식품의약품안전청 공고 제2010-200호

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안) 행정예고

2010. 9. 2

식품의약품안전청

식품의약품안전청 공고 제2010-200호

「건강기능식품의 기준 및 규격」을 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 수렴하고자 그 취지, 개정 이유 및 주요 내용을 「행정절차법」 제46조에 따라 다음과 같이 공고합니다.

2010년 9월 2일

식품의약품안전청장

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안) 행정예고

1. 개정이유

건강기능식품의 공통제조기준과 개별 기준ㆍ규격 중 일일섭취량을 명확히 하고, 기능성 원료별 적용되는 시험법을 추가ㆍ신설하여 건전한 건강기능식품 유통구조를 확립하고 소비자에게 안전한 건강기능식품을 공급하고자 함

2. 주요내용

가. 건강기능식품 제조에 사용되는 원료 적용 규정 명확화 [안 Ⅰ.1 4) (2) (라)]

(1) 건강기능식품용수에 사용하는 수처리제 및 원료소금의 적용규정은 「식품의 기준 및 규격」을 적용하므로 이를 명확히 함

나. 공통 제조기준의 개정 [안 Ⅰ.2 1), Ⅰ.2 9) (1) Ⅰ.2 10) (3), Ⅰ.2 10) (9)]

(1) 건강기능식품의 섭취 목적과 기능성 원료를 최종제품으로 제조 시 원료의 특성이 변화될 수 있는 제조ㆍ가공을 하여서는 아니됨을 명확히 함

(2) 건강기능식품의 방사선 조사 허용대상 명칭을 명확히 함

(3) 건강기능식품의 품질을 유지시킬 목적으로 건강기능식품 내부에 사용되는 물질의 포장재는 기구 및 용기ㆍ포장의 기준에 적합하여야 함을 명확히 함

다. 공통규격의 개정 [안 Ⅰ.3 1) (1) (사)～(타), Ⅰ.3 2)]

(1) 확대된 제형인 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바의 정의를 명확히 함

라. 보존 및 유통기준의 명확화 [안 Ⅰ.6 9)]

(1) 「건강기능식품의 표시기준」에 적합하지 않은 제품을 보관 및 판매할 수 없음을 명확히 함

마. 기준 및 규격 적용 시험법의 명확화 [안 Ⅱ.2.2.4, Ⅱ.2.2.5, Ⅱ.2.3.11, Ⅱ.2.3.12, Ⅱ.2.3.13]

(1) 기능성 원료 중 개별 기준 및 규격에 적용되는 시험법을 명확히 함

바. 개별 기준 및 규격 중 일일섭취량 원료명칭의 명확화 [안 Ⅱ2.4.4.1, Ⅱ.2.4.4.2, Ⅱ.2.4.4.4, Ⅱ.2.4.4.9, Ⅱ.2.4.4.11, Ⅱ.2.4.4.12, Ⅱ.2.4.4.13]

(1) 구아검/구아검가수분해물, 글루코만난(곤약, 곤약만난), 난소화성말토덱스트린, 아라비아검(아카시아검), 이눌린/치커리추출물, 차전자피, 폴리덱스트로스의 일일섭취량을 해당 원료가 아닌 식이섬유로 개정함

사. 시험법 추가 및 신설 [안 Ⅲ.3.1.8.3 Ⅲ.3.1.11.1, Ⅲ.3.1.13.1, Ⅲ.3.5.14, Ⅲ.3.5.15, Ⅲ.3.6.7, Ⅲ.3.6.8]

(1) 나이아신, 엽산, 비오틴 시험법을 추가함

(2) 루테인, 아스타잔틴, 코엔자임Q10, 대두이소플라본 시험법을 신설함

3. 의견제출

「건강기능식품 기준 및 규격 인정에 관한 규정」 일부개정고시(안)에 대하여 의견이 있는 단체 또는 개인은 2010년 9월 28일까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전청장(주소 : 서울특별시 은평구 통일로 194, 참조 : 건강기능식품기준과, 전화 02-380-1317～9, 팩스 02-359-0025)에게 제출하여 주시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 항목별 의견(찬․반 여부와 그 이유)

나. 성명(단체의 경우 단체명과 그 대표자의 성명), 전화번호 및 주소

다. 기타사항

식품의약품안전청 고시 제2010-000호

「건강기능식품에 관한 법률」 제14조 및 제15조에 따른 「건강기능식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전청 고시 제2010-7호, 2010. 2. 18)을 다음과 같이 개정합니다.

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안)

건강기능식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

Ⅰ.1 건강기능식품의 제조에 사용되는 원료는 다음과 같다 4) (2) 중 (라)를 다음과 같이 한다

(라) 건강기능식품에 사용하는 주정은 「주세법」에 따른 품질기준에, 원료소금 및 수처리제 등은 「식품의 기준 및 규격」에, 축산물 및 그 가공품은 「축산물가공처리법」에 적합한 것이어야 함

Ⅰ.2 공통 제조기준 중 1)을 다음과 같이 하고 9) 중 (1)과 10) 중 (3)을 각각 다음과 같이 하며, 10) 중 (9)를 다음과 같이 신설한다.

1) 이 규정에 따른 건강기능식품은 인체에 보건 목적의 유용한 효과를 얻기 위한 기능성 원료 또는 성분의 섭취를 주된 목적으로, 정제ㆍ캡슐ㆍ환ㆍ과립ㆍ액상ㆍ분말ㆍ편상ㆍ페이스트상ㆍ시럽ㆍ겔ㆍ젤리ㆍ바의 형태로 1회 섭취가 용이하게 제조ㆍ가공되어야 하며, 최종제품의 제조 시 기능성 원료의 특성이 변화될 수 있는 추출, 정제, 발효 등의 제조․가공을 하여서는 아니된다. 일반 식품 또는 식사를 대신할 수 있는 식품유형은 「건강기능식품 기준 및 규격 인정에 관한 규정」에 따라 식품의약품안전청장의 인정을 받아야 한다.

