한 것)

카) 각 시료의 탈염을 위한 이온교환수지

(1) m-1 : 25 g Amberlite IRA-67(OH-type) 또는 이와 동등한 것

(2) m-2 : 25 g Amberlite 200 CT(HG)H(H-type) 또는 이와 동등한 것

각 시험 용액의 분석을 위해서 유리칼럼에 상기 2종의 수지를 잘 혼합하여 충진한다.

․ 총 이온교환능 : 1.74 meq/mL

․ 유효 이온교환능(R-H 교환능) : 1.6 meq/mL(min.)

․ 상기 2종의 수지를 혼합하여 충진하기 전 각 수지를 증류수로 세척하고 세척액의 pH가 m-1은 7～8.8, m-2는 4～7의 값이 되도록 한다.

※ Amberlite 200 CT(HG)H가 없을 경우, Amberlite 200 (Na-type) 또는 Amberlite 200CT를 'H-type'으로 전환하여 사용한다. 이를 위해 Amberlite 200(Na-type) 600 mL(500 g)을 유리 또는 플라스틱 칼럼관(100 cm × 40 mm id)에 채우고 2배 부피의 증류수를 이용하여 60 mL/min의 속도로 세척하고 2배 부피의 10% 염산용액(1→3 w/w)을 재차 60 mL/min의 속도로 흘려준 후 수지의 3배 부피에 해당하는 증류수를 이용하여 60 mL/min의 속도로 세척하여 염산을 제거한다. 3～6배의 부피에 해당하는 증류수를 120 mL/min의 속도로 재차 세척하고 세척액의 pH가 4～7인지 확인하여 염산용액의 세척이 제대로 이루어졌는지 확인하여 사용한다.

타) 수산화나트륨 수용액(0.274 M) : NaOH 11 g을 증류수 약 700 mL에 녹인 후 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

파) 염산용액(0.325M) : 1 L 정용 플라스크에 1M HCl 325 mL을 넣고 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

하) 글리세롤 표준용액(10 mg/mL) : 비커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 1L 정용플라스크로 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

갸) 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액(100 mg/mL) : 비커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 100 mL 정용플라스크에 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

냐) 황산 암모늄

댜) 덱스트로즈 : 액체크로마토그래피용, 순도 99.5% 이상

5) 시험용액의 조제

가) 시료 균질화

제10, 1, 1.1, 1.1.4, 1.1.4.3. 식이섬유 가. 효소-중량법 6) 시험용액 조제 가)와 같이 준비한다. 당함량이 높은 시료의 경우, LMWSDF의 손실을 고려하여 85% 에탄올 세척과정은 생략한다.

나) 효소분해

4개의 500 mL tall-form 비커에 시료 1.000 ± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에  인산 완충용액 50 mL씩 가하고 초음파를 이용하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산시킨다. 내열성 α-아밀라아제 용액 100 μL을 첨가한다. 비커를 알루미늄박으로 덮은 후 95℃ 수욕에서 30분 동안 계속 진탕하면서 반응시킨다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다 (보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비커를 꺼내어 실온으로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비커에 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 0.275M 수산화나트륨용액으로 pH를 7.5±0.1로 조정한 후, 프로테아제 효소용액 0.5 mL를 각 비커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비커를 덮고 60℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 실온으로 용액을 식힌 후, 알루미늄박을 제거한 후 비커를 잘 교반해주면서 0.325M HCl로 용액의 pH를 4.5±0.2로 조정한다. 비커를 교반해주면서 아미노글루코시다제 용액 0.3 mL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60℃ 수욕에서 지속적으로 흔들면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

6) 물불용성 식이섬유(IDF) 및 HMWSDF의 함량 측정

60℃로 가열한 95% 에탄올을  60℃ 수욕 상의 효소분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피의 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 하룻밤 침전시킨다. 미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에 있는 78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약스푼를 이용하여 비커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 20 mL 78% 에탄올 3회, 10 mL 95% 에탄올로 2회, 10 mL 아세톤으로 2회씩 잔류물을 씻어낸다. 105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 건조시키고, 유리여과기를 데시케이터에서 1시간 동안 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

7) 여액 회수 및 탈염

6)의 여액을 감압농축기로 농축하여 완전 건고하고 잔류물을 소량의 물로 녹인 후, 이를 50 mL 정용플라스크에 정량적으로 옮긴다. 이에 글리세롤 표준용액 10 mL을 넣고 증류수로 표선까지 채워 50 mL로 조제한다. 이를 Amberlite IRA-67(m-1) 및 Amberlite 200CT(HG)H(m-2) 각 25 g을 완전히 혼합하여 채운 유리칼럼(75 cm

× 15 mm id)에 통과시키고 이후, 250 mL 증류수로 칼럼을 통해 세척하며 추출한다. 이때 유속은 0.8 mL/min으로 조정한다.

이온교환 칼럼을 통과한 초기 용출액부터 250 mL를 모아 정량적으로  500 mL 둥근 플라스크에 옮기고 완전 건고될 때 까지 감압농축한다. 이를 10 mL 정용플라스크로 증류수를 이용하여 정량적으로 옮겨 10 mL로 조제한 후 10 mL 일회용 주사기에 옮겨 0.2 um 맴브레인 필터로 여과하여 액체크로마토그래피용 시험용액으로 한다.

8) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 분석칼럼 : TSK-GEL G2500PWXL, 7.8 mm id × 30 cm를 연속하여 2개를 연결한 것 또는 이와 동등한 것

(2) 가드 칼럼 : TSK guard column PWXL, 6.0 mm id × 4 cm 또는 이와 동등한 것

(3) 칼럼온도 : 80℃

(4) 이동상 : 증류수

(5) 유속 : 0.5 mL/min

(6) 주입량 : 20 μL

(7) 검출기 : 시차굴절계검출기(RI), 40℃ 유지

나) RMD와 액체크로마토그래피 반응이 동등한 덱스트로즈로 반응계수 결정

RMD의 RI 검출기의 반응에 대한 평가와 표준화를 위해 글리세롤 표준물질을 사용한다. LC 분석에서 RI 검출기에서 얻은 RMD의  피크면적은 덱스트로즈와 동등하며 내부표준물질인 글리세롤의 피크면적과 덱스트로즈의 농도에 따른 피크면적을 비교한다. 이렇게 작성된 검량곡선으로부터 시험용액 중 RMD의 함량을 계산하는데 사용할 반응계수를 결정한다.

동량의 글리세롤과 3개 농도 수준으로 덱스트로즈를 100 mL 정용플라스크에 각각 넣은 3개의 용액을 준비한다. 이를 위해 0.5, 1.0, 2.0 g의 덱스트로즈를 3개의 구분된 100 mL 정용플라스크에 정확히 칭량하여 넣고 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액 10 mL을 각 정용 플라스크에 첨가한 후 증류수를 채워 100 mL로 조제한다. 조제된 3개의 표준용액 20 μL를 액체크로마토그래피에 주입하여 각 크로마토그래피에서 덱스트로즈와 글리세롤의 피크면적을 확인하여 글리세롤의 피크면적에 대한 덱스트로즈 피크면적 비(y-축)와 글리세롤 함량에 대한 덱스트로즈 함량 비(x-축)을 비교하여 얻어진 기울기의 역수로부터 아래의 식과 같이 반응계수를 구한다.

반응계수(Rf) = 1/[(PA-dex/PA-gly)×(Wt-gly/Wt-dex)]

PA-dex : 덱스트로즈 피크면적

PA-gly : 글리세롤 피크면적

Wt-dex : 표준용액 중 덱스트로즈 함량

Wt-gly : 표준용액 중 글리세롤 함량

다) 액체크로마토그래피의 크로마토그램

그림 1. 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램

9) 식이섬유 함량 계산

※ 총 식이섬유 함량(TDF)은 %(IDF+HMWSDF)와 LMWSDF의 평균 함량(%ALMWSDF)을 합하여 계산한다.

가) (IDF + HMWSDF)의 함량 계산

(1) 공시험 함량 (B, mg) 측정:

B = [(B1R +B2R) / 2] - PB - AB

․B1R, B2R: 공시험 2반복에 대한 잔사의 무게 (mg)

․PB: 공시험(B1)의 단백질 무게 (mg)

․AB: 공시험(B2)의 회분 무게 (mg)

(2) (IDF + HMWSDF) 평균 함량(g/100g) 측정:

[eqn: %(IDF+HMWSDF)= {{[M1R+M2R]} over {2} -P-A-B} over {{(M1`+M2)} over {2}} TIMES 100]

․M1R, M2R: 검체 2반복의 잔사 무게 (mg)

․P: 잔사(M1R) 중 단백질 무게 (mg)

․A: 잔사(M2R) 중 회분 무게 (mg)

․B: 공시험 함량 (mg)

․M1, M2: 검체의 무게 (mg)

나) LMWSDF의 평균 함량

(1) LMWSDF(mg) 측정:

LMWSDF	=	PAS_LMWSDF×WtS_gly×Rf
		PAS_gly

․PAS_LMWSDF : 시험용액 중 LMWSDF(DP≥3)의 피크면적

․PAS_gly : 시험용액 중 글리세롤의 피크면적

․WtS_gly : 시험용액에 첨가한 글리세롤의 무게(mg)

․Rf : 덱스트로즈-글리세롤 반응계수

(2) 각 시료의 LMWSDF의 함량(g/100g) 측정

%LMWSDF	=	LMWSDF×100
		SW

․SW : 시료의 무게(mg)

(3) LMWSDF의 평균 함량(g/100g)

%ALMWSDF	=	%LMWSDF+%LMWSDF'
		SW

․%LMWSDF, %LMWSDF' : 각 시료의 LMWSDF의 함량(g/100g)

제 10. 2. 2.5.2, 가. 1)을 다음과 같이 신설한다.

1) 시험법의 적용범위

이 방법은 이산화황을 함유하는 대부분의 식품에 적용가능하다. 다만, 식초, 식초절임 등 다량의 식초를 함유하는 식품은 제외한다.

제 10. 2. 2.5.2, 가. 1)부터 5) 까지를 2)부터 6)으로 한다.

제 10. 2. 2.5.2, 나.를 다음과 같이 신설한다.

나. 산증류-비색법

1) 시험법 적용범위

식초, 식초절임 등 다량의 식초를 함유하는 식품에 적용한다.

2) 분석원리

식품 중의 아황산, 차아황산 및 그 염류 등을 산성조건하에서 증류하여 0.1N 수산화나트륨용액으로 포집하고, 포집 액을 파라로자닐린·포름알데히드 용액으로 발색시킨 후 흡광도를 측정하여 정량분석하는 방법이다.

3) 장치

가) 그림과 같은 장치를 쓴다(단위：mm)

A：50 mL 원형 플라스크 B：100 mL 환저 플라스크 C：이중냉각관 D：유리관 E：질소가스 유량계

4) 시약 및 시액

가) 25% 인산용액 : 85% 인산(H3PO4) 29.4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

나) 0.1N 수산화나트륨용액 : 수산화나트륨(NaOH) 0.4 g을 물에 녹여 100 mL로 한다.

다) 5% 디메돈ㆍ에탄올 용액 : 디메돈(dimedone) 5.0 g을 에탄올에 녹여 100 mL로 한다.

라) 1% 아지화나트륨용액 : 아지화나트륨(NaN3) 1.0 g을 물에 녹여 100 mL로 한다.

마) 파라로잘린 용액 : 염산파라로잘린 40.0 mg을 염산 20 mL에 녹인 후 물을 가하여 100 mL로 한다.

바) 0.2% 포름알데히드용액 : 포르말린 3.0 g을 정밀히 달아 물을 가하여 500 mL로 한다.

사) 파라로잘린ㆍ포름알데히드용액 : 파라로잘린용액과 0.2% 포름알데히드용액을 동량 혼합한다.

아) 표준용액 : 아황산수소나트륨(NaHSO3) 171.0 mg(이산화황으로서 100 mg 상당량)을 정밀히 달아 0.1N 수산화나트륨을 가하여 100 mL로 한 액을 표준원액으로 한다. 표준원액 1 mL을 정확히 취해 0.1N 수산화나트륨을 가하여 500 mL한 액을 표준용액으로 한다. 표준용액 0, 1, 2, 3, 4, 5 mL을 정확히 취해 0.1N 수산화나트륨을 가하여 5 mL로 한다(이 액 1 mL당  이산화황으로서 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 μg 함유).

5) 시험조작

플라스크(A)에 0.1N 수산화나트륨 용액 20 mL를 넣고 장치에  부착한다. 다음에 플라스크(B)에 물 20 mL, 5% 디메돈․에탄올 용액 1 mL, 1% 아지화나트륨용액 1 mL, 에탄올 2 mL, 소포제 2방울 및 25% 인산 10 mL를 가하고 장치에 부착한다. (E)로부터 질소를 매분 0.7 L의 속도로 5분간 흘린다. 플라스크(B)를 떼어내어 검체의 일정량을 신속히 넣고 다시 장치에 붙인 다음 질소가스를 0.7 L의 속도로 흘리면서 플라스크(B)를 20분간 가열한다. 가열이 끝나면 플라스크(A)를 떼어내어 플라스크(A) 중의 용액을 시험 용액으로 한다.

시험용액 5 mL(이산화황으로서 0~2.0 μg/mL)를 정확히 취해 물 0.1 mL를 가한 것을 (A)용액으로 하고, 새로 시험용액 5 mL를 정확히 달아 0.1% 과산화수소용액 0.1 mL를 가한 것을 (B)용액으로 한다. (A), (B)용액에 파라로잘닐린․포름알데히드 용액을 1 mL씩 정확히 가해 잘 혼들어 섞고, 실온에서 20분간 방치한 후 파장 580 nm에서 흡광도를 측정한다.  각각의 표준용액  5 mL 및 따로 검체를 사용하지 않고 같은 방법으로 조작한 것을 대조액으로 하여 시험용액과 동일하게 조작하여 검량선을 작성한 후, 다음 식에 따라 이산화황의 양을 산출한다(다만, 10 mg/kg 미만은 불검출로 한다).

6) 정량시험

앞의 시험조작에 따라 시험하고, 얻어진 시험용액의 흡광도[(A)용액의 흡광도 - (B)용액의 흡광도]로부터 작성한 검량선을 이용하여 시험용액중의 이산화황 농도(μg/mL)를 구하여 다음 식에 따라 검체중의 이산화황 함량(g/kg)을 계산한다.