(1) 허용대상 건강기능식품별 흡수선량

허용대상	흡수선량
알로에분말제품	7 kGy 이하
인삼제품, 홍삼제품
클로렐라제품, 스피루리나제품

(3) 건강기능식품의 제조에 사용하는 물은 「먹는물관리법」의 먹는물 수질기준에 적합한 것이어야 한다.

(9) 건강기능식품 포장 내부의 습기, 냄새, 산소 등을 제거하여 제품의 품질을 유지시킬 목적으로 사용되는 물질은 「기구 및 용기ㆍ포장의 기준 및 규격」에 적합한 포장재를 사용하여 건강기능식품에 이행되지 않도록 포장하여야 한다.

Ⅰ.3 공통규격 1), (1) 중 (사)부터 (타)까지를 다음과 같이 신설한다.

(사) 편상(flake)이란 얇고 편편한 조각상태의 것을 말함

(아) 페이스트상(paste)이란 고체와 액체의 중간상태로 점성이 강한 유동성의 반 고상의 것을 말함

(자) 시럽(syrup)이란 고체와 액체의 중간상태로 점성이 약한 유동성의 반 액상의 것을 말함

(차) 겔(gel)이란 액상에 펙틴, 젤라틴, 한천 등 겔화제를 첨가하여 만든 유동성이 있는 고체나 반고체 상태의 것을 말함

(카) 젤리(jelly)란 액상에 펙틴, 젤라틴, 한천 등 겔화제를 첨가하여 만든 유동성이 없는 고체나 반고체 상태의 것을 말함

(타) 바(bar)란 막대형태의 것을 말함

Ⅰ.6 보존 및 유통기준 9) 중 “구입”을 “보존”으로 한다.

Ⅱ.2.2.4 코엔자임Q10 중 4)를 다음과 같이 신설한다.

4) 시험법

(1) 코엔자임Q10 : Ⅲ.3.6.7 코엔자임Q10

(2) 잔류용매 : Ⅲ.2.5.5 초산에틸, [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.2.5 대두이소플라본 중 4)를 다음과 같이 신설한다.

4) 시험법

(1) 대두이소플라본 : Ⅲ.3.6.8 대두이소플라본

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.11 루테인 중 4)를 다음과 같이 신설한다.

4) 시험법

(1) 루테인 : Ⅲ.3.5.14 루테인

(2) 잔류용매 : Ⅲ.2.5.5 초산에틸, [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.12 헤마토코쿠스 추출물 중 4)를 다음과 같이 신설한다.

4) 시험법

(1) 아스타잔틴 : Ⅲ.3.5.15 아스타잔틴

(2) 아세톤 : [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.13 쏘팔메토 열매 추출물 중 4)를 다음과 같이 신설한다.

4) 시험법

(1) 로르산 : Ⅲ.3.5.1 지방산

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4.4.1 구아검/구아검가수분해물 3), (2) 중 (가)부터 (다)까지 다음과 같이 한다.

(가) 콜레스테롤 개선 : 구아검/구아검가수분해물 식이섬유로서 9.9～27g

(나) 식후혈당상승 억제에 도움 : 구아검/구아검가수분해물 식이섬유로서 9.9～27g

(다) 배변활동 원활 : 구아검/구아검가수분해물 식이섬유로서 9.9～27g

Ⅱ.2.4.4.2 글루코만난(곤약, 곤약만난) 3), (2) 중 (가)와 (나)를 다음과 같이 한다.

(가) 콜레스테롤 개선 : 글루코만난 식이섬유로서 2.76～17g

(나) 배변활동 원활 : 글루코만난식이섬유로서 2.76～17g

Ⅱ.2.4.4.4 난소화성말토덱스트린 3), (2) ‘일일섭취량(난소화성말토덱스트린)’을 ‘일일섭취량’으로 하며, (가)와 (나)를 다음과 같이 한다.

(가) 식후혈당상승억제 : 난소화성말토덱스트린 식이섬유로서 11.9～29g(액상원료는 11.6～43g)

(나) 배변활동 원활 : 난소화성말토덱스트린 식이섬유로서 2.55～29g(액상원료는 2.32～43g)

Ⅱ.2.4.4.9 아라비아검(아카시아검) 3), (2) 중 ‘아라비아검으로서 25g'을 ’아라비아검 식이섬유로서 20g‘으로 한다.

Ⅱ.2.4.4.11 이눌린/치커리추출물 3), (2) 중 (가)부터 (다)까지 다음과 같이 한다

(가) 콜레스테롤 개선 : 이눌린/치커리추출물 식이섬유로서 7.2～10g

(나) 식후혈당상승 억제에 도움 : 이눌린/치커리추출물 식이섬유로서 7.2～10g

(다) 배변활동 원활 : 이눌린/치커리추출물 식이섬유로서 6.4～20g

Ⅱ.2.4.4.12 차전자피 3), (2) 중 (가)와 (나)를 다음과 같이 한다.

(가) 콜레스테롤 개선 : 차전자피식이섬유로서 5.53g 이상

(나) 배변활동 원활 : 차전자피 식이섬유로서 3.95～25g

Ⅱ.2.4.4.13 폴리덱스트로스 3), (2) 중 “폴리덱스트로스 7～12g”을 “폴리덱스트로스 식이섬유로서 4.55～12g”으로 한다.

Ⅲ.3.1.8 나이아신 중 Ⅲ.3.1.8.3을 다음과 같이 신설한다.

Ⅲ.3.1.8.3 나이아신(제3법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 니코틴산(나이아신)을 이동상으로 추출, 정제한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수 파장인 260nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 HLB 카트리지 : N-vinylpyrolidine과 divinylbenzene이 copolymer 형태로 결합된 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 3mL) 또는 이와 동등한 것

2.1.3 여과용 멤브레인 필터

2.1.4 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.5 부피플라스크(100 mL)

2.1.6 원심분리기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그패프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 A용액(5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액), B용액( 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 메탄올 (35 : 65)) 을 이용하여 용매를 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 Nicotinic acid(3-Picolinic acid; Niacin; Pellagra preventive factor; Pyridine-3-carboxylic acid; Vitamin B3)

분자식 : C6H5NO2, 분자량 : 123.11, CAS No. : 59-67-6

3.2 일반시약

3.2.1 초산(Acetic acid)

3.2.2 헥산설폰산나트륨(Sodium hexanesulfonate)

3.2.3 메탄올(Methanol)

3.2.4 헥산(n-Hexane)

3.2.5 증류수(Distilled water)

4. 시험과정

4.1 시약제조

4.1.1 5 mM sodium hexanesulfonate 용액

Sodium hexanesulfonate 911.1 mg을 증류수 500 mL에 녹여 증류수로 1 L가 되게 한다.

4.2 표준용액의 조제

4.2.1 니코틴산 및 니코틴산아미드를 각각 증류수로 녹여 100 mg/L 로 제조하여 표준원액으로 한다

4.2.2 표준원액을 증류수로 적당히 희석하여 표준용액으로 만든다.

4.3 시험용액의 조제

4.3.1 시료를 취하여 균일하게 잘게 부순 후 적당량(1～10g)을 취한다.

4.3.2 100 mL 부피플라스크에 넣고 5 mM Sodium hexanesulfonate 용액을 넣는다.

4.3.3 30분간 초음파 추출한다.

4.3.4 5 mM Sodium hexanesulfonate 용액을 넣어 표선까지 맞춘다

4.3.5 0℃, 15,000 G로 30분간 원심분리하여 상등액을 취해 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과한다.

4.3.6 HLB 카트리지를 준비하고 메탄올 5 mL과 증류수 5 mL을 연속으로 통과시킨 후 카트리지에 여과액 10 mL를 통과시켜 니코틴산 및 니코틴산아미드가 카트리지에 흡착되도록 한다.

4.3.7 카트리지는 5 mL의 n-헥산으로 세척한 후 80% 메탄올용액 5 mL로 용출한다.

4.3.8 용출액은 10 mL 부피플라스크에 모으고 증류수를 가하여 10 mL로 정용한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40℃
이동상	A : 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 B : 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 메탄올 (35 : 65)
검출기 파장	260 nm
유량	1.0 mL/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간(분)	A용액(%)	B용액(%)
0	100	0
3	100	0
13	70	30
20	70	30

5.2 계산

5.2.1 니코틴산(mg/100g) = C × (a × b)/S × 100/1,000

C : 시험용액 중의 니코틴산의 농도(ug/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

“Ⅲ.3.1.11 엽산”을 “Ⅲ.3.1.11 엽산, Ⅲ.3.1.11.1 엽산(제1법)”으로 하며, Ⅲ.3.1.11.2 를 다음과 같이 신설한다.

Ⅲ.3.1.11.2 엽산(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 이동상으로 시료 중 엽산을 충분히 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 280 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1. 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.5 원심분리기

2.2. 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 A용액(5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액), B용액(5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액: 메탄올(70:30))을 이용하여 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1. 표준물질

3.1.1 엽산(Folic acid)

분자식 : C19H19N7O6, 분자량 : 441.40, CAS No. : 59-30-3

3.2. 일반시약

3.2.1 수산화나트륨(Sodium chloride)

3.2.2 증류수(Distilled water)

3.2.3 헥산설폰산나트륨(Sodium hexanesulfonate)

3.2.4 초산(Acetic acid)

3.2.5 메탄올(Methanol)

4. 시험과정

4.1 시약 제조

4.1.1 0.1 N 수산화나트륨 용액(Sodium hydroxide)

1 N 수산화나트륨액을 취하여 증류수로 10배 용량으로 희석하여 사용하거나 수산화나트륨 4.5 g을 취하여 일정량의 증류수에 녹이고 1 L 부피플라스크에 옮겨 담은 후 증류수를 표선까지 채운 다음 표정하여 사용한다.

4.1.2 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액

Sodium hexanesulfonate 911.1 mg을 증류수 500 mL에 녹이고 초산 1 mL를 첨가한 후 증류수에 녹여 1 L가 되게 한다.

4.2 표준용액의 조제

4.2.1 엽산 표준물질을 0.1 N 수산화나트륨 용액에 녹여 1000 mg/L가 되도록 조제한다.

4.2.2 표준원액을 증류수로 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.3 시험용액의 조제

4.3.1 시료 일정량을 정밀히 취한다.

4.3.2 위의 시료를 50 mL 부피플라스크에 넣고 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액을 넣는다.

4.3.3 30분 동안 초음파 추출한다.

4.3.4 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3.5 35,000 G로 10분간 원심분리를 하고 상등액을 취해 0.2 um 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표.1 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40 ℃
이동상	A : 5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 B : 5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 메탄올(35:65)
검출기파장	280 nm
유속	1.0 mL/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간(분)	A용액(%)	B용액(%)
0	70	30
5	70	30
15	60	40

5.2 계산

5.2.1 엽산(mg/100g) = C × (a × b) / S × 100 / 1,000

C : 시험용액 중의 엽산의 농도(ug/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

“Ⅲ.3.1.13 비오틴”을 “Ⅲ.3.1.13 비오틴, Ⅲ.3.1.13.1 비오틴(제1법)”으로 하며, Ⅲ.3.1.13.2를 다음과 같이 신설한다.