이산화황(g/kg)	=	C
		50 × W

C : 시험용액중의 이산화황 농도(μg/mL)

W : 시료 채취량(g)

제10, 3, 3.4, 3.4.1, 53), 54) 및 55)를 각각 다음과 같이 한다.

53) 세균수 건조필름배지 Ⅰ

54) 대장균군 건조필름배지 Ⅰ

55) 대장균 건조필름배지 Ⅰ

제10, 3, 3.4, 3.4.1, 69), 70), 71) 및 72)를 다음과 같이 신설한다.

69) 세균수 건조필름배지 Ⅱ

Peptone                                            5 g

Bonito meat extract(Erlich meat extract)             1 g

Yeast extract                                     2.5 g

Glucose                                            1 g

Potassium hydrogen phosphate                      0.8 g

2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride              0.05 g

위의 성분을 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

70) 대장균군 건조필름배지 Ⅱ

Peptone                                             2 g

Bonito meat extract(Erlich meat extract)              8 g

Gall powder                                        1.5 g

Sodium deoxycholate                                 1 g

Sodium dodecyl sulfate                               1 g

Potassium nitrate                                     1 g

Potassium hydrogen phosphate                        1 g

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside                0.03 g

5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-galactopyranoside  0.5 g

위의 성분을 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

71) 대장균 건조필름배지 Ⅱ

Peptone                                             2 g

Bonito meat extract(Erlich meat extract)             8 g

Gall powder                                       1.5 g

Sodium deoxycholate                                1 g

Sodium dodecyl sulfate                              1 g

Potassium nitrate	1 g

Potassium hydrogen phosphate                       1 g

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside               0.03 g

5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-galactopyranoside 0.5 g

6-chloro-3indoxyl-β-D-glucuronic acid             0.5 g

위의 성분을 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

72) MRS 배지

Enzyme Digest of Casein                            10 g

Meat Extract	10 g

Yeast Extract	4 g

Glucose	20 g

Tween 80	1.08 g

Triammonium Citrate	2 g

Sodium Acetate	5 g

Magnesium Sulfate 7H2O	0.2 g

Manganese Sulfate 4H2O	0.05 g

Dipotassium hydrogen Phosphate	2 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 5.7±0.1로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

제10, 3, 3.5, 3.5.1, 나, 1)을 다음과 같이 한다.

3.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL를 세균수 건조필름배지(배지 53 또는 69)에 접종한 후 35～37℃에서 24～48시간 배양한 후 생성된 붉은 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 일반세균수로 한다.

제10, 3, 3.7, 3.7.2, 다를 다음과 같이 한다.

3.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL를 대장균군 건조필름배지Ⅰ(배지 54) 또는 대장균군 건조필름배지Ⅱ(배지 70)에 접종한 후, 35～37℃에서 24±2시간 배양한다. 대장균군 건조필름배지Ⅰ에서는 붉은 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하고, 대장균군 건조필름배지Ⅱ에서는 청색 및 청녹색의 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군 수를 산출한다.

제10, 3, 3.8, 3.8.2, 나를 다음과 같이 한다.

3.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL를 대장균 건조필름배지Ⅰ(배지 55) 또는 대장균 건조필름배지Ⅱ(배지 71)에 접종한 후, 35～37℃에서 24±2시간 배양한다. 대장균 건조필름배지Ⅰ에서는 푸른 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하고, 대장균 건조필름배지Ⅱ에서는 남색 및 보라색의 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군 수를 산출한다.

제 10, 3, 3.9, 3.9.1을 다음과 같이 한다.

3.9.1 유산간균 및 구균

유산균수의 측정방법은 3.5.1 일반세균수 측정방법에 준하여 시험하되 시험용액 제조 희석액은 멸균생리식염수(시액 2) 또는 펩톤식염완충액(시액 7)을 사용한다. 또한 배지는 BCP첨가 평판측정용배지(배지 11)를 사용하여 35∼37℃에서 72±3시간 배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계수 또는 MRS배지(배지 72)에 접종하여 30℃에서 72±3시간 배양한 후 발생한 엷은 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계수한다.

제 10, 3, 3.13을 다음과 같이 한다.

3.13 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus)

3.13.1 정성시험

1) 증균배양

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 Alkaline 펩톤수(배지 16)를 가한 후 35~37℃에서 18～24시간 증균배양한다.

2) 분리배양

증균배양액을 TCBS 한천배지(배지 17)에 접종하여 35~37℃에서 18～24시간 배양한다. 배양결과 직경 2～4 mm인 청록색의 서당 비분해 집락에 대하여 확인시험을 실시한다.

3) 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 TSI 사면배지(배지 32), LIM 반유동배지(배지 18), 2% NaCl을 첨가한 보통한천배지(배지 8)에 각각 접종한 후 35~37℃에서 18～24시간 배양한다. 장염비브리오는 TSI 사면배지(배지 32)에서 사면부가 적색, 고층부는 황색, 가스가 생성되지 않으며 LIM배지에서 Lysine Decarboxylase 양성, Indole 생성, 운동성 양성, Oxidase시험 양성이다.

장염비브리오로 추정된 균은 0, 3, 8 및 10% NaCl을 가한 Alkaline 펩톤수(배지 16)에 의한 내염성시험, VP 시험(배지 19), Mannitol 이용성시험(배지 20, 1% Mannitol 첨가), Arginine 및 Ornithine 분해시험(배지 21, 1% Arginine 또는 1% Ornithine 첨가), ONPG(배지 22)시험을 실시한다. 장염비브리오는 0% 및 10% NaCl 가한 배지에서 발육 음성, 3% 및 8% NaCl을 가한 배지에서는 발육 양성, VP 음성, 만니톨에서 산생성 양성, Ornithine 분해 양성, Arginine 분해 음성, ONPG 시험 음성, 3% NaCl을 가한 Nutrient Broth, 42℃에서 발육 양성이다.

3.13.2 정량시험

1) 균수측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취한 후, 225 mL의 희석액을 가하여 2분간 고속으로 균질화하여 시험용액으로 하여 10배 단계 희석액을 만든 다음 각 단계별 희석액을 TCBS 한천배지(배지 17) 3장에 0.3 mL, 0.4 mL, 0.3 mL씩 총 접종액이 1 mL이 되게 도말한다. 사용된 배지는 완전히 건조시켜 사용하고 접종액이 배지에 완전히 흡수되도록 도말한 후 10분간 실내에서 방치시킨 후 35～37℃ 에서 18～24시간 배양한 다음 청록색의 서당 비분해 집락을 계수한다.

2) 확인시험

계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 2% NaCl을 첨가한 보통한천배지(배지 8)에 접종하고 35~37℃에서 18～24시간 배양한 후 3.13.1 정성시험 3) 확인시험에 따라 시험을 실시한다.

3) 균수계산

확인 동정된 균수에 희석배수를 곱하여 계산한다.

제 10, 3, 3.14. 3.14.2 1)을 다음과 같이 한다.

1) 균수 측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 희석액을 가한 후 1～2분간 저속으로 균질화 한 후 10배 단계 희석액을 만든다. 시험용액 및 단계별 희석액 1 mL씩을 2매 이상의 멸균 페트리접시에 무균적으로 분주하고, 43～45℃로 유지한 난황을 첨가하지 않은 TSC 한천배지(배지 41) 10～15 mL를 가하여 좌우로 돌리면서 잘 혼합한 후 응고시킨다. 응고된 배지 위에 다시 동일한 배지 10 mL를 가하여 중첩시킨 후 35～37℃에서 24±2 시간 혐기 배양한다. 150개 이하의 전형적인 검은색 집락이 확인된 평판을 선별하여 각 집락수를 계수한다.

제 10, 6.1.2 아플라톡신 M1을 다음과 같이 한다.

6.1.2 아플라톡신 M1

1) 시험법 적용범위

원유, 우유 및 분유

2) 분석원리

검체 중의 아플라톡신 M1을 면역친화성칼럼으로 정제하여 형광검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) 액체그로마토그래프 : 형광검출기(Fluorescence detector)를 사용한다.

나) 정제용 칼럼 : 아플라톡신 M1용 면역친화성칼럼(Immunoaffinity column)

다) 여과지：Whatman No.4 또는 이와 동등한 것

라) 시린지필터 : 0.2 μm

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한

다) 표준원액：아플라톡신 M1을 아세토니트릴에 녹여 200 μg/mL되게한다.

라) 표준용액：표준원액을 아세토니트릴로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

마) 기타시약 : 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

(1) 액상 우유

시료 100 mL를 취하여 질량을 측정하고 40℃의 항온수조에 30분간 방치한 후 10분 동안 균질화한다. 균질화한 후 4℃에서 10분 동안 10,000 x g로 원심분리한다. 상층의 지방층을 제거하고 여과한 것을 추출액으로 한다.

(2) 분유 분말

균질화된 시료 10 g을 정밀히 달아 40℃의 온수 100 mL를 가하고 10분 동안 균질화한다. 균질화한 후 4℃에서 10분 동안 10,000 x g로 원심분리한다. 상층의 지방층을 제거하고 여과한 것을 추출액으로 한다.

나) 정제

추출액 50 mL를 정제용 칼럼에 주입하여 초당 1 방울 정도의 속도로 통과시킨다. 이어서 물  20 mL를 같은 유속으로 유출시키고 칼럼내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 아세토니트릴 4 mL로 용출시킨다. 용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 아세토니트릴․물(25:75, v/v) 0.2 mL를 가하여 녹인 후 시린지필터(0.2 μm)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 :  C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 아세토니트릴․물(25:75, v/v)

(3) 검출파장 : 여기파장 365 nm, 형광파장  435 nm

(4) 유속 : 1 mL/분

(5) 주입량 : 50 μL

나) 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램 및 검량곡선

그림 1. 아플라톡신 M1 표준용액의 액체크로마토그램

7) 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

8) 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 아플라톡신 M1의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

가) 계산

아플라톡신 M1의 함량(μg/kg) = C × V/S × D

C：검량선에서 구한 아플라톡신 M1의 농도(ng/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 희석배수

제 10, 7.1.2.3, 1) 중 나)를 삭제하고 다)를 나)로 한다.

제 10, 7.2, 4) , 가) (1) 중 “이를 제거하고 물로 세척할 경우에는”을 “이를 제거한다(다만, 수산물 중 식용가능한 어류의 알, 창난, 이리(곤이), 오징어 난포선 등의 내장은 포함한다).  또한 물로 세척할 경우에는”으로 한다.

제10, 9.2.1, 마, 3), 가), (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 검체(분말제품 및 환제품 500g, 액상 및 페이스트제품 1 kg)를 증류수 5～6 L와 혼합 후 (환제품의 경우 2시간이상 정치하여 검체를 으깸) 비닐을 씌운 봉자석(10,000 가우스 자력)으로 10분간 저어 쇳가루를 모은 후 건조하여 무게를 측정한다.(태움․용융소금은 쇳가루 이외의 입자가 봉자석에 응집될 수 있으므로 증류수를 분사하여 이를 제거한 후 쇳가루를 건조하여 무게를 측정한다.)

별표1, 1. 중 70를 다음과 같이 한다.

	품목명	이명 또는 영명	학 명	부 위
70	대마(大麻)	삼, Hemp	Cannabis sativa Linné	껍질(포엽과 종피)이 완전히 제거된 씨앗※(마인)

별표1, 1. 중 178을 삭제하고, 179부터 331까지를 178부터 330까지로 한다.

별표3, 2. 중 3를 다음과 같이 하고, 5를 삭제하고, 6부터 17까지를 5부터 16까지로 한다.

	품목명	이명 또는 영명	학 명	부 위
3	쓸개(쓸개즙)	담낭(담즙)	-	-

별표3, 3. 중 1를 다음과 같이 한다.

	품목명	이명 또는 영명	학 명	부 위
1	곰부차	Mushroom tea, tisane, Kombucha	-	-

부  칙

제1조(시행일) 이 고시는 2012년 8월 1일부터 시행한다. 다만, 제10. 9.2의 개정규정은 고시한 날부터 시행한다.

제2조(적용례) 이 고시는 고시 시행 당시 종전의 규정에 따라 제조․가공 또는 수입한 식품에 대하여도 적용한다.  다만, 제 2, 5, 6)의 개정규정은 고시 시행 후 최초로 제조․가공 또는 수입(선적일 기준)하는 식품부터 적용한다.

신․ 구조문 대비표

현  행

개  정 안

제 1. 총칙

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. 기준 및 규격의 적용

(생  략)

1) ～ 3) (생  략)

4) 즉석판매제조․가공대상식품 중 식육제품, 아이스크림제품류와 축산물가공처리법에 따라 제조․유통되는 축산물가공품은 축산물가공기준 및 성분규격을 적용한다.

2. 식품원료 기준

1) 원료 등의 구비요건

(1) ∼ (3) (생  략)

(4) 기준 및 규격이 정하여져 있는 식품, 식품첨가물은 그 기준 및 규격에, 주정은 「주세법」에 의한 품질기준에, 인삼·홍삼은 「인삼산업법」에, 축산물 및 그 가공품은 「축산물가공처리법」에 적합한 것이어야 한다.

(5) ∼ (17) (생  략)

3. ～ 4. (생  략)

5. 식품일반의 기준 및 규격

1) ～ 4) (생  략)

5) 중금속 기준

(1) ～ (2) (생  략)

(3) 농산물 중 중금속 기준

(4) (생  략)

(5) 축산물 중 중금속 허용기준

(6) ～ (7) (생  략)

6) 방사선 조사기준

(1) 사용방사선의 선원 및 선종은 60Co의 감마선으로 한다.

(2) 식품의 발아억제, 살충, 살균 및 숙도조절의 목적에 한하여, 식품에 방사선을 조사할 경우 다음의 기준에 적합하여야 한다.