Ⅲ.1.13.1 비오틴(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 비오틴을 이동상으로 충분히 추출하고 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 200 nm에서 정량분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1. 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.5 원심분리기

2.2. 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 육방전환밸브시스템

2.2.4 칼럼오븐

2.2.5 칼럼

2.2.5.1 전처리 컬럼 : Capcellpak MF SCX, SG80(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm) 또는 이와 동등한 것

2.2.5.2 농축 컬럼 : Capcellpak C18 UG120V(안지름 2.0 mm, 길이 35 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.2.5.3 분석 컬럼 : Capcellpak C18 UG120V(안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 0.01 M 인산이수소칼륨용액과 0.01 M 인산이수소칼륨용액:메탄올(80:20)을 이용하여 전처리칼럼은 분당 500 uL, 분석칼럼은 분당 100 uL를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다

3. 표준물질 및 일반시약

3.1. 표준물질

3.1.1 비오틴(Biotin)

분자식 : C10H10N2O3S, 분자량 : 244.31, CAS No. : 58-85-5

3.2. 일반시약

3.2.1 인산이수소칼륨(Potassium dihydrogen phosphate)

3.2.2 증류수(Distilled water)

3.2.3 메탄올(Methanol)

4. 시험과정

4.1 시약 제조

4.1.1 0.01 M 인산이수소칼륨 용액(pH 4.8)

인산이수소칼륨 1.35 g을 증류수에 녹여 1 L로 한다.

4.2 표준용액의 조제

4.2.1 비오틴 표준물질을 0.01 M 인산이수소칼륨용액에 녹여 1,000 mg/L가 되도록 조제한다. (4℃ 이하 암소 보관)

4.2.2 상기 표준원액을 0.01 M 인산이수소칼륨용액으로 희석하여 표준용액으로 사용한다.(사용시 제조)

4.3 시험용액의 조제

4.3.1 균질화한 시료 일정량(약 5g)을 정밀히 취한다.

4.3.2 위의 시료를 50 mL 갈색 부피플라스크에 넣고 0.01 M 인산이수소칼륨용액을 넣는다.

4.3.3 30분 동안 초음파 추출한다.

4.3.4 0.01 M 인산이수소칼륨용액 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3.5 추출액을 원심분리관으로 옮겨 10분간 shaker에서 격렬하게 흔든다

4.3.6 0 ℃에서 35,000 G로 30분간 원심분리한 후 상층액을 취한다.

4.3.7 이 액을 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	100 μL
칼럼온도	40℃
이동상	전처리컬럼 : 0.01 M 인산이수소칼륨용액 분 석 컬 럼 : 0.01 M 인산이수소칼륨용액/메탄올(80:20)
검출기파장	200 nm
유속	전처리컬럼 : 500 μL/분 분석컬럼 : 100 μL/분

5.2 계산

5.2.1 비오틴(mg/100g) = C × (a × b) / S × 100 / 1,000

C : 시험용액 중의 비오틴의 농도(ug/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

Ⅲ.3.5.14를 다음과 같이 신설한다.

Ⅲ.3.5.14 루테인

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 용매혼합용액으로 추출하고 에탄올로 희석한 용액을 자외분광광도계 446 nm에서 총 카로티노이드 함량을 구하고 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 446 nm에서 검출하여 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인필터 및 디스크형 멤브레인필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 부피플라스크(100 mL)

2.1.5 질소농축기

2.1.5 질소가스

2.2 분석장비

2.2.1 자외분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer)

2.2.2 고속액체크로마토그래프

2.2.3 자외부흡광광도검출기

2.2.4 silica 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 silica gel) 또는 이와 동등한 것

2.2.4 컬럼오븐

2.3 분석장비의 준비

이동상은 헥산과 에틸아세테이트를 70:30으로 혼합한 용액을 분당 1 mL씩 충분한 시간동안 흘려서 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 루테인(Lutein)

Lutein (3R,3"R,6"R-β,ε-carotene-3,3'-diol, l-trans-lutein, 5'didehydro-5'6'dihydro-beta, beta-caroene-3,3'diol)

분자식 : C40H56O2 분자량 : 568.871, CAS No. : 127-40-2

3.2 일반시약

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 헥산(Hexane)

3.2.3 아세톤(Acetone)

3.2.4 톨루엔(Ethanol)

3.2.5 에틸아세테이트(Ethyl Acetate)

4. 시험과정

4.1 용매혼합용액 제조

4.1.1 헥산 1000 mL, 에탄올 600 mL, 아세톤 700 mL, 톨루엔 700 mL을 2000 mL 부피플라스크에 담아 흔들어 섞는다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료(루테인으로서) 80～120 mg을 100 mL 부피플라스크에 담는다.

4.2.2 용매혼합용액(헥산:에탄올: 아세톤:톨루엔 10:6:7:7)을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.2.3 위 시료혼합액 중 1 mL을 취하여 100 mL 부피플라스크에 담고 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3 정량시험

4.3.1 에탄올을 대조액으로 하여 4.2.3 용액을 자외분광광도계 446 nm에서 흡광도를 측정한다.

4.3.2 4.2.3용액 1 mL을 취한 후 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨 후 이동상 2 mL을 넣어 충분히 용해시킨 것을 액체크로마토그래피로 측정한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	30 ℃
이동상	헥산:에틸아세테이트 (70:30)
검출기 파장	446 nm
유량	1.5 mL/분
분석시간	25분

5.2 계산

5.2.1 총카로티노이드 함량(%)=(A×10,000) /(B×2,550)

A : 446 nm에서 측정된 흡광도시료의 농도(μg/mL)

B : 시료의 채취량(g)

2,550  : 에탄올 분산 제형에서 루테인의 계수(1%, 1cm)

10,000 : 희석배수

5.2.2 루테인 함량(%) = 총 카로티노이드 함량(%)×(루테인 peak 면적(%)/100)

Ⅲ.3.5.15를 다음과 같이 신설한다.