① 허용대상 식품별 흡수선량

㉮ 감자, 양파, 마늘 : 0.15 KGy 이하

㉯ 밤 : 0.25 KGy 이하

㉰ 생버섯, 건조버섯 : 1 KGy 이하

㉱ 난분, 가공식품 제조원료용 곡류, 두류 및 그 분말, 조미식품 제조원료용 전분 : 5 KGy 이하

㉲ 가공식품 제조원료용 건조식육 및 어패류분말, 된장분말, 고추장분말, 간장분말, 가공식품 제조원료용 건조채소류, 효모․효소식품, 조류식품, 알로에분말, 인삼(홍삼포함)제품류 : 7 KGy 이하

㉳ 건조향신료 및 이들 조제품, 복합조미식품, 소스류, 침출차, 분말차, 2차살균이 필요한 환자식 : 10 KGy 이하

(3) 일단 조사한 식품을 다시 조사하여서는 아니되며 조사식품을 원료로 사용하여 제조․가공한 식품도 다시 조사하여서는 아니된다.

(4)  조사식품은 용기에 넣거나 또는 포장한 후 판매하여야 한다.

7) (생  략)

8) 곰팡이독소 기준

(1) 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2의 합)

대 상 식 품	기준 (㎍/kg)
(생 략)	(생 략)
(생 략)
장류(메주 제외) 및 고춧가루 및 카레분
(생 략)
(생 략)
(생 략)
(생 략)	(생 략)

(2) ～ (7) (생  략)

9) ～ 17) (생  략)

6. (생  략)

제 3. ～ 제 4. (생  략)

제 5. 식품별 기준 및 규격

1. ～ 10. (생  략)

11. 식육 또는 알가공품

1) (생  략)

2) 원료 등이 구비요건

(1) 가축 외 동물의 경우는 축산물가공처리법에서 정하고 있는 도살 및 해체방법과 검사기준에 적합한 것이어야 한다.

3) ～ 6) (생  략)

12. ～ 18. (생  략)

19. 특수용도식품

19-1 영아용 조제식

1) 정의

(생  략)

다만, 축산물가공처리법 대상식품인 조제유류는 제외한다.

2) ～ 6) (생  략)

19-2 성장기용 조제식

1) 정의

(생  략)

다만, 축산물가공처리법 대상식품인 조제유류는 제외한다.

2) ～ 6) (생  략)

19-3 ～ 19-7 (생  략)

20. 장류

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) ～ (2) (생  략)

(3) 총 아플라톡신(μg/kg) : 15 이하(B1, B2, G1 및 G2의 합으로서, 단 B1은 10 μg/kg 이하이어야 하며, 메주에 한함)

(4) (생  략)

(5) 보존료(g/kg 다만, 간장은 g/L) : 다음에서 정하는 것 이외의 보존료가 검출되어서는 아니된다(다만, 메주는 검출되어서는 아니된다).

소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	1.0 이하(소르빈산으로서, 간장 제외, 청국장은 비건조식품에 한한다)
(생 략)	(생 략)
(생 략)	(생 략)

6) 시험방법

(1) ～ (2) (생  략)

(3) 아플라톡신

제10. 일반시험법 6.1 곰팡이독소에 따른다.

(4) ～ (5) (생  략)

21.～ 23. (생  략)

24. 젓갈류

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) ～ (2) (생  략)

(3) 타르색소∶검출되어서는 아니된다.

(4) ～ (5) (생  략)

25.～ 28. (생  략)

29. 기타식품류

29-1 ～ 29-17 (생  략)

29-18 즉석섭취·편의식품류

1) ～ 4) (생  략)

5) 규격

(1) ～ (4) (생  략)

(5) 장염비브리오 : 음성이어야 한다(즉석섭취식품, 신선편의식품 중 해산물 함유 제품에 한한다).

(6) ～ (8) (생  략)

6) (생  략)

29-19 ～ 29-23 (생  략)

제 6. 수산물에 대한 규격

1. (생  략)

1) 수산물

(1) ～ (3) (생  략)

(4) 더 이상의 가공, 가열조리를 하지 않고 그대로 섭취하는 수산물의 미생물 규격 중 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 살모넬라(Salmonella spp.), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)가 음성, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 1 g 당 100 이하이어야 한다.

(5) ～ (6) (생  략)

2) ～ 4) (생  략)

2. (생  략)

제 7. (생  략)

제 8. 식품접객업소(집단급식소 포함)의 조리식품 등에 대한 기준 및 규격

1. ～ 3. (생  략)

4. 규격

가) 조리식품 등

(1) ～ (4) (생  략)

(5) 식중독균 : 식품접객업소(집단급식소 포함)에서 조리된 식품은 살모넬라(Salmonella spp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 캠필로박터 제주니(Camplyobacter jejuni), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus) 등 식중독균이 검출되어서는 아니되며, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)는 100/g 이하, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 10,000/g 이하이어야 한다. 다만, 조리과정 중 가열처리를 하지 않거나 가열 후 조리한 식품의 경우 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 100/g 이하이어야 한다.

(6) (생  략)

나) ～ 다) (생  략)

5. (생  략)

제 9. (생  략)

제 10. 일반시험법

1. 식품성분시험법

1.1 일반성분시험법

1.1.1 ～ 1.1.3 (생  략)

1.1.4 탄수화물

1.1.4.1. 당질

1.1.4.1.1 ～1.1.4.1.3 (생  략)

1.1.4.1.4 기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량

1) (생  략)

2) 장치

가)  액체크로마토그래프

3) 시약 및 시액

가) 표준용액의 조제

과당, 포도당, 설탕의 표준품을 각각 100 mL용 메스플라스크에 정밀히 달아 물 50 mL로 녹인 후 아세토니트릴로 100 mL까지 채운다.

4) 시험용액의 조제

검체 약 5 g을 50 mL 메스플라스크에 정밀히 달아 물 25 mL를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 50 mL까지 채운다. 이를 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 칼럼：길이 300 mm, 안지름 4 mm, μ-Bondapak/Carbohydrate 상당품

(2) 검출기：시차굴절계검출기(RI)

(3) 이동상：물：아세토니트릴(17：83)

(4) 유속：1.0 mL/분

(5) 칼럼온도：실온

6) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10 μL씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 당질의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 검체 중 당의 함량(mg/100 g)을 산출한다.

가) 계산방법

당함량(mg/100 g) ＝ S ×	a×b	×	100
	검체채취량(g)		1,000

S：시험용액중의 당질의 농도(μg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：희석배수

1.1.4.2 (생  략)

1.1.4.3 식이섬유

가. 제1법

1) 시험법 적용범위

본 시험법은 총식이섬유, 물불용성식이섬유, 수용성식이섬유의 시험에 적용한다.

2) 장치

가) 기공 40～60 μm, 용량 60 mL의 유리여과기：525℃에서 한 시간 처리한 후 식혀 물로 세척한 후 상온 건조하여 셀라이트 0.5 g을 가한 후 130℃에서 항량이 될 때까지 건조한 후 데시케이터에 옮겨 보관한다.

나) 진공펌프：역류방지장치가 부착된 것

다) 감압건조기 또는 상압가열건조기

라) 데시케이터

마) 회화로

바) 항온수조

사) pH 측정기：표준완충액 pH 4, pH 7, pH 10으로 표준화 시킨 것

3) 시약 및 시액

가) 에탄올용액

(1) 85%용액-95%에탄올 895 mL에 물을 가하여 1,000 mL로 한다.

(2) 78%용액-95%에탄올 821 mL에 물을 가하여 1,000 mL로 한다.

나) 내열성 α-아밀라제용액：Sigma사 Cat. No. A3306 또는 Termamyl 300 L, Novo Cat, No. 361-6282 또는 이와 동등한 것

다) 프로테아제：Sigma사 Cat. No. P. 3910 또는 이와 동등한 것(냉장 (0～5℃)보존) MES/TRIS 완충액으로 50 mg/mL되게 조제한다. 사용시 조제한다.

라) 아밀로글루코시다제용액：Sigma사 Cat. No. AMG A9913 또는 이와 동등한 것(냉장 (0～5℃)보존)

마) 규조토(Diatomaceous earth)：산세척한 것(Sigma사 Celite 545 AW. No. C8656) 또는 이와 동등한 것

바) 세척용액：액상계면활성제(International Products사의 MICRO제품 또는 이와 동등한 것), 물로 2% 용액으로 조제한다.

사) MES：2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid(Sigma사 No. M-8250 또는 이와 동등한 것)

아)TRIS：Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Sigma사 No. T-1503 또는 이와 동등한 것)

자) MES/TRIS 완충용액(0.05M MES, 0.05M TRIS, 24℃에서 pH 8.2)：MES 19.52 g과 TRIS 12.2 g을 물 1.7 L에 녹이고 6N 수산화나트륨용액으로 pH 8.2로 조절한 후 물을 가하여 2 L로 한다. 용액의 온도가 20℃이면 pH 8.1로, 용액의 온도가 28℃이면 pH 8.3으로 조정한다.

차) 염산용액(0.561 N)：6N염산 93.5 mL에 물을 가하여 1,000 mL로 한다.

4) 시험용액의 조제

시험은 두개의 검체 및 공시험을 동시에 실시한다.

미리 고운분말로 한 검체(지방이 10%이상인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85% 에탄올용액으로 검체 1 g당 10 mL씩으로 세척한다) 1.0±0.005 g 2개를 취하여 (M1, M2) 400 mL의 키가 큰 비커에 취하고, 이에 MES/TRIS용액 40 mL씩을 가하여 자석 교반으로 충분히 분산시킨다. 이에 내열성 α-아밀라제용액 50 μL를 가하고 서서히 저어 혼합하고, 알루미늄박으로 마개를 한 후, 95～100℃의 수욕에서 15분간 계속 교반한다.

계속해서 95℃에서 25분간 유지한다. 반응이 끝난 후 항온수조에서 꺼내어 60℃로 식히고 뚜껑을 열어 비커의 벽 또는 바닥에 내용물이 부착되어 있으면 시약스푼으로 긁어 분산시키고 물 10 mL로 시약스푼과 기벽을 씻는다.

각각의 비커에 프로테아제용액 100 μL씩 가하고 알루미늄박으로 뚜껑을 한 후 60±1℃에서 계속 교반하면서 30분간 항온시킨다. 뚜껑을 제거하고 0.561N 염산용액 5 mL를 가하고 흔들어 혼합하고 60℃에서 pH를 4.0～4.7로 조정한다. 이에 아밀로글루코시다제용액 300 μL를 넣고 흔들어 섞은 후 알루미늄박으로 뚜껑을  한 후 60℃에서 30분간 교반을 유지하며 항온시켜 시험용액으로 한다.

5) 총식이섬유의 정량

시험용액 각각에 60℃의 95% 에탄올 225 mL를 가한다. 에탄올과 시험용액의 용량비율은 4：1로 한다. 수욕에서 비커를 꺼내어 실온에 1시간 방치하여 침전시킨다. 미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 78% 에탄올 15 mL를 가하여 분산시킨 후 흡인여과하여 셀라이트층이 고르게 형성되도록 한다. 이에 시험용액을 넣어 여과하고 용기의 잔류물을 78% 에탄올로 씻어 넣어 준다.

잔사는 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각각 15 mL씩 2회 씻는다. 아세톤이 잔류하지 않도록 충분히 흡인시킨 후 105℃의 건조기에서 하룻밤 건조시키고 데시케이터에서 1시간 항량으로 한 후 무게를 달아 여과기와 셀라이트의 무게를 뺀다.

하나의 여과기 잔사에 대하여 질소량을 측정하고 이에 6.25를 곱하여 단백질량으로 하고, 또 다른 하나의 여과기 잔사를 525℃에서 5시간 회화시킨 후 회분량을 구한다. 검체를 제외한 공시험을 하여 8)에 따라 총식이섬유의 함량을 구한다.

6) 물불용성식이섬유의 정량

미리 셀라이트를 넣어 항량시킨 유리여과기에 물 3 mL를 가하여 분산시킨 후 흡인여과하여 셀라이트층을 고르게 한다. 이에 검액을 여과하고 잔류물은 70℃의 물 10 mL로 2회 씻는다. 여액 및 세척액은 합하여 600 mL 비커에 모아 7)항의 수용성식이섬유 정량용으로 한다.

잔류물은 곧바로 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각 15 mL씩 2회 세척한다. 여과기 잔사를 5) 총식이섬유의 정량의 “…105℃의 건조기에서…” 이하에 따라 시험한다.

7) 수용성식이섬유의 정량

앞의 6)항에서 얻어진 여액 및 세척액에 60℃의 95% 에탄올을 4배량 가하거나 여액을 물로 80 g으로 한 후 60℃의 95% 에탄올 320 mL를 가한다. 이를 한 시간 방치하여 침전물을 형성시킨다.

이를 5)총식이섬유의 정량에 따라 시험하고 8)에 따라 수용성식이섬유의 함량을 구한다.

8) 함량계산

공시험값 B(mg) ＝ 공시험평균잔사무게(mg)-PB-AB

PB：공시험 단백질량(mg)

AB：공시험 회분량(mg)

식이섬유함량(%) ＝	(검체의 평균잔사 무게(mg)-P-A-B)	× 100
	검체의 평균 무게(mg)

P ：단백질량(mg)

A：회분량(mg)

B ：공시험값(mg)

총식이섬유함량은 5) 총식이섬유의 정량에 따라 구하거나 6) 물불용성식이섬유의 정량 및 7) 수용성식이섬유의 정량에 따라 구하여 얻어진 값을 합하여 구할 수 있다.

나. 제2법

1) 시험법 적용범위

본 시험법은 주로 수용성 섬유소를 함유한 경우에 적용한다.

2) 장치

가) 액체크로마토그래프

3) 시약 및 시액

가) 텀아밀용액：Novo사 No. 120 L(냉장보존)

나) 프로테아제：Sigma사 No. A-3910(냉장보존)

다) 아밀로글루코시다아제：Sigma사 No. A-9913(냉장보존)

라) 글루코오스정량용시약：교화 메덱스사 제품 데타미나-GL-E

마) 이온교환수지：Amberlite IRA-68(OH형)

Amberlite 200(H형)

4) 시험용액의 조제

가) 효소처리액의 조제

검체 1 g(필요한 경우 에테르 등으로 탈지한다)을 200 mL 비커에 정확히 취하고 증류수 50 mL를 가하여 용해한 후, 0.1 N 수산화 나트륨용액으로 pH 6.0으로 조정한다. 여기에 텀아밀용액 0.1 mL를 가하고, 알루미늄박으로 뚜껑을 하여 끓는 수욕에서 30분간 놓아둔다(5분간격으로 교반). 실온에서 냉각 후 0.1 N 수산화나트륨용액으로 pH 7.5±0.1로 조정한다. 다음 프로테아제 5 mg을 가하고 다시 알루미늄박으로 뚜껑을 해서 60℃수용액에서 30분간 진탕한다.