Ⅲ.3.5.15 아스타잔틴

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료를 아세톤으로 녹여 추출하고 cholesterolesterase를 넣어 아스타잔틴에 붙어있는 ester기를 분리시켜, 정제하여 아세톤으로 녹인 것을 실리카 칼럼을 통하여 아스타잔틴을 분리하는 방법으로 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(200 mL, 100 mL)

2.1.2 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.5 원심분리기

2.1.6 10 mL 원심분리관

2.1.7 초음파진탕기

2.1.8 항온수조

2.1.9 감압농축기

2.2 분석장비

2.2.1 자외분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer)

2.2.2 고속액체크로마토그래프

2.2.3 자외부흡광광도검출기

2.2.4 YMC Carotenoid 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250mm) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상인 메탄올, MTBE, 1% 인산용액(81:15:4)을 분당 1.0 mL씩 충분한 시간동안 흘려 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 아스타잔틴(Astaxanthin)

Astaxanthin(3,3'-Dihydroxy-β,β-carotene-4,4'-dione)

분자식 : C40H52O4, 분자량 : 596.84, CAS No. : 19044-06-5

3.2 일반시약

3.2.1 헥산(Hexane)

3.2.2 아세톤(Acetone)

3.2.3 석유 에테르(petroleum ether)

3.2.4 메탄올(Methanol)

3.2.5 MTBE(t-buthylmethylether)

3.2.6 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)

3.2.7 황산나트륨(Sodium sulfate decahydrate)

3.2.8 Cholesterolesterase(22unit/mg)

3.2.9 인산용액(Phosphoric acid)

3.2.10 무수황산나트륨(Sodium sulfate Anhydrous)

4. 시험과정

4.1 Cholesterol esterase 용액의 조제(사용직전에 조제)

4.1.1 Cholesterol esterase가 4 unit/mL이 되도록 50 mM Tris-HCL 완충액(pH7.0)에 용해 시킨다.

4.2 내부표준용액의 조제

4.2.1 내부표준용액(trans-β-apo-8'-Carotenal) 1 mg/mL 농도의 용액 7.5 mL을 200 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.2.2 아세톤 100 mL을 첨가하여 완전히 용해시킨 후 방냉한다.

4.2.3 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3 표준원액의 조제

4.3.1 아스타잔틴 표준품 5 mg을 200 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.3.2 100 mL의 아세톤을 넣고 10분간 초음파 처리하여 용해 후 방냉한다.

4.3.3 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.4 표준용액 농도산출을 위한 시험

4.4.1 30 mL 부피플라스크에 표준 원액 1.5 mL 3.0 mL, 3.6 mL을 정밀히 취한다.

4.4.2 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.4.3 4.4.2용액을 아세톤을 대조액으로 하여 474nm에서 흡광도를 측정한다.

4.5 HPLC 측정을 위한 표준용액 조제

4.5.1 30 mL 부피플라스크에 표준 원액 1.5 mL 3.0 mL, 3.6 mL을 정밀히 취한다.

4.5.2 내부표준용액 10 mL을 넣는다.

4.5.3 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.6 시험용액의 조제

4.6.1 시료를 60～70 ℃ 수욕 상에서 가온하여 시료를 용해시킨다.

(시료가 응고되어 있거나 침전물 발생시)

4.6.2 용해된 시료(아스타잔틴으로서) 약 50 mg을 100 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.6.3 아세톤 50 mL을 넣어 완전히 용해시킨 후 표선까지 맞춘다

4.6.4 4.6.3용액을 아세톤으로 10배 희석한 것을 시험용액으로 한다.

4.6.5 10 mL 원심분리관에 시험용액 3 mL 내부표준용액 1 mL, Cholesterol esterase 용액 3 mL을 넣는다.

4.6.6 37 ℃ 수욕상에서 5～15분마다 흔들어주면서 45분간 반응시킨다.

4.6.7 효소 분해 후 황산나트륨 1 g과 석유 에테르 2 mL을 첨가한다.

4.6.8 위 용액을 30초간 혼합 후 2,000 G로 3분간 원심 분리한다.

4.6.9 석유에테르층을 취한 것에 황산나트륨 1 g을 넣어 탈수한다.

4.6.10 탈수된 석유 에테르층을 감압 농축하여 건조 후 아세톤 3 mL을 넣어 초음파 처리하여 용해시킨다.

4.6.11 위 용액을 0.45μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	25 ℃
이동상	A : 메탄올, B : MTBE, C : 1%인산용액
유속	1.0 mL/분
검출기 파장	474 nm

표 2. 이동상 조건(예)

시간	A용액 (%)	B용액 (%)	C용액 (%)
0	81	15	4
15	66	30	4
23	16	80	4
27	16	80	4
27.1	81	15	4
35	81	15	4

5.2 계산

5.2.1 아스타잔틴의 농도(μg/mL) = (474nm흡광도×10,000)/2,100

2,100 : 474nm에서 1cm cuvette의 1%  아스타잔틴의 기준 흡광도값

5.2.2 내부표준물질 대비 아스타잔틴 이성질체 RT

(이성질체의 상대머무름시간 = 각 아스타잔틴 이성체의 머무름시간/내부표준물질 머무름시간)

아스타잔틴의 이성질체명	상대머무름시간
13-cis 아스타잔틴	0.545
trans 아스타잔틴	0.606
9-cis 아스타잔틴	0.800

5.2.3 면적비=(Ptrans+(1.3×P13-cis)× (1.1×P9-cis))/Pi.s

Ptrans A : trans 아스타잔틴의 피크면적

P13-cis A : 13-cis 아스타잔틴의 피크면적

P9-cis A : 9-cis 아스타잔틴의 피크면적

1.3 : 13-cis를 trans 아스타잔틴으로 전환계수

1.1 : 9-cis를 trans 아스타잔틴으로 전환계수

5.2.4 아스타잔틴의 함량(%)=A×(1000*/B) ×1/1000×1000

A : 시험용액 중 아스타잔틴의 농도 (μg/mL)

B : 시료 채취량(mg)

1000* : 시험용액의 전량(mL)

Ⅲ.3.6.7을 다음과 같이 신설한다.

Ⅲ.3.6.7 코엔자임Q10

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 코엔자임Q10을 에탄올 용액으로 추출하여 액체크로마로그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 275nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인필터 및 디스크형 멤브레인필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 부피플라스크(50 mL)

2.1.5 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm,  충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 메탄올과 에탄올 13:7로 혼합한 용액을 이용하여 분당 1.0 mL를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 코엔자임Q10(Coenzyme Q10, Ubiquinone, Ubidecarenone)

분자식 : C59H90O5, 분자량 : 863.37, CAS No. : 303-98-0

3.2 일반시약

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 메탄올(Methanol)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 코엔자임Q10 표준물질 50 mg을 정밀히 측정한다.

4.1.2 정밀히 측정한 표준물질을 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.3 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.1.4 에탄올로 적당히 희석하여 표준용액으로 한다

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료(코엔자임Q10으로서) 약 50 mg을 정밀히 측정한다.

4.2.2 정밀히 측정한 시료를 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.3 여기에 에탄올을 20 mL를 넣고 조심스럽게 흔든다.

4.2.4 시료가 전부 용해될 때까지 초음파진탕기로 용해시킨다.

4.2.5 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.2.6 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 용액을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	35 ℃
이동상	메탄올:에탄올(13:7)
검출기 파장	275 nm
유속	1.3 mL/분

5.2 결과 분석

코엔자임Q10(mg/g)= A×(B/S)×P×(1/1,000)

A  : 시료의 농도(μg/mL)

B  : 시험용액의 전량(mL)

S  : 시료채취량(g)

P  : 표준품의 순도

Ⅲ.3.6.8을 다음과 같이 신설한다.

Ⅲ.3.6.8 대두이소플라본

Ⅲ.3.6.8.1 대두이소플라본(제1법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 메탄올을 이용하여 시료 중 이소플라본을 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 260 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(100 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm, 충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상을 이용하여 용매를 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 이소플라본류

3.1.1.1 다이드진(Daidzin)

분자식 : C21H20O9, 분자량 : 416.38, CAS No. : 552-66-9

3.1.1.2. 글리시틴(Glycitin)

분자식 : C22H22O10, 분자량 : 446.41, CAS No. : 40246-10-4

3.1.1.3. 제니스틴(Genistin)

분자식 : C21H20O10, 분자량 : 432.38, CAS No. : 529-59-9

3.1.1.4. 다이드제인(Daidzein)

분자식 : C15H10O4, 분자량 : 254.23, CAS No. : 486-66-8

3.1.1.5. 제니스테인(Genistein)

분자식 : C15H10O5, 분자량 : 270.24, CAS No. : 446-72-0

3.1.1.6. 글리시테인(Glycitein)

분자식 : C16H12O5, 분자량 : 284.26, CAS No. : 40957-83-3

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol)

3.2.2 아세토니트릴(Acetonitril)

3.2.3 초산(Acetic acid)

3.2.4 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 각각의 이소플라본(Daidzin, Genistin, Glycitin, Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준물질 50 mg을 정밀히 측정한다.

4.1.2 정밀히 측정한 표준물질을 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.3 배당체(Daidzin, Genistin, Glycitin) 표준품은 메탄올을 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.3 비배당체(Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준품은 Dimethylsulfoxide를 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.4 위의 용액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 시료 약 0.5 g을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취하여 메탄올로 정용한다.

4.2.2 30분간 초음파 처리한다.

4.2.3 0.45μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40 ℃
이동상	A : 물/메탄올/초산(88:10:2) B: 메탄올/초산(98:2)
검출기 파장	260nm
유량	1.0ml/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간	A용액 (%)	B용액 (%)
0	90	10
21	60	40
32	60	40
35	40	60
36	90	10

5.2 계산

5.2.1 이소플라본 함량(mg/g)= A×(B/S)×P×(1/1,000)

A  : 시료의 농도(μg/mL)

B  : 시험용액의 전량(mL)

S  : 시료채취량(g)

P  : 표준품의 순도

※ 이소플라본 배당체일 경우 1/1.6(0.625) 전환계수 적용함

Ⅲ.3.6.8.2 대두이소플라본(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 메탄올을 이용하여 시료 중 이소플라본을 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 260 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 삼각플라스크(250 mL)

2.1.2 항온수조

2.1.3 원심분리기

2.1.4 용매용 일회용 실린지

2.1.5 여과용 멤브레인 필터

2.1.6 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.7 부피플라스크(50 mL)

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상을 이용하여 용매를 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 이소플라본류

3.1.1.1. 다이드제인(Daidzein)

분자식 : C15H10O4, 분자량 : 254.23, CAS No. : 486-66-8

3.1.1.2. 제니스테인(Genistein)

분자식 : C15H10O5, 분자량 : 270.24, CAS No. : 446-72-0

3.1.1.3. 글리시테인(Glycitein)

분자식 : C16H12O5, 분자량 : 284.26, CAS No. : 40957-83-3

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol)

3.2.2 초산(Acetic acid)

3.2.3 증류수(Distilled water)

3.2.4 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

3.2.5 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 표준물질 각 20 mg을 정밀하게 취한다.

4.1.2 위의 표준물질을 50 mL 부피플라스크에 넣고 Dimethylsulfoxide를 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.3 위 용액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 시료 10 g을 정밀히 취한다.

4.2.2 위의 시료를 250 mL 삼각플라스크에 넣는다.

4.2.3 여기에 80% 메탄올 40 mL를 넣은 후 호일을 씌운다.

4.2.4 65℃ 항온수조에서 2시간 추출한다.

4.2.5 냉각시킨 후 2 M 수산화나트륨용액 3 mL를 넣는다.

4.2.6 이를 상온에서 10분간 회전 교반한 후 빙초산 1 mL를 넣는다.

4.2.7 80% 메탄올을 사용하여 50 mL로 하여 혼합한다.