실온으로 냉각한 후 0.1 N 염산용액으로 pH 4.5± 0.2로 조정한다. 여기에 아밀로글루코시다아제 0.1 mL를 가하고 알루미늄박으로 뚜껑을 하여 60℃ 수용액 중에서 30분간 진탕한 후 수용액 중에서 10분간 가열하여 효소를 실활시킨다. 실온에서 냉각하고 100 mL용 메스플라스크에 옮겨 물로 정용한 액을 효소처리액으로 한다.

나) 효소처리액중의 포도당 정량

데타미나-GL-E로써 효소처리액중의 포도당량을 측정하거나 1.1.4.1 당질 1.1.4.1.4 기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량에 따라 효소처리액중의 포도당량을 구한다.

다) 시험용액의 조제

효소처리액 50 mL를 취하여 다음과 같은 조건을 갖춘 이온교환수지칼럼에 SV1.0으로 통과시켜 탈염한 후 칼럼용출액 200 mL를 감압농축하여 20 mL용 메스플라스크에 옮기고 정용한다. 이 액을 0.20 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

주：SV 1.0은 공간속도로 충전제부피(cm3)로 시간단위당 용출액을 나누어 준 값

(1) 탈염조건

(가) 이온교환수지 : Amberlite IRA-68(OH형) Amberlite-200(H형)을 1：1의 비율로 혼합한 것

(나) 칼럼크기：유리관, 20 mm×300 mm

(다) 용리액：물

(라) 수지량：50 mL

5) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 검출기：시차굴절계검출기

(2) 칼럼：길이 300 mm, 안지름 8.0 mm MCL-GEL CK 08 EC 스텐인리스관 상당품

(3) 이동상：물

(4) 유속：0.4 mL/분

6) 정량시험

4) 나)에 의하여 측정된 효소처리액 중의 포도당중량의 4) 다)의 시험용액 20 μL를 주입하여 얻은 포도당과 난소화부의 머무름시간과 피크 면적을 이용하여 다음 식으로 효소처리액중의 난소화부 중량을 구한다.

가) 계산방법

난소화부 중량(mg) ＝	난소화부의 피크 면적	× 포도당 중량(mg)
	포도당의 피크 면적

그리고 다음 식에 의거 검체 중의 난소화부 함량(식이섬유소)을 산출한다.

난소화부함량(%) ＝	난소화부 중량(mg)	× 100
	검체 채취량(mg)

2. 식품 중 식품첨가물시험법

2.1 ～ 2.4 (생  략)

2.5 아황산, 차아황산 및 그 염류

2.5.1 (생  략)

2.5.2 정량시험

가. 모리어-윌리암스변법

< 신  설 >

1) (생  략)

2) (생  략)

3) (생  략)

4) (생  략)

5) (생  략)

< 신  설 >

3. 미생물 시험법

3.1 ～ 3.3 (생  략)

3.4 배지 및 시액

3.4.1 배지

1) ～ 52) (생  략)

53) 세균수 건조필름배지

54) 대장균군 건조필름배지

55) 대장균 건조필름배지

56) ～ 68) (생  략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

3.4.2 (생  략)

3.5 세균수

3.5.1 일반세균수

가. (생  략)

나. 건조필름법

1) 시험조작

3.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL를 세균수 건조필름배지(배지 53)에 접종한 후 35～37℃에서 24～48시간 배양한 후 생성된 붉은 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 일반세균수로 한다.

3.5.2 ～ 3.5.4 (생  략)

3.6 (생  략)

3.7 대장균군

3.7.1 (생  략)

3.7.2 정량시험

가. ～ 나. (생  략)

다. 건조필름법

3.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL를 대장균군 건조필름배지(배지 54)에 접종한 후, 35~37℃에서 24±2시간 배양하여 생성된 붉은 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하고, 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군 수를 산출한다.

3.8 대장균

3.8.1 (생  략)

3.8.2 정량시험

가. (생  략)

나. 건조필름법

3.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 단계 희석액 1 mL를 대장균 건조필름배지(배지 55)에 접종한 후 잘 흡수시키고, 35~37℃에서 24～48시간 배양한 후 생성된 푸른 집락 중 주위에 기포를 형성하고 있는 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균수를 산출한다.

3.9 유산균수

3.9.1 유산간균 및 구균

유산균수의 측정방법은 3.5.1 일반세균수 측정방법에 준하여 시험하되 시험용액 제조 희석액은 멸균생리식염수(시액 2) 또는 펩톤식염완충액(시액 7)을 사용한다. 또한 배지는 BCP첨가 평판측정용배지(배지 11)를 사용하여 35~37℃에서 72±3시간 배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계수한다.

3.9.2 ∼ 3.9.3 (생  략)

3.10 ∼ 3.12 (생  략)

3.13 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus)

<신  설>

1) ～ 2) (생  략)

3)  분리배양된 평판배지상의 집락을 TSI 사면배지(배지 32), LIM 반유동배지(배지 18), 보통한천배지(배지 8)에 각각 접종한 후 35～37℃에서 18～24시간 배양한다.

(생  략)

<신  설>

3.14 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)

3.14.1 (생  략)

3.14.2 정량시험법

1) 균수 측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 희석액을 가한 후 1~2분간 저속으로 균질화 한 후 10배 단계 희석액을 만든다. 시험용액 및 단계별 희석액 1 mL씩을 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균적으로 취하고 43～45℃로 유지한 TSC 한천배지(배지 41) 10～15 mL를 가하여 좌우로 돌리면서 잘 혼합한 후 응고시킨다.

(생  략)

2) ～ 3) (생  략)

3.15 ～ 3.26 (생  략)

4.～ 5. (생  략)

6. 식품 중 자연독소 시험법

6.1 곰팡이독소

6.1.1 (생  략)

6.1.2 아플라톡신 M1

1) 시험법의 적용범위

원유 및 우유

2) 분석원리

검체 중의 아플라톡신 M1을 C18 카트리지에 흡착시킨 후 에테르로 용출시키고 정제용칼럼으로 정제하여 트리플루오로초산(trifluoroacetic acid)으로 유도체화한 것을 형광검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) (생  략)

나) 카트리지 : C18 Sep-Pak 또는 이와 동등한 것

다) 정제용 칼럼 : 폴리프로필렌제 칼럼(0.8 × 4 cm)으로서 Bio-Rad Cat. No. 731-1550 또는 이와 동등한 것

라) 실릴화한 바이알

4) 시약 및 시액

가) ～ 다) (생  략)

라) 표준용액：표준원액을 벤젠․아세토니트릴(90:10, v/v) 혼합용액으로 녹여 50 ng/mL되게 한다.

마) 실리카겔：칼럼크로마토그래피용 실리카겔(입자크기 : 0.040～0.063 mm)을 105℃에서 1시간 가열하여 식힌 후 이에 물을 1% 첨가하여 혼합한 다음 밀봉하여 12시간 평형시킨다.

바) (생  략)

5) 시험 용액의 조제

가) 추출

시료 20 g을 정밀히 달아 약 80℃ 물 20 mL와 균질하게 혼합하여 총 40 mL가 되게 한 후 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL를 통과시켜 활성화시킨 카트리지에 진공펌프를 이용하여 약 30 mL/분의 속도로 통과시킨다. 5% 아세토니트릴 용액 10 mL로 카트리지를 세척하고 카트리지에 남아있는 용액을 진공펌프를 이용하여 제거한다. 카트리지에 아세토니트릴 150 μL를 넣어 약 30초간  흡수시킨다.

나) 정제

정제용 칼럼에 실리카겔 약 1 g을 가한 후 진공펌프를 이용하여 충전하고 그 위에 무수황산나트륨 1 g을 다시 진공펌프를 이용하여 충전한 다음 에테르 5 mL를 흘려 에테르가 무수황산나트륨의 상층에 약간 남을 때까지 유출시킨다. 앞의 추출과정에서 사용한 카트리지를 정제용 칼럼 위에 위치하도록 하고 카트리지에 에테르 7 mL를 흘려 용출되는 액을 정제용 칼럼에 떨어뜨려 진공펌프를 이용하여 약 10 mL/분의 속도로 흡착시킨다. 에테르 2 mL를 흘려 칼럼을 세척한 다음 디클로로메탄․이소프로필알코올(95:5, v/v) 혼합용액 7 mL를 진공펌프를 이용하여 약 10 mL/분의 속도로 용출시킨다. 용출액을 35℃ 이하에서 질소기류하에 감압․건고시킨 후 잔류물을 소량의 디클로로메탄으로 녹인 후 실릴화한 바이알에 옮겨 50℃ 이하에서 질소로 건고시킨다.

다) 유도체화

잔류물에 헥산 200 μL와 트리플루오로초산 200 μL를 가하여 5~10초간 심하게 흔들어 섞고 40℃의 항온수조에서 10분간 반응시킨 후 질소로 건고시킨다. 여기에 25% 아세토니트릴 용액 2 mL를 넣고 심하게 흔들어 섞은 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 칼럼 : Spherisorb 5 ODS 2(0.4 × 25 cm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 물 ․이소프로필알코올 ․아세토니트릴(80:12:8, v/v/v)

(3) 검출파장 : 여기파장 365 nm(또는 360 nm), 형광파장 > 400 nm

(4) (생  략)

(5) 주입량 : 5 ~ 20 μL

나) 검량선 작성

표준용액의 일정량(50 ~ 500 μL)을 각각 취하여 질소로 건고시킨 후 앞의 5) 시험용액의 조제 다) 유도체화에 따라 조작하여 검량선을 작성한다.

<신  설>

7) (생  략)

8) (생  략)

가) 계산

아플라톡신 M1의 함량(μg/kg) = C/S

C：검량선에서 구한 아플라톡신 M1의 농도(ng)

S : 시료 채취량(g)

<신  설>

<신  설>

6.1.3 ～ 6.1.7 (생  략)

6.2 ～ 6.4 (생  략)

7. 식품 중 유해물질시험법

7.1 중금속 시험

7.1.1 (생  략)

7.1.2 금속별 시험

7.1.2.1 ～ 7.1.2.2 (생  략)

7.1.2.3 비소(As)

1) 시험용액의 조제

가) (생  략)

나) 건식회화법

7.1.2.1 납 1) 시험용액의 조제 나) 건식회화법에 따른다.

다) (생  략)

7.2 방사능

1) ～ 3) (생  략)

4) 검체조제

가) 직접법

(1) 비가식부(․곡류 : 껍질 등, ․채소류 : 뿌리, 토사, 고엽 등, ․식육류, 어패류 및 알류 : 뼈, 껍질 등 )가 있을 경우 이를 제거하고 물로 세척할 경우에는 물기를 제거한 후 분쇄기로 갈아 균질화하여 측정용기에 넣고 무게를 정밀히 달아 밀봉하여 측정한다.

(생  략)

(2) ～ (4) (생  략)

나) ～ 다) (생  략)

5) (생  략)

8. (생  략)

9. 일반시험법

9.1 (생  략)

9.2 이물

9.2.1 일반이물

가. ∼ 라. (생  략)

마. 금속성이물(쇳가루)

1) ∼ 2) (생  략)

3) 시험조작

가) 분말제품, 환제품, 액상 및 페이스트제품

(1) 검체(분말제품 및 환제품 500g, 액상 및 페이스트제품 1 kg)를 증류수 5～ 6 L와 혼합 후 (환제품의 경우 2시간이상 정치하여 검체를 으깸) 비닐을 씌운 봉자석(10,000 가우스 자력)으로 10분간 저어 쇳가루를 모은 후 건조하여 무게를 측정한다.

(2) ∼ (3) (생  략)

[별표 1]

“식품에 사용할 수 있는 원료”의 목록

1. 식물성 원료

	품목명	이명 또는 영명	학명	사용부위
(생 략)
70	대마(大麻)	삼, Hemp	Cannabis sativa Linné	껍질이 완전히 제거된 씨앗※(마인)
71 ∼177	(생 략)
178	속단	-	Phlomis umbrosa Turcz.	어린잎, 뿌리
179 ∼331	(생 략)

[별표 2] (생  략)

[별표 3] “식품에 사용할 수 없는 원료”의 목록

1. (생  략)

2. 동물성 원료

	품목명	이명 또는 영명	학 명	부 위
1∼2	(생 략)
3	담즙, 담낭	-	-	-
4	(생 략)
5	멧돼지쓸개	-	-	-
6∼17	(생 략)

3. 기타

	품목명	이명 또는 영명	학 명	부 위
1	곰부차	Mushroom tea, tisane, Kombucha	해당사항없음	차형태로 섭취
2∼6	(생 략)

제 1. 총칙

제 2. 식품일반에 대한 공통기준 및 규격

1. 기준 및 규격의 적용

(현행과 같음)

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) -------------------------

------------------------

축산물위생관리법 ---------

------------------------

------------------------

-----.

2. 식품원료 기준

1) 원료 등의 구비요건

(1) ∼ (3) (현행과 같음)

(4) ------------------------

-------------------------

-------------------------

-------------------------

-------------------------

-------------- 「축산물위생관리법」 -----------------

-----.

(5) ∼ (17) (현행과 같음)

3. ～ 4. (현행과 같음)

5. 식품일반의 기준 및 규격

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 중금속 기준

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) 농산물의 ------------

(4) (현행과 같음)

(5) 축산물의 중금속 기준

(6) ～ (7) (현행과 같음)

6) 식품조사처리 기준

식품조사(Food Irradiation)처리 기술이란 감마선, 전자선에서 방출되는 에너지를 복사(radiation)의 방식으로 식품에 조사하여 식품 등의 발아억제, 살균, 살충 또는 숙도조절에 사용하는 기술로, 선종과 사용목적 또는 처리방식(조사)에 따라 감마선 살균, 전자선 살균, 감마선 살충, 전자선 살충, 감마선 조사, 전자선 조사 등으로 구분하거나, 통칭하여 방사선 살균, 방사선 살충, 방사선 조사 등으로 구분할 수 있다.

(1) 식품조사처리에 사용할 수 있는 선종은 감마선 또는 전자선으로 한다.

(2) 감마선을 방출하는 선원으로는 60Co을 사용할 수 있고, 전자선을 방출하는 선원으로는 전자선 가속기를 사용할 수 있다.

(3) 60Co에서 방출되는 감마선 에너지를 사용할 경우 식품조사처리가 허용된 품목별 흡수선량을 초과하지 않도록 하여야 한다.

(4) 전자선 가속기를 사용하여 식품조사처리를 할 경우 방출되는 에너지량을 10 MeV이하로 조사처리 하여야 하며, 식품조사처리가 허용된 품목별 흡수선량을 초과하지 않도록 하여야 한다.

(5) 식품조사처리는 승인된 원료나 품목 등에 한하여 위생적으로 취급·보관된 경우에만 실시할 수 있으며, 발아억제, 살균, 살충 또는 숙도조절이외의 목적으로는 식품조사처리기술을 사용하여서는 아니 된다.

(6) 조사처리된 식품은 다음의 기준에 적합하여야 한다.

품 목	조사목적	선량(kGy)
감자, 양파, 마늘	발아억제	0.15 이하
밤	살충․발아억제	0.25 이하
생버섯 및 건조버섯	살충․숙도조절	1 이하
난분 곡류, 두류 및 그 분말 전분	살균 살충․살균 살균	5 이하 5 이하 5 이하
건조식육 및 어패류 분말 된장, 고추장, 간장분말 건조채소류 효모·효소식품 조류식품 알로에 분말 인삼(홍삼 포함) 제품류	살균 살균 살균 살균 살균 살균 살균	7 이하 7 이하 7 이하 7 이하 7 이하 7 이하 7 이하
건조향신료 및 이들 조제품 복합조미식품 소스류 침출차 분말차 환자식	살균 살균 살균 살균 살균 살균	10 이하 10 이하 10 이하 10 이하 10 이하 10 이하

① 허용대상 식품별 흡수선량

(7) 한번 조사한 식품은 다시 조사하여서는 아니되며 조사식품을 원료로 사용하여 제조․가공한 식품도 다시 조사하여서는 아니된다.

(8) 조사식품은 용기에 넣거나 또는 포장한 후 판매하여야 한다.

7) (현행과 같음)

8) 곰팡이독소 기준

(1) 총 아플라톡신(B1, B2, G1 및 G2의 합)

대 상 식 품	기준 (㎍/kg)
(현행과 같음)	(현행과 같음)
(현행과 같음)
장류 ---------------
(현행과 같음)
(현행과 같음)
(현행과 같음)
(현행과 같음)	(현행과 같음)

(2) ～ (7) (현행과 같음)

9) ～ 17) (현행과 같음)

6.  (현행과 같음)

제 3. ～ 제 4. (현행과 같음)

제 5. 식품별 기준 및 규격

1. ～ 10. (현행과 같음)

11. 식육 또는 알가공품

1) (현행과 같음)

2) 원료 등이 구비요건

(1) ------------------ 축산물위생관리법 ---------------

-------------------------

-------------.

3) ～ 6) (현행과 같음)

12. ～ 18. (현행과 같음)

19. 특수용도식품

19-1 영아용 조제식

1) 정의

(현행과 같음)

---- 축산물위생관리법 -------

----------------.

2) ～ 6) (현행과 같음)

19-2 성장기용 조제식

1) 정의

(현행과 같음)

----축산물위생관리법 --------

----------------.

2) ～ 6) (현행과 같음)

19-3 ～ 19-7 (현행과 같음)

20. 장류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (2) (현행과 같음)

< 삭  제 >

(3) (현행 (4)와 같음)

(4) -------------------------

-------------------------

-------------------------

아니 된다.

소르빈산 소르빈산칼륨 소르빈산칼슘	--------(---------------- 한식된장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장(비건조 제품에 한함), 혼합장에 한한다)
(현행과 같음)	(현행과 같음)
(현행과 같음)	(현행과 같음)

6) 시험방법

(1) ～ (2)  (현행과 같음)

< 삭  제 >

(3) ～ (4) (현행 (4) ～ (5)와 같음)

21. ～ 23. (현행과 같음)

24. 젓갈류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) -------∶-----------아니

된다.(다만, 명란젓은 제외한다)

(4) ～ (5) (현행과 같음)

25.～ 28. (현행과 같음)

29. 기타식품류

29-1 ～ 29-17 (현행과 같음)

29-18 즉석섭취·편의식품류

1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 규격

(1) ～ (4) (현행과 같음)

(5) 장염비브리오 : g당 100 이하(-----------------------------------------------).

(6) ～ (8) (현행과 같음)

6) (현행과 같음)

29-19 ～ 29-23 (현행과 같음)

제 6. 수산물에 대한 규격

1. (현행과 같음)

1) 수산물

(1) ～ (3) (현행과 같음)

(4) ----------------------- ----------------------수산물에서는 살모넬라(Salmonella spp.), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)가 음성, 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 1 g당 100 이하이어야 한다.

(5) ～ (6) (현행과 같음)

2) ～ 4) (현행과 같음)

2. (현행과 같음)

제 7. (현행과 같음)

제 8. 식품접객업소(집단급식소 포함)의 조리식품 등에 대한 기준 및 규격

1. ～ 3. (현행과 같음)

4. 규격

가) 조리식품 등

(1) ～ (4) (현행과 같음)

(5) 식중독균 : ---------------  ------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------

------------------------- ---------------------------------------------------------------------------------------------- 등 식중독균이 검출되어서는 아니되며, 장염비브리오균(Vibrio parahaemolyticus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) g당 100 이하, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) g당 10,000 이하이어야 한다. 다만, 조리과정 중 가열처리를 하지 않거나 가열 후 조리한 식품의 경우 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 g당 100 이하이어야 한다.

(6) (현행과 같음)

나) ～ 다) (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

제 9. (현행과 같음)

제 10. 일반시험법

1. (현행과 같음)

1.1 일반성분시험법

1.1.1 ～ 1.1.3 (현행과 같음)

1.1.4 탄수화물

1.1.4.1. 당질

1.1.4.1.1 ～1.1.4.1.3 (현행과 같음)

1.1.4.1.4 기기분석법에 의한 당류의 정성 및 정량

1) (현행과 같음)

2) 장치

가)  액체크로마토그래프-시차굴절계검출기(RI)

3) 시약 및 시액

가) 당류 혼합 표준용액

각각의 당류 표준품(과당, 포도당, 설탕, 맥아당, 유당)을 60℃ 진공오븐에서 12시간 건조하여 각각을 증류수에 녹여 혼합 조제한다. 이때 검량선용 표준용액의 농도는 시험용액의 피크면적이 각 당류 표준물질의 직선성을 만족할 수 있도록 조정하여 조제한다.

나) 이동상

아세토니트릴과 증류수를 80:20의 부피비율로 혼합하여 조제한다. 이때 이동상은 유리섬유필터(Whatman GF/F 0.7um 또는 이와 동등한 것) 또는 나일론 66필터(Pall 0.45um 또는 이와 동등한 것)로 여과한 후, 사용 전에 초음파 처리하여 가스를 제거하고 사용한다.

※ 아세토니트릴 및 증류수를 테프론과 셀룰로오즈 에스테르 멤브레인 필터로 각각 여과하여 사용할 수 있다.

4) 시험용액의 조제

가) 시료 중 지방 제거

시료를 균질화한 후, 50 mL 원심분리관에 균질화된 검체 5 g을 정밀히 달아 넣고 25 mL 석유에테르로 분산시킨다. 이를 2,000 rpm에서 약 10분간 원심분리한 후, 고형분이 제거되지 않도록 조심스럽게 석유에테르를 제거한다. 이를 반복하고 질소를 이용하여 석유에테르를 완전히 증발시킨다. 이때, 지방이 없는 것으로 확인된 시료의 경우 시료 중 지방 제거과정을 생략한다.

나) 당류의 추출

지방이 제거된 시료에 증류수 25 mL 혹은 50% 에탄올 용액을  가하여 무게를 확인한다. 이를 85℃ 수조에서 25분간 가온하여 당류를 추출하고 실온으로 냉각하여 최초 기록한 추출용매의 무게가 될 수 있도록 추출용매를 첨가한다. 이를 0.45 μm의 나일론 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 이때, 시험용액이 혼탁할 경우, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 여과한다.

5) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 조건

※ (3)이동상 및 (4)유속의 조건은 (1)컬럼의 용량요인과 분해능을 만족하는 범위에서 조정할 수 있다.

(1) 칼럼：길이 300 mm, 안지름 4 mm, μ-Bondapak Carbohydrate칼럼 또는 이와 동등한 것

※ 칼럼은 다음의 용량요인과 분해능을 만족해야 한다.

- 과당에 대한 용량요인(Capacity factor, K') = (tR-t0)/t0 ≥ 5

․tR : 주입 후 과당의 최대 피크높이까지의 머무름 시간

․t0 : 주입 후 용매의 최대 피크높이까지의 머무름 시간

- 과당과 포도당의 분해능(Resolution, Rs) = (t2-t1)/0.5(tw1+tw2) ≥ 1

․t1 : 주입 후 과당의 최대 피크높이까지의 머무름 시간

․t2 : 주입 후 포도당의 최대 피크높이까지의 머무름 시간

․tw1 : 과당의 베이스라인에서의 피크넓이(Width)

․tw2 : 포도당의 베이스라인에서의 피크넓이(Width)

(2) 검출기：시차굴절계검출기(RI)

(3) 이동상 : 아세토니트릴:증류80:20, w/w)

(4) 유속：1.0 mL/분

(5) 칼럼온도：실온

6) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10 μL씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 각각의 당류의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 검체 중 당류의 함량(mg/100 g)을 산출한다. 이때 표준용액 검량선의 농도범위는 시험용액 중 각각의 당류의 농도에 대한 직선성이 만족될 수 있도록 조정한다.

가) 계산방법

당함량(mg/100 g) ＝ S ×	a×b	×	100
	검체채취량(g)		1,000

S：시험용액 중의 당류의 농도(μg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：희석배수

1.1.4.2 (현행과 같음)

1.1.4.3. 식이섬유

가. 효소-중량법

1) 시험법 적용범위

가공식품, 과일 및 채소 등에 적용한다.

2) 분석원리

건조된 시료 두 개를 준비하고 이를 내열성 α-아밀라아제, 프로테아제, 아밀로글루코시다제 효소로 연속적으로 분해하여 전분과 단백질을 제거한다. 이때 10% 이상의 지방을 함유한 식품은 건조 전에 지방을 제거하여 시험한다. 총 식이섬유(TDF) 정량은 효소분해물에 녹아 있는 식이섬유를 에탄올로 처리하여 침전시켜 여과하고 에탄올과 아세톤으로 세척한 후, 건조하여 그 무게를 확인한다. 물불용성 식이섬유(IDF)는 효소분해물을 여과하여 잔사를 따뜻한 물로 세척하고 그 무게를 확인하여 정량한다. 수용성식이섬유(SDF)는 IDF의 전처리과정에서 얻은 여과액과 세척액을 합하여 에탄올로 침전시킨 후 여과하여 잔류물을 건조하고 무게를 확인하여 정량한다. 총 식이섬유, 물불용성 및 수용성식이섬유 함량계산 시 잔사의 무게 중 단백질 및 회분량은 보정해준다.

3) 장치

가) 비커 : 400 또는 600 mL Tall-form.

나) 유리여과기 : 기공 40～60 um(ASTM 기준)의 용융 유리디스크가 있는 Pyrex 60 mL(Corning No. 36060 Buchner 또는 이와 동등한 것). 525℃에서 하룻밤 동안 회화하고 회화로 온도가 130℃까지 떨어지면 유리여과기를 상온에서 방냉한 후, 2% 세척액에 1시간 동안 담근 후 물로 씻고 증류수로 헹군 다음 아세톤 15 mL을 사용하여 마지막으로 세척하고 바람을 불어 대기 중 방치하여 건조시킨다. 건조된 유리여과기에 규조토 약 1.0 g을 넣고 130℃에서 항량한 후, 데시케이터에서 1시간 동안 실온에 방냉하여 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg까지 칭량하여 기록한다.

다) 진공장치 : 조절장치를 갖춘 진공펌프나 아스피레이터, 1L 용량의 여과용 가지달린 플라스크 및 여과용 플라스크에 사용하는 고무 아답터

라) 진탕 항온수조 : 98±2℃까지 가온 및 온도의 유지가 가능하고 60℃로 일정하게 온도를 유지할 수 있는 것.

마) 저울 : 0.1 mg 까지 측정이 유효한 것.

바) 회화로 : 525±5℃ 유지할 수 있는 것.

사) 오븐 : 105℃와 130±3℃ 유지할 수 있는 것.

자) 데시케이터 : 실리카겔이나 이와 동등한 건조제가 있는 것. 건조제는 필요 시 130℃에서 하룻밤 동안 건조하여 사용한다.

차) pH meter : 온도 보정이 되고 pH 4, 7, 10 버퍼용액으로 표준화 된 것.

카) 피펫 : 일회용 팁이 사용가능한 것으로 용량 100～300 uL 및 5 mL.