4.2.8 여액 5 mL에 증류수 4 mL를 넣고 메탄올을 사용하여 10mL로 한다.

4.2.9 5,000 G 로 5분간 원심분리한 상등액을 0.45 um 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10μL
칼럼온도	40℃
이동상	A : 물:메탄올:초산(88:10:2) B: 메탄올:초산(98:2)
검출기 파장	260nm
유량	1.0ml/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간	A용액(%)	B용액(%)
0	90	10
21	60	40
32	60	40
35	40	60
36	90	10

5.2 계산

각 이소플라본(비배당체) 함량(mg/g)=A×(B/S)×P×(1/1,000)

A : 시료의 농도(μg/mL)

B : 시험용액의 전량(mL)

S : 시료채취량(g)

P : 표준품의 순도

부  칙(2010.  .  .)

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날로부터 시행한다.

신․구조문대비표

현행

개정안

Ⅰ. 공통기준 및 규격

Ⅰ.1 1) ～ 3) (생 략)

4) 원재료

(1) (생 략)

(2) (가) ～ (다) (생 략)

(라) 건강기능식품용수에 사용하는 수처리제 등은 「먹는물관리법」에, 주정은 「주세법」에, 원료소금은 「염관리법」에, 축산물은 「축산물가공처리법」에 적합한 것이어야 함

Ⅰ. 공통기준 및 규격

Ⅰ.1 1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 원재료

(1) (현행과 같음)

(2) (가) ～ (다) (현행과 같음)

(라) 건강기능식품에 사용하는  주정은 「주세법」에 따른 품질기준에, 원료소금 및 수처리제 등은 「식품의 기준 및 규격」에, 축산물 및 그 가공품은 「축산물가공처리법」에 적합한 것이어야 함

Ⅰ.2 공통 제조기준

1) 이 공전에 의한 건강기능식품은  일상식사에서 부족 될 수 있는 영양소를 보충하거나 인체에 유용한 기능성 원료를 보충할 목적으로, 캡슐ㆍ정제ㆍ분말ㆍ과립ㆍ액상ㆍ환ㆍ편상ㆍ페이스트상ㆍ시럽ㆍ겔ㆍ젤리ㆍ바 등의 형태로 1회 섭취가 용이하게 제조ㆍ가공되어야 한다.

일반 식품 또는 식사를 대신할 수 있는 식품유형은 「건강기능식품에 관한 법률」 제14조제2항 및 제15조제2항에 따라 식품의약품안전청장의 인정을 받아야 한다.

2) ～ 8) (생 략)

9) (생 략)

(1) 허용대상 건강기능식품별 흡수선량

허용대상	흡수선량
알로에분말	7 kGy이하
인삼, 홍삼	7 kGy이하
클로렐라, 스피루리나	7 kGy이하

10) (생 략)

(1) ～ (2) (생 략)

(3) 건강기능식품의 제조에 사용하는 물은 「먹는물 관리법」에 적합한 것이어야 한다

(4) ～(8) (생 략)

<신  설>

Ⅰ.2 공통 제조기준

1) 이 규정에 따른 건강기능식품은 인체에 보건 목적의 유용한 효과를 얻기 위한 기능성 원료 또는 성분의 섭취를 주된 목적으로, 정제ㆍ캡슐ㆍ환ㆍ과립ㆍ액상ㆍ분말ㆍ편상ㆍ페이스트상ㆍ시럽ㆍ겔ㆍ젤리ㆍ바 의 형태로 1회 섭취가 용이하게 제조ㆍ가공되어야 하며, 최종제품의 제조 시 기능성 원료의 특성이 변화될 수 있는 추출, 정제, 발효 등의 제조․가공을 하여서는 아니된다.

---------------------------- ------------------「건강기능식품 기준 및 규격 인정에 관한 규정」에 --------------------- ---------------------

2) ～ 8) (현행과 같음)

9) (현행과 같음)

(1) 허용대상 건강기능식품별 흡수 선량

허용대상	흡수선량
알로에분말제품	7 kGy이하
인삼제품, 홍삼제품
클로렐라제품, 스피루리나제품

10) (현행과 같음)

(1) ～ (2) (현행과 같음)

(3) -------------------------  -------「먹는물관리법」의 먹는물 수질기준에 적합한 것이어야 한다.

(4) ～(8) (현행과 같음)

(9) 건강기능식품 포장 내부의 습기, 냄새, 산소 등을 제거하여 제품의 품질을 유지시킬 목적으로 사용되는 물질은 「기구 및 용기ㆍ포장의 기준 및 규격」에 적합한 포장재를 사용하여 건강기능식품에 이행되지 않도록 포장하여야 한다.

Ⅰ.3 공통규격

1) (생 략)

(1) (생 략)

(가) ～ (바) (생 략)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

(2) ～ (3) (생 략)

2) (생 략)

Ⅰ.3 공통규격

1) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(가) ～ (바) (현행과 같음)

(사) 편상(flake)이란 얇고 편편한 조각상태의 것을 말함

(아) 페이스트상(paste)이란 고체와 액체의 중간상태로 점성이 강한 유동성의 반 고상의 것을 말함

(자) 시럽(syrup)이란 고체와 액체의 중간상태로 점성이 약한 유동성의 반 액상의 것을 말함

(차) 겔(gel)이란 액상에 펙틴, 젤라틴, 한천 등 겔화제를 첨가하여 만든 유동성이 있는 고체나 반고체 상태의 것을 말함

(카) 젤리(jelly)란 액상에 펙틴, 젤라틴, 한천 등 겔화제를 첨가하여 만든 유동성이 없는 고체나 반고체 상태의 것을 말함

(타) 바(bar)란 막대형태의 것을 말함

(2) ～ (3) (현행과 같음)

2) (현행과 같음)

Ⅰ.4 (생 략)

Ⅰ.4 (현행과 같음)

Ⅰ.5 (생 략)

Ⅰ.5 (현행과 같음)

Ⅰ.6 보존 및 유통기준

1) ～ 8) (생 략)

9) 포장된 건강기능식품은 소분 판매하지 말아야 하며, 「건강기능식품의 표시기준」(식품의약품안전청 고시)에 적합하지 않거나 표시가 없는 것을 구입하거나 판매하지 말아야 한다.