타) 디스펜서 : 15±0.5 mL용 3개(78% ethanol, 95% ethanol, acetone용), 40±0.5 mL용 1개(버퍼용)

파) 자석 교반기 및 마크네틱바

4) 시약 및 시액

가) 증류수 : 3차 증류수

나) 에탄올 수용액

(1) 85% : 1L 정용 플라스크에 95% 에탄올 895 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

(2) 78% : 1L 정용 플라스크에 95% 에탄올 821 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

다) 내열성 α-아밀라아제 용액 : 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로 글리세롤이 없을 것, 0～5℃에서 보관하며 사용한다(Sigma사 Catalog No. A 3306 또는 이와 동등한 것)

※ (1) 가용성 전분을 기질로 하는 Nelson/Somogyi reducing sugar 방법에 기초하는 것 : 10,000±1000 units/mL(1 unit: pH 6.5, 40oC에서 1분당 1 μmole reducing sugar equivalents를 만드는 데 필요한 효소의 양)

(2) 내열성 α-글루코시다제의 존재 시 기질로 p-nitrophenyl -maltosaccharide를 사용하는 Ceralpha방법에 기초한 것 : 3,000±300 Ceralpha units/mL (1 unit: pH 6.5, 40oC에서 1분당 1 μmole p-nitrophenol을 만드는 데 필요한 효소의 양)

라) 프로테아제 효소용액: 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소 활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하고 MES/TRIS 완충액으로 희석하여 50 mg/mL로 사용 시 조제한다(Sigma사 Catalog No. P 3910 또는 이와 동등한 것)

※ (1) Casein assay: 300～400 units/mL (1 unit: pH 8.0, 40oC에서 가용성 casein으로부터 1분당 1 umole tyrosine equivalents를 가수분해하는데 필요한 효소의 양) ; 7～15 units/mg (1 unit: pH 7.5, 37oC에서 casein으로부터 1분당 1.0 umole tyrosine에 해당하는 색 (Folin-Ciocalteau reagent)을 내는데 필요한 효소의 양)

(2) Azo-casein assay : 300～400 units/mL (1 unit endo-peptidase activity: pH 8.0, 40oC에서 가용성 casein으로부터 1분당 1 μmole tyrosine equivalents를 가수분해하는데 필요한 효소의 양)

마) 아밀로글루코시다제 용액 : 아래의 효소분해능을 만족하거나 5)효소 활성 검증 시 회수율을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하며 사용한다. 글리세롤이 없을 것.(Sigma사 Catalog No. A 9913 또는 이와 동등한 것)

※ (1) Starch/glucose oxidase-peroxidase 방법 : 2,000～3,300 units/mL (1 unit: pH 4.5, 40oC에서 1분당 1 μmole 포도당을  만드는 데 필요한 효소의 양)

(2) PNPBM (p-nitophenyl β-maltosidase) 방법 : 130～200 units/mL (1 unit: β-글루코시다제가 과량 존재할 때, 40oC에서 1분당 p-nitrophenyl β-maltosidase가 1 μmole p-nitrophenol을 만드는 데 필요한 효소의 양).

바) 규조토(Diatomaceous earth) : 산세척한 것(Sigma사 Catalog No. C 8656 또는 Fisher Scientific사 Catalog No. C-211, 산세척 또는 그와 동등한 것)

사) 세척용액 : 실험실용 액체 계면활성 세정제(International products사의 Micro 혹은 그와 동등한 것)를 2% 수용액으로 조제한다.

아) MES : 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid(Sigma사 Catalog No. M-8250 또는 이와 동등한 것)

자) TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Sigma사 Catalog No. T-1503 또는 이와 동등한 것)

차) MES-TRIS 완충용액(0.05M MES, 0.05M TRIS, 24℃에서 pH 8.2) : MES 19.52 g과 TRIS 12.2 g을 물 1.7 L에 녹인 후 6M 수산화나트륨용액을 가하여 pH 8.2로 조절한 후, 물을 가하여 2 L가 되게 조제한다. (24℃에서 pH 8.2로 조절하는 것이 중요하다. 만약 버퍼용액의 온도가 20℃이면 pH 8.3으로 조절하고, 28℃이면 pH 8.1로 조절한다.)

카) 염산용액(0.561M) : 1 L 정용 플라스크에 물 약 700 mL를  넣고 6M HCl 93.5 mL을 혼합한 후 증류수로 표선까지 채워 조제한다.

5) 효소 활성 검증

효소 활성은 표 1.의 표준시료를 가. 효소-중량법에 따라 분석 시 총 식이섬유 함량에 대한 회수율을 만족하여야 한다. 이때 펙티나제, 헤미셀룰라제, β-글루카나제의 오염이 존재하지 않는지를 팩틴, 아라비노갈락탄, β-글루칸으로 확인하여야 한다. 개봉한 효소는 최대 6개월 마다 활성을 검증하여 사용한다.

표 1. 표준시료에 대한 식이섬유 회수율 만족범위

표준시료	활성검증 대상효소	표준시료 사용량, g	회수율, %
Wheat starch1)	내열성 α-아밀라아제 + 아밀로글루코시다제	1.0	0～1
Corn starch2)	내열성 α-아밀라아제 + 아밀로글루코시다제	1.0	0～1
Casein3)	프로테아제 효소	0.3	0～1
Pectin4)	팩티나제	0.1	95～100
Arabinogalactan5)	헤미셀룰라제	0.1	95～100
β-Glucan6)	β-글루카나제	0.1	95～100

1) Sigma사 Catalog No. S 1514 혹은 이와 동등한 것

2) Sigma사 Catalog No. S 2388 혹은 이와 동등한 것

3) Sigma사 Catalog No. C 7906 혹은 이와 동등한 것

4) Sigma사 Catalog No. P 7536 혹은 이와 동등한 것

5) Sigma사 Catalog No. A 9788 혹은 이와 동등한 것

6) Sigma사 Catalog No. G 7391 혹은 이와 동등한 것

6) 시험용액의 조제

가) 시료 균질화

건조된 시료의 총 식이섬유를 확인하기 위해서 시료를 균질화한 후, 70℃ 진공오븐에서 하룻밤 동안 건조시킨다. 시료를 데시케이터에서 방냉하고 0.3～0.5 mm mesh가 되도록 건식 분쇄한다. 열처리를 할 수 없는 시료의 경우 분쇄하기 전에 냉동건조한다. 지방함량이 높다면 (10% 이상) 분쇄하기 전에 석유에테르로 탈지한다(시료 1 g당 25 mL 씩 3번 처리). 지방제거로 인한 무게 손실을 기록하고 이에 대한 총 식이섬유 함량(%)을 보정한다. 분석 전까지 건조-분쇄된 시료는 마개가 있는 병에 담아 데시케이터에서 보관한다(만약 시료의 지방함량을 모른다면, 식이섬유를 측정하기 전에 탈지한다). 당 함량이 높은 제품은 식이섬유 측정 전에 85% 에탄올(10 mL/g)로 2～3회 추출한 다음 상등액을 제거하고 40℃에서 하룻밤 동안 건조한다.

나) 효소분해

4개의 400 mL(또는 600 mL) tall-form 비커에 시료 1.000 ± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에  MES-TRIS 완충용액 40 mL씩 가하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산될 때까지 자석 교반하여 혼합한다. 저속으로 혼합하면서, 내열성 α-아밀라아제 용액 50 μL을 첨가한다. 비커를 알루미늄박으로 덮은 후 95∼100℃ 수욕에서 15분 동안 계속 교반하면서 반응한다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다(보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비커를 꺼내어 60℃로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비커의 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 프로테아제 효소용액 100 μL을 각 비커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비커를 덮고 60±1℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 알루미늄박을 제거한 후 비커를 잘 교반하면서 0.561M HCl 5 mL을 넣어준다. 60℃에서 1M NaOH, 1M HCl를 사용하여 용액을 pH 4.0-4.7로 조정한다(※ 참고 : pH는 낮은 온도에서 올라가기 때문에 60℃에서 pH를 조정하고 확인하는 것이 중요하다. 대부분의 곡류, 채소 시료의 경우, pH 조정이 없이도 pH조건을 만족할 수 있으므로 이전에 확인된 시료의 경우, pH 조정 과정을 생략할 수 있다. 단, 공시험의 pH를 예비단계로 확인하고 만약 공시험의 pH가 올바른 범위를 벗어난다면, 반드시 시료의 pH를 점검한다). 비커를 교반하면서 아미노글루코시다제 용액 300 μL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60±1℃ 수욕에서 교반하면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

7) 총 식이섬유(TDF) 함량 측정

실온 기준 225 mL 95% 에탄올을 60℃에서 효소 분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 1시간 침전시킨다. ☆미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에  78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약스푼를 이용하여 비커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 78% 에탄올, 95% 에탄올, 아세톤 순으로 각각 15 mL씩 2회 잔류물을 씻는다. ★105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 동안 건조시키고, 데시케이터에서 1시간 동안 방냉하여 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

8) 물불용성 식이섬유(IDF) 측정

미리 규조토를 넣어 항량하여 준비한 유리여과기에 물 3 mL을 가하여 규조토를 적시고 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층을 고르게 한다. 이에 시험용액 조제에서 얻어진 효소분해물을 유리여과기를 통해 여과용 플라스크로 여과한다. 비커를 세척하면서 잔류물을  70℃ 물 10 mL로 2회 세척한다. 여액과 물 세척액을 합치고, 미리 무게를 칭량한 600 mL 비커로 옮겨 9) 수용성 식이섬유 측정에 사용한다. 잔류물은 곧바로 78% 에탄올, 95% 에탄올 그리고 아세톤의 순으로 각각 15 mL씩 2회 세척한다(주의: 잔류물의 세척을 즉시 하지 않을 경우, IDF 값이 높아질 수 있다). 7) 총식이섬유 함량 측정 과정의 ★ 이하에 따라 IDF의 무게를 계산한다.

9) 수용성 식이섬유(SDF) 측정

8) 물불용성 식이섬유 측정에서 600 mL 비커로 옮긴 여액과 물 세척액의 무게를 확인하여 부피를 확인하고 미리 60℃로 가열된 95% 에탄올을 측정한 부피의 4배량을 가한다. 이때 60℃ 에탄올의 일부를 이용하여 여과용 플라스크에 남은 여액과 물 세척액을 세척한다. 여과액과 물 세척액에 에탄올을 4배량 가하기 위한 방법으로 물을 첨가하여 여과액과 물 세척액의 무게를 80 g으로 맞추고, 60℃의 95% 에탄올 320 mL을 가할 수도 있다. 그 후, 상온에서 1시간 침전시킨 후, 7) 총 식이섬유 함량 측정 중 ☆이하에 따라 SDF의 함량을 측정한다.

10) 식이섬유 함량의 계산

※ 총 식이섬유 함량은 7) 총 식이섬유(TDF) 함량 측정을 독립적으로 수행하여 결정하거나 8) 물불용성 식이섬유(IDF) 측정 및 9) 수용성 식이섬유(SDF) 측정에서 구한 IDF와 SDF의 합으로 결정할 수 있다.

가) 공시험 함량 (B, mg) 측정:

B = [(B1R + B2R) / 2] - PB - AB

․B1R, B2R: 공시험 2반복에 대한 잔사의 무게 (mg)

․PB: 공시험(B1)의 단백질 무게 (mg)

․AB: 공시험(B2)의 회분 무게 (mg)

나) 식이섬유 함량(DF, g/100g) 측정:

[eqn: DF= {{[M1R+M2R]} over {2} -P-A-B} over {{(M1`+M2)} over {2}} TIMES 100]

․M1R, M2R: 검체 2반복의 잔사 무게 (mg)

․P: 잔사(M1R) 중 단백질 무게 (mg)

․A: 잔사(M2R) 중 회분 무게 (mg)

․B: 공시험 함량 (mg)

․M1, M2: 검체의 무게 (mg)

나. 액체크로마토그래피를 이용한 수용성 식이섬유의 정량

1) 시험법 적용범위

난소화성 말토덱스트린 등 알코올 수용액에 의해 일부만이 침전되는 식이섬유를 함유하는 식품

2) 분석원리

난소화성 말토덱스트린(RMD) 등을 함유한 식품에 인산완충액을 이용한 효소-중량법을 적용하여 에탄올에 의해 침전되는 고분자의 난소화성 말토덱스트린과 같은 수용성 식이섬유(HMWSDF)를 확인하고 에탄올에 녹는 저분자의 난소화성 말토덱스트린과 같은 수용성 식이섬유(LMWSDF)를 탈염하여 농축한 후, 액체크로마토그래피로 확인하는 방법이다. 이 방법에서 총 식이섬유는 물불용성 식이섬유(IDF) 및 HMWSDF와 액체크로마토그래피로 확인한 LMWSDF의 합으로 계산되어진다. 즉 효소-중량법으로 구한 식이섬유의 함량에 알코올에 녹는 수용성 식이섬유의 함량을 합하여 총 식이섬유의 함량으로 한다.

3) 장치

가) 저울 : 0.1 mg 까지 측정이 유효한 것.

나) 비커 : 500 mL Tall-form.

다) 진탕 항온수조 : 98±2℃까지 가온하여 온도 유지가 가능하고 60℃로 일정하게 온도를 유지할 수 있는 것.

라) 유리여과기 : 기공 40～60 um(ASTM 기준)의 용융 유리디스크가 있는 Pyrex 60 mL(Corning No. 36060 Buchner 또는 이와 동등한 것). 525℃에서 하룻밤 동안 회화하고 회화로 온도가 130℃까지 떨어지면 유리여과기를 상온에서 방냉한 후, 2% 세척액에 1시간 동안 담근 후 물로 씻고 증류수로 헹군 다음 아세톤 15 mL을 사용하여 마지막으로 세척하고 바람을 불어 건조시킨다. 건조된 유리여과기에 규조토 약 1.0 g을 넣고 130℃에서 항량한 후, 데시케이터에서 1시간 동안 실온에 방냉하여 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg까지 칭량하여 기록한다.

마) 유리 또는 플라스틱 칼럼관: 이온교환수지를 채우기 위한 것으로 40∼70 cm × 15 mm 내경의 칼럼관

바) 유리막대 : 20 cm 길이로 끝을 열처리한 것

사) 일회용 주사기 : 10 mL

아) 파스퇴르 피펫, 10 mL 정용피펫

자) 저울 : 4,000 g 용량

차) 테프론 막대 : 비커의 침전물을 모을 수 있는 것

카) 용량플라스크 : 10, 50, 250 및 1,000 mL

타) 감압농축기

4) 시약 및 시액

가) 증류수 : 3차 증류수

나) 에탄올 : 95% Technical grade

다) 에탄올 수용액(78%) : 1 L 정용 플라스크에 95% 에탄올 821 mL을 넣고 물을 표선까지 채워 조제한다.

라) 인산수소나트륨(Na2HPO4) 및 인산이수소나트륨(NaH2PO4)

마) 인산 완충용액(0.08M, pH 6.0): 무수 인산수소나트륨 1.4 g (또는 2수화물 1.753 g)과 9.68 g 인산이수소나트륨·1수화물 (또는 2수화물 10.94 g)을 700 mL 증류수에 녹인 후 증류수를 가하여 1 L로 조제한다. 이때 pH를 확인한다.

바) 액체크로마토그래피 머무름 시간 확인용 표준물질: 저분자의 난소화성 말토덱스트린에 해당하는 올리고당[DP(Degree of polymerization)≥3]을 포함한 DE(Dextrose equivalent) 25 또는 16.5～19.5의 말토덱스트린(Sigma사 419699 또는 이와 동등한 것)

사) 내열성 α-아밀라아제 용액: Termamyl 120 또는 이와 동등한 것, 글리세롤이 없을 것, 0～5℃에서 보관하며 사용한다(Sigma사 Catalog No. A 3403 또는 이와 동등한 것)

아) 프로테아제 효소용액: 1.1.4.3. 가. 4)시약 및 시액 라)의 효소분해능을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하고 인산 완충용액으로 희석하여 10 mg/mL로 사용 시 조제한다.(Sigma사 Catalog No. P 3910 또는 이와 동등한 것)

자) 아밀로글루코시다제 용액 : 1.1.4.3. 가. 4)시약 및 시액 마)의 효소분해능을 만족하는 것으로써 0～5℃에서 보관하며 사용한다. 글리세롤이 없을 것(Sigma사 Catalog No. A 9913 또는 이와 동등한 것)

차) 규조토(Diatomaceous earth.): 산세척한 것(Sigma사 product code C 8656 또는 Fisher Scientific사 Catalog No. C-211, acid washed 또는 이와 동등한 것)

카) 각 시료의 탈염을 위한 이온교환수지

(1) m-1 : 25 g Amberlite IRA-67(OH-type) 또는 이와 동등한 것

(2) m-2 : 25 g Amberlite 200 CT(HG)H(H-type) 또는 이와 동등한 것

각 시험 용액의 분석을 위해서 유리칼럼에 상기 2종의 수지를 잘 혼합하여 충진한다.

․총 이온교환능 : 1.74 meq/mL

․유효 이온교환능(R-H 교환능) : 1.6 meq/mL(min.)

․상기 2종의 수지를 혼합하여 충진하기 전 각 수지를 증류수로 세척하고 세척액의 pH가 m-1은 7～8.8, m-2는 4～7의 값이 되도록 한다.

※ Amberlite 200 CT(HG)H가 없을 경우, Amberlite 200 (Na-type) 또는 Amberlite 200CT를 'H-type'으로 전환하여 사용한다. 이를 위해 Amberlite 200(Na-type) 600 mL(500 g)을 유리 또는 플라스틱 칼럼관(100 cm × 40 mm id)에 채우고 2배 부피의 증류수를 이용하여 60 mL/min의 속도로 세척하고 2배 부피의 10% 염산용액(1→3 w/w)을 재차 60 mL/min의 속도로 흘려준 후 수지의 3배 부피에 해당하는 증류수를 이용하여 60 mL/min의 속도로 세척하여 염산을 제거한다. 3～6배의 부피에 해당하는 증류수를 120 mL/min의 속도로 재차 세척하고 세척액의 pH가 4～7인지 확인하여 염산용액의 세척이 제대로 이루어졌는지 확인하여 사용한다.

타) 수산화나트륨 수용액(0.274 M):NaOH 11 g을 증류수 약 700 mL에 녹인 후 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

파) 염산용액(0.325M) : 1 L 정용 플라스크에 1M HCl 325 mL을 넣고 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

하)글리세롤 표준용액(10 mg/mL) : 비커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 1L 정용플라스크로 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

갸) 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액(100 mg/mL) : 비커에 글리세롤(순도 99.5% 이상) 10 g을 달아 100 mL 정용플라스크에 물로 씻어 옮겨 표선까지 채워 조제한다.

냐) 황산 암모늄

댜) 덱스트로즈 : 액체크로마토그래피용, 순도 99.5% 이상

5) 시험용액의 조제

가) 시료 균질화

제10, 1, 1.1, 1.1.4, 1.1.4.3. 식이섬유 가. 효소-중량법 6) 시험용액 조제 가)와 같이 준비한다. 당함량이 높은 시료의 경우, LMWSDF의 손실을 고려하여 85% 에탄올 세척과정은 생략한다.

나) 효소분해

4개의 500 mL tall-form 비커에 시료 1.000 ± 0.005 g을 정밀히 달아 2개의 검체(M1, M2)를 준비하고 2개의 공시험(B1, B2)을 준비한다. 이에  인산 완충용액 50 mL씩 가하고 초음파를 이용하여 시료가 뭉치지 않고 완벽하게 분산시킨다. 내열성 α-아밀라아제 용액 100 μL을 첨가한다. 비커를 알루미늄박으로 덮은 후 95℃ 수욕에서 30분 동안 계속 진탕하면서 반응시킨다. 수욕의 온도가 95℃에 도달할 때부터 시작한다 (보통 총 35분이면 충분하다). 수욕에서 모든 비커를 꺼내어 실온으로 식힌다. 알루미늄박을 제거하고 비커에 벽 또는 바닥에 생긴 겔 형태의 내용물을 시약스푼으로 긁어내어 용액 속에 분산시킨다. 비커 벽과 시약스푼을 10 mL의 물로 씻어준다. 0.275M 수산화나트륨용액으로 pH를 7.5±0.1로 조정한 후, 프로테아제 효소용액 0.5 mL를 각 비커에 첨가한다. 알루미늄박으로 비커를 덮고 60℃ 수욕에서 30분간 계속해서 교반하여 반응시킨다. 수욕의 온도가 60℃에 도달한 후 반응을 시작한다. 실온으로 용액을 식힌 후, 알루미늄박을 제거한 후 비커를 잘 교반해주면서 0.325M HCl로 용액의 pH를 4.5±0.2로 조정한다. 비커를 교반해주면서 아미노글루코시다제 용액 0.3 mL를 첨가하고 알루미늄박으로 덮은 후 60℃ 수욕에서 지속적으로 흔들면서 30분간 항온한다. 수욕의 온도가 60℃에 도달할 때 반응을 시작한다.

6) 물불용성 식이섬유(IDF) 및 HMWSDF의 함량 측정

60℃로 가열한 95% 에탄올을  60℃ 수욕 상의 효소분해된 각각의 시험용액에 가한다. 이때 에탄올과 시험용액의 부피의 비율은 4 : 1이 되어야 한다. 수욕에서 비커를 꺼내어 알루미늄박으로 덮고 실온에서 하룻밤 침전시킨다. 미리 규조토를 넣고 무게를 칭량한 유리여과기에 있는 78% 에탄올 15 mL을 가하여 규조토를 분산시킨 후 흡인여과하여 규조토층이 고르게 형성되도록 한다. 에탄올 처리된 효소 분해물을 준비된 유리여과기로 여과하고 78% 에탄올이 들어있는 세척병과 고무재질의 시약스푼를 이용하여 비커의 잔류물을 유리여과기로 옮긴다. 이때 효소분해물에 엷은 막이 생성될 경우, 시약스푼으로 생성된 막을 깨고 여과한다. 진공을 유지하면서 20 mL 78% 에탄올 3회, 10 mL 95% 에탄올로 2회, 10 mL 아세톤으로 2회씩 잔류물을 씻어낸다. 105℃에서 잔류물이 남아있는 유리여과기를 하룻밤 건조시키고, 유리여과기를 데시케이터에서 1시간 동안 항량한 후, 식이섬유 잔류물 및 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 식이섬유의 무게를 계산한다. 같은 두개의 시료 중 하나는 1.1.3.1 총질소 및 조단백질에 따라 단백질 함량을 측정한다. 이때 질소계수는 6.25를 사용한다. 다른 하나는 1.1.2. 회분에 따라 회분량을 확인한다. 이때 525℃에서 5시간 이상 회화하고 0.1 mg 단위까지 칭량한다. 미리 칭량하여 확인한 규조토를 포함한 유리여과기의 무게를 빼서 회분의 무게를 결정한다.

7) 여액 회수 및 탈염

6)의 여액을 감압농축기로 농축하여 완전 건고하고 잔류물을 소량의 물로 녹인 후, 이를 50 mL 정용플라스크에 정량적으로 옮긴다. 이에 글리세롤 표준용액 10 mL을 넣고 증류수로 표선까지 채워 50 mL로 조제한다. 이를 Amberlite IRA-67(m-1) 및 Amberlite 200CT(HG)H(m-2) 각 25 g을 완전히 혼합하여 채운 유리칼럼(75 cm × 15 mm id)에 통과시키고 이후, 250 mL 증류수로 칼럼을 통해 세척하며 추출한다. 이때 유속은 0.8 mL/min으로 조정한다.

이온교환 칼럼을 통과한 초기 용출액부터 250 mL를 모아 정량적으로  500 mL 둥근 플라스크에 옮기고 완전 건고될 때 까지 감압농축한다. 이를 10 mL 정용플라스크로 증류수를 이용하여 정량적으로 옮겨 10 mL로 조제한 후 10 mL 일회용 주사기에 옮겨 0.2 μm 맴브레인 필터로 여과하여 액체크로마토그래피용 시험용액으로 한다.

8) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) 분석칼럼 : TSK-GEL G2500PWXL, 7.8 mm id × 30 cm를 연속하여 2개를 연결한 것 또는 이와 동등한 것

(2) 가드 칼럼 : TSK guard column PWXL, 6.0 mm id × 4 cm 또는 이와 동등한 것

(3) 칼럼온도 : 80℃

(4) 이동상 : 증류수

(5) 유속 : 0.5 mL/min

(6) 주입량 : 20 μL

(7) 검출기 : 시차굴절계검출기(RI), 40℃ 유지

나) RMD와 액체크로마토그래피 반응이 동등한 덱스트로즈로 반응계수 결정

RMD의 RI 검출기의 반응에 대한 평가와 표준화를 위해 글리세롤 표준물질을 사용한다. LC 분석에서 RI 검출기에서 얻은 RMD의  피크면적은 덱스트로즈와 동등하며 내부표준물질인 글리세롤의 피크면적과 덱스트로즈의 농도에 따른 피크면적을 비교한다. 이렇게 작성된 검량곡선으로부터 시험용액 중 RMD의 함량을 계산하는데 사용할 반응계수를 결정한다.

동량의 글리세롤과 3개 농도 수준으로 덱스트로즈를 100 mL 정용플라스크에 각각 넣은 3개의 용액을 준비한다. 이를 위해 0.5, 1.0, 2.0 g의 덱스트로즈를 3개의 구분된 100 mL 정용플라스크에 정확히 칭량하여 넣고 덱스트로즈-글리세롤 반응계수 확인용 표준용액 10 mL을 각 정용 플라스크에 첨가한 후 증류수를 채워 100 mL로 조제한다. 조제된 3개의 표준용액 20 μL를 액체크로마토그래피에 주입하여 각 크로마토그래피에서 덱스트로즈와 글리세롤의 피크면적을 확인하여 글리세롤의 피크면적에 대한 덱스트로즈 피크면적 비(y-축)와 글리세롤 함량에 대한 덱스트로즈 함량 비(x-축)을 비교하여 얻어진 기울기의 역수로부터 아래의 식과 같이 반응계수를 구한다.

반응계수(Rf) =

1/[(PA-dex/PA-gly)×(Wt-gly/Wt-dex)]

PA-dex : 덱스트로즈 피크면적

PA-gly : 글리세롤 피크면적

Wt-dex : 표준용액 중 덱스트로즈 함량

Wt-gly : 표준용액 중 글리세롤 함량

다) 액체크로마토그래피의 크로마토그램

그림 1. 표준용액 및 시험용액의 크로마토그램

9) 식이섬유 함량 계산

※ 총 식이섬유 함량(TDF)은 %(IDF+HMWSDF)와 LMWSDF의 평균 함량(%ALMWSDF)을 합하여 계산한다.

가) (IDF + HMWSDF)의 함량 계산

(1) 공시험 함량 (B, mg) 측정:

B = [(B1R +B2R) / 2] - PB - AB

․B1R, B2R: 공시험 2반복에 대한 잔사의 무게 (mg)

․PB: 공시험(B1)의 단백질 무게 (mg)

․AB: 공시험(B2)의 회분 무게 (mg)

(2) (IDF + HMWSDF) 평균 함량(g/100g) 측정:

[eqn: %(IDF+HMWSDF)= {{[M1R+M2R]} over {2} -P-A-B} over {{(M1`+M2)} over {2}} TIMES 100]

․M1R, M2R: 검체 2반복의 잔사 무게 (mg)

․P: 잔사(M1R) 중 단백질 무게 (mg)

․A: 잔사(M2R) 중 회분 무게 (mg)

․B: 공시험 함량 (mg)

․M1, M2: 검체의 무게 (mg)

나) LMWSDF의 평균 함량

(1) LMWSDF(mg) 측정:

LMWSDF	=	PAS_LMWSDF×WtS_gly×Rf
		PAS_gly

․PAS_LMWSDF : 시험용액 중 LMWSDF(DP≥3)의 피크면적

․PAS_gly : 시험용액 중 글리세롤의 피크면적

․WtS_gly : 시험용액에 첨가한 글리세롤의 무게(mg)

․Rf : 덱스트로즈-글리세롤 반응계수

(2) 각 시료의 LMWSDF의 함량(g/100g) 측정

%LMWSDF	=	LMWSDF×100
		SW

․SW : 시료의 무게(mg)

(3) LMWSDF의 평균 함량(g/100g)

%ALMWSDF	=	%LMWSDF+%LMWSDF'
		SW

․%LMWSDF, %LMWSDF' : 각 시료의 LMWSDF의 함량(g/100g)

2. 식품 중 식품첨가물시험법

2.1 ～ 2.4 (현행과 같음)

2.5 아황산, 차아황산 및 그 염류

2.5.1 (현행과 같음)

2.5.2 정량시험

가. 모리어-윌리암스변법

1) 시험법의 적용범위

이 방법은 이산화황을 함유하는 대부분의 식품에 적용가능하다. 다만, 식초, 식초절임 등 다량의 식초를 함유하는 식품은 제외한다.

2) (현행 1)과 같음)

3) (현행 2)와 같음)

4) (현행 3)과 같음)

5) (현행 4)와 같음)

6) (현행 5)와 같음)

나. 산증류-비색법

1) 시험법 적용범위

식초, 식초절임 등 다량의 식초를 함유하는 식품에 적용한다.

2) 분석원리

식품 중의 아황산, 차아황산 및 그 염류 등을 산성조건하에서 증류하여 0.1N 수산화나트륨용액으로 포집하고, 포집 액을 파라로자닐린·포름알데히드 용액으로 발색시킨 후 흡광도를 측정하여 정량분석하는 방법이다.