10) ～ 12) (생 략)

Ⅰ.6 보존 및 유통기준

1) ～ 8) (현행과 같음)

9) ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 보존----------------

------

10) ～ 12) (현행과 같음)

Ⅰ.7 (생 략)

Ⅰ.7 (현행과 같음)

Ⅱ. 개별기준 및 규격

Ⅱ.1 (생 략)

Ⅱ.1.1 ～ Ⅱ.1.4 (생 략)

Ⅱ. 개별기준 및 규격

Ⅱ.1 (현행과 같음)

Ⅱ.1.1 ～ Ⅱ.1.4 (현행과 같음)

Ⅱ.2 기능성 원료

Ⅱ.2.1 (생 략)

Ⅱ.2.1.1 ～ Ⅱ.2.1.5 (생 략)

Ⅱ.2 기능성 원료

Ⅱ.2.1 (현행과 같음)

Ⅱ.2.1.1 ～ Ⅱ.2.1.5 (현행과 같음)

Ⅱ.2.2 페놀류

Ⅱ.2.2.1 ～ Ⅱ.2.2.3 (생 략)

Ⅱ.2.2 페놀류

Ⅱ.2.2.1 ～ Ⅱ.2.2.3 (현행과 같음)

Ⅱ.2.2.4 코엔자임Q10

1) ～ 3) (생 략)

<신 설>

Ⅱ.2.2.4 코엔자임Q10

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 시험법

(1) 코엔자임Q10 : Ⅲ.3.6.7 코엔자임Q10

(2) 잔류용매 : Ⅲ.2.5.5 초산에틸, [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.2.5 대두이소플라본

1) ～ 3) (생 략)

<신 설>

Ⅱ.2.2.5 대두이소플라본

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 시험법

(1) 대두이소플라본 : Ⅲ.3.6.8 대두이소플라본

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3 지방산 및 지질류

Ⅱ.2.3.1 ～ Ⅱ.2.3.10 (생 략)

Ⅱ.2.3 지방산 및 지질류

Ⅱ.2.3.1 ～ Ⅱ.2.3.10 (현행과 같음)

Ⅱ.2.3.11 루테인

1) ～ 3) (생 략)

<신 설>

Ⅱ.2.3.11 루테인

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 시험법

(1) 루테인 : Ⅲ.3.5.14 루테인

(2) 잔류용매 : Ⅲ.2.5.5 초산에틸, [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.12 헤마토코쿠스 추출물

1) ～ 3) (생 략)

<신 설>

Ⅱ.2.3.12 헤마토코쿠스 추출물

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 시험법

(1) 아스타잔틴 : Ⅲ.3.5.15 아스타잔틴

(2) 아세톤 : [별표 4] 참조

(3) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(4) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.3.13 쏘팔메토 열매 추출물

1) ～ 3) (생 략)

<신 설>

Ⅱ.2.3.13 쏘팔메토 열매 추출물

1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 시험법

(1) 로르산 : Ⅲ.3.5.1 지방산

(2) 납, 카드뮴, 총수은, 총비소 : [별표 4] 참조

(3) 대장균군 : [별표 4] 참조

Ⅱ.2.4 당 및 글루코사민

Ⅱ.2.4.1 ～ Ⅱ.2.4.3 (생 략)

Ⅱ.2.4 당 및 글루코사민

Ⅱ.2.4.1 ～ Ⅱ.2.4.3 (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.4 식이섬유

Ⅱ.2.4.4.1 구아검/구아검가수분해물

1) ～ 2) (생 략)

3) 최종제품의 요건

(1) (생 략)

(2) 일일섭취량

(가) 콜레스테롤 개선 : 구아검 또는 이의 가수분해물로서 15～27g

(나) 식후혈당상승 억제에 도움 : 구아검 또는 이의 가수분해물로서 15～27g

(다) 배변활동 원활 : 구아검 또는 이의 가수분해물로서 15～27g

4) (생 략)

Ⅱ.2.4.4 식이섬유

Ⅱ.2.4.4.1 구아검/구아검가수분해물

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) 최종제품의 요건

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량

(가) 콜레스테롤 개선 : 구아검/구아검가수분해물 식이섬유로서 9.9～27g

(나) 식후혈당상승 억제에 도움 : 구아검/구아검가수분해물 식이섬유로서 9.9～27g

(다) 배변활동 원활 : 구아검/구아검가수분해물 식이섬유로서 9.9～27g

4) (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.4.2 글루코만난(곤약, 곤약만난)

1) ～ 2) (생 략)

3) 최종제품의 요건

(1) (생 략)

(2) 일일섭취량

(가) 콜레스테롤 개선 : 글루코만난으로서 4～17g

(나) 배변활동 원활 : 글루코만난으로서 4～17g

4) (생 략)

Ⅱ.2.4.4.2 글루코만난(곤약, 곤약만난)

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) 최종제품의 요건

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량

(가) 콜레스테롤 개선 : 글루코만난 식이섬유로서 2.76～17g

(나) 배변활동 원활 : 글루코만난식이섬유로서 2.76～17g

4) (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.4.3 (생 략)

Ⅱ.2.4.4.3 (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.4.4 난소화성말토덱스트린

1) ～ 2) (생 략)

3) 최종제품의 요건

(1) (생 략)

(2) 일일섭취량(난소화성말토덱스트린으로서)

(가) 식후혈당상승억제 : 14～17g(액상원료는 20～43g)

(나) 배변활동 원활 : 3～29g(액상원료는 4～43g)

4) (생 략)

Ⅱ.2.4.4.4 난소화성말토덱스트린

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) 