3) 장치

가) 그림과 같은 장치를 쓴다

(단위：mm)

A：50 mL 원형 플라스크 B：100 mL 환저 플라스크 C：이중냉각관 D：유리관 E：질소가스 유량계

4) 시약 및 시액

가) 25% 인산용액 : 85% 인산(H3PO4) 29.4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

나) 0.1N 수산화나트륨용액 : 수산화나트륨(NaOH) 0.4 g을 물에 녹여 100 mL로 한다.

다) 5% 디메돈ㆍ에탄올 용액 : 디메돈(dimedone) 5.0 g을 에탄올에 녹여 100 mL로 한다.

라) 1% 아지화나트륨용액 : 아지화나트륨(NaN3) 1.0 g을 물에 녹여 100 mL로 한다.

마) 파라로잘린 용액 : 염산파라로잘린 40.0 mg을 염산 20 mL에 녹인 후 물을 가하여 100 mL로 한다.

바) 0.2% 포름알데히드용액 : 포르말린 3.0 g을 정밀히 달아 물을 가하여 500 mL로 한다.

사) 파라로잘린ㆍ포름알데히드용액 : 파라로잘린용액과 0.2% 포름알데히드용액을 동량 혼합한다.

아) 표준용액 : 아황산수소나트륨(NaHSO3) 171.0 mg(이산화황으로서 100 mg 상당량)을 정밀히 달아 0.1N 수산화나트륨을 가하여 100 mL로 한 액을 표준원액으로 한다. 표준원액 1 mL을 정확히 취해 0.1N 수산화나트륨을 가하여 500 mL한 액을 표준용액으로 한다. 표준용액 0, 1, 2, 3, 4, 5 mL을 정확히 취해 0.1N 수산화나트륨을 가하여 5 mL로 한다(이 액 1 mL당  이산화황으로서 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 μg 함유).

5) 시험조작

플라스크(A)에 0.1N 수산화나트륨 용액 20 mL를 넣고 장치에  부착한다. 다음에 플라스크(B)에 물 20 mL, 5% 디메돈․에탄올 용액 1 mL, 1% 아지화나트륨용액 1 mL, 에탄올 2 mL, 소포제 2방울 및 25% 인산 10 mL를 가하고 장치에 부착한다. (E)로부터 질소를 매분 0.7 L의 속도로 5분간 흘린다. 플라스크(B)를 떼어내어 검체의 일정량을 신속히 넣고 다시 장치에 붙인 다음 질소가스를 0.7 L의 속도로 흘리면서 플라스크(B)를 20분간 가열한다. 가열이 끝나면 플라스크(A)를 떼어내어 플라스크(A) 중의 용액을 시험 용액으로 한다.

시험용액 5 mL(이산화황으로서 0~2.0 μg/mL)를 정확히 취해 물 0.1 mL를 가한 것을 (A)용액으로 하고, 새로 시험용액 5 mL를 정확히 달아 0.1% 과산화수소용액 0.1 mL를 가한 것을 (B)용액으로 한다. (A), (B)용액에 파라로잘닐린․포름알데히드 용액을 1 mL씩 정확히 가해 잘 혼들어 섞고, 실온에서 20분간 방치한 후 파장 580 nm에서 흡광도를 측정한다.  각각의 표준용액  5 mL 및 따로 검체를 사용하지 않고 같은 방법으로 조작한 것을 대조액으로 하여 시험용액과 동일하게 조작하여 검량선을 작성한 후, 다음 식에 따라 이산화황의 양을 산출한다(다만, 10 mg/kg 미만은 불검출로 한다).

6) 정량시험

앞의 시험조작에 따라 시험하고, 얻어진 시험용액의 흡광도[(A)용액의 흡광도 - (B)용액의 흡광도]로부터 작성한 검량선을 이용하여 시험용액중의 이산화황 농도(μg/mL)를 구하여 다음 식에 따라 검체중의 이산화황 함량(g/kg)을 계산한다.

이산화황(g/kg)	=	C
		50 × W

C : 시험용액중의 이산화황 농도(μg/mL)

W : 시료 채취량(g)

3. 미생물 시험법

3.1 ～ 3.3 (현행과 같음)

3.4 배지 및 시액

3.4.1 배지

1) ～ 52) (현행과 같음)

53) 세균수 건조필름배지 Ⅰ

54) 대장균군 건조필름배지 Ⅰ

55) 대장균 건조필름배지 Ⅰ

56) ～ 68) (현행과 같음)

69) 세균수 건조필름배지 Ⅱ

Peptone                    5 g

Bonito meat extract(Erlich meat extract)                    1 g

Yeast extract             2.5 g

Glucose                    1 g

Potassium hydrogen phosphate                            0.8 g

2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride                  0.05 g

위의 성분을 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

70) 대장균군 건조필름배지 Ⅱ

Peptone                    2 g

Bonito meat extract(Erlich meat extract)                     8 g

Gall powder               1.5 g

Sodium deoxycholate         1 g

Sodium dodecyl sulfate       1 g

Potassium nitrate            1 g

Potassium hydrogen phosphate                                1 g

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside                            0.03 g

5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-galactopyranoside       0.5 g

위의 성분을 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

71) 대장균 건조필름배지 Ⅱ

Peptone                     2 g

Bonito meat extract(Erlich meat extract)                     8 g

Gall powder                1.5 g

Sodium deoxycholate         1 g

Sodium dodecyl sulfate       1 g

Potassium nitrate            1 g

Potassium hydrogen phosphate                                1 g

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside                            0.03 g

5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-galactopyranoside        0.5 g

6-chloro-3indoxyl-β-D-glucuronic acid                       0.5 g

72) MRS 배지

Enzyme Digest of Casein    10 g

Meat Extract	10 g

Yeast Extract	4 g

Glucose	20 g

Tween 80	1.08 g

Triammonium Citrate	2 g

Sodium Acetate	5 g

Magnesium Sulfate 7H2O	0.2 g

Manganese Sulfate 4H2O	0.05 g

Dipotassium hydrogen Phosphate	2                                2 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 5.7±0.1로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

3.4.2 (현행과 같음)

3.5 세균수

3.5.1 일반세균수

가. (현행과 같음)

나. 건조필름법

1) 시험조작

------------------------- ----------------------------------(배지 53 또는 69)--------

------------------------- -----------------------------------------------------------------.

3.5.2 ～ 3.5.4 (현행과 같음)

3.6 (현행과 같음)

3.7 대장균군

3.7.1 (현행과 같음)

3.7.2 정량시험

가. ～ 나. (현행과 같음)

다. 건조필름법

------------------------- ------------------------대장균군 건조필름배지Ⅰ(배지 54) 또는 대장균군 건조필름배지Ⅱ(배지 70)에 접종한 후, 35～37℃에서 24±2시간 배양한다. 대장균군 건조필름배지Ⅰ에서는 붉은 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하고, 대장균군 건조필름배지Ⅱ에서는 청색 및 청녹색의 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군 수를 산출한다.

3.8 대장균

3.8.1 (현행과 같음)

3.8.2 정량시험

가. (현행과 같음)

나. 건조필름법

------------------------- ---------------------대장균 건조필름배지Ⅰ(배지 55) 또는 대장균 건조필름배지Ⅱ(배지 71)에 접종한 후, 35～37℃에서 24±2시간 배양한다. 대장균 건조필름배지Ⅰ에서는 푸른 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하고, 대장균 건조필름배지Ⅱ에서는 남색 및 보라색의 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군 수를 산출한다.

3.9 유산균수

3.9.1 유산간균 및 구균

------------------------- -----------------------------------------------------------------------------------------. 또한 배지는 BCP첨가 평판측정용배지(배지 11)를 사용하여 35~37℃에서 72±3시간 배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계수 또는 MRS배지(배지 72)에 접종하여 30℃에서 72±3시간 배양한 후 발생한 엷은 황색의 집락을 유산균의 집락으로 계수한다.

3.9.2 ∼ 3.9.3 (현행과 같음)

3.10 ∼ 3.12 (현행과 같음)

3.13 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus)

3.13.1 정성시험

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) -----------------------

------------------------ ---------------, 2% NaCl을 첨가한 보통한천배지(배지 8)에 ------------------------

(현행과 같음)

3.13.2 정량시험

1) 균수측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취한 후, 225 mL의 희석액을 가하여 2분간 고속으로 균질화하여 시험용액으로 하여 10배 단계 희석액을 만든 다음 각 단계별 희석액을 TCBS 한천배지(배지 17) 3장에 0.3 mL, 0.4 mL, 0.3 mL씩 총 접종액이 1 mL이 되게 도말한다. 사용된 배지는 완전히 건조시켜 사용하고 접종액이 배지에 완전히 흡수되도록 도말한 후 10분간 실내에서 방치시킨 후 35～37℃ 에서 18～24시간 배양한 다음 청록색의 서당 비분해 집락을 계수한다.

2) 확인시험

계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 2% NaCl을 첨가한 보통한천배지(배지 8)에 접종하고 35～37℃에서 18～24시간 배양한 후 3.13.1 정성시험 3) 확인시험에 따라 시험을 실시한다.

3) 균수계산

확인 동정된 균수에 희석배수를 곱하여 계산한다.

3.14 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)

3.14.1 (현행과 같음)

3.14.2 정량시험법

1) 균수 측정

------------------------ ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 유지한 난황을 첨가하지 않은 TSC 한천배지(배지 41)-----------------------  --------------.

(현행과 같음)

2) ～ 3) (현행과 같음)

3.15 ～ 3.26 (현행과 같음)

4. ∼ 5. (현행과 같음)

6. 식품 중 자연독소 시험법

6.1 곰팡이독소

6.1.1 (현행과 같음)

6.1.2 아플라톡신 M1

1) 시험법 적용범위

원유, 우유 및 분유

2) 분석원리

검체 중의 아플라톡신 M1을 면역친화성칼럼으로 정제하여 형광검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.

3) 장치

가) (현행과 같음)

나) 정제용 칼럼 : 아플라톡신 M1용 면역친화성칼럼(Immunoaffinity column)

다) 여과지：Whatman No.4 또는 이와 동등한 것

라) 시린지필터 : 0.2 μm

4) 시약 및 시액

가) ～ 다) (현행과 같음)

라) -----：-------- 아세토니트릴로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

< 삭  제 >

마) (현행 바)와 같음)

5) 시험용액의 조제

가) 추출

(1) 액상 우유

시료 100 mL를 취하여 질량을 측정하고 40℃의 항온수조에 30분간 방치한 후 10분 동안 균질화한다. 균질화한 후 4℃에서 10분 동안 10,000 x g로 원심분리한다. 상층의 지방층을 제거하고 여과한 것을 추출액으로 한다.

(2) 분유 분말

균질화된 시료 10 g을 정밀히 달아 40℃의 온수 100 mL를 가하고 10분 동안 균질화한다. 균질화한 후 4℃에서 10분 동안 10,000 x g로 원심분리한다. 상층의 지방층을 제거하고 여과한 것을 추출액으로 한다.

나) 정제

추출액 50 mL를 정제용 칼럼에 주입하여 초당 1 방울 정도의 속도로 통과시킨다. 이어서 물  20 mL를 같은 유속으로 유출시키고 칼럼내에 남아 있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거한 후 아세토니트릴 4 mL로 용출시킨다. 용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 아세토니트릴․물(25:75, v/v) 0.2 mL를 가하여 녹인 후 시린지필터(0.2 μm)로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

< 삭  제 >

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프의 측정조건

(1) --- :  C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) --------------------

------

(2) ---- : 아세토니트릴․물 (25:75, v/v)

(3) ----- : ---------------- 형광파장  435 nm

(4) (현행과 같음)

(5) ---- : 50 μL

나) 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

다) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 아플라톡신 M1 표준용액의 액체크로마토그램

7) (현행과 같음)

8) (현행과 같음)

가) 계산

아플라톡신 M1의 함량(μg/kg) = C × V/S × D

C：검량선에서 구한 아플라톡신 M1의 농도(ng/mL)

S : 시료 채취량(g)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

D : 희석배수

6.1.3 ～ 6.1.7 (현행과 같음)

6.2 ～ 6.4 (현행과 같음)

7. 식품 중 유해물질시험법

7.1 중금속 시험

7.1.1 (현행과 같음)

7.1.2 금속별 시험

7.1.2.1 ～ 7.1.2.2 (현행과 같음)

7.1.2.3 비소(As)

1) 시험용액의 조제

가) (현행과 같음)

<삭  제>

나) (현행 다)와 같음)

7.2 방사능

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 검체조제

가) 직접법

(1) -----------------------

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-------------------------

-------------------------

------제거한다(다만, 수산물 중 식용가능한 어류의 알, 창난, 이리(곤이), 오징어 난포선 등의 내장은 포함한다).  또한 물로 ----------

--------------------------

---------.

(현행과 같음)

(2) ～ (4) (현행과 같음)

나) ～ 다) (현행과 같음)

5) (현행과 같음)

8. (현행과 같음)

9. 일반시험법

9.1 (현행과 같음)

9.2 이물

9.2.1 일반이물

가. ∼ 라. (현행과 같음)

마. 금속성이물(쇳가루)

1) ∼ 2) (현행과 같음)

3) 시험조작

가) 분말제품, 환제품, 액상 및 페이스트제품

(1) ----------------------

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----------------------

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----------------------

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측정한다.(태움․용융소금은 쇳가루 이외의 입자가 봉자석에 응집될 수 있으므로 증류수를 분사하여 이를 제거한 후 쇳가루를 건조하여 무게를 측정한다.)

(2) ∼ (3) (현행과 같음)

[별표 1]

“식품에 사용할 수 있는 원료”의 목록

1. 식물성 원료

	품목명	이명 또는 영명	학명	사용부위
(현행과 같음)
70	(현행과 같음)	(현행과 같음)	(현행과 같음)	껍질(포엽과 종피)이 ---------
71 ~177	(현행과 같음)
178	<삭 제>
178 ∼330	(현행 179∼331과 같음)

[별표 2] (현행과 같음)

[별표 3] “식품에 사용할 수 없는 원료”의 목록

1. (현행과 같음)

2. 동물성 원료

	품목명	이명 또는 영명	학 명	부 위
1∼2	(현행과 같음)
3	쓸개(쓸개즙)	담낭(담즙)	-	-
4	(현행과 같음)
5	<삭 제>
5∼16	(현행 6∼17과 같음)

3. 기타

	품목명	이명 또는 영명	학 명	부 위
1	곰부차	Mushroom tea, tisane, Kombucha	-	-
2∼6	(현행과 같음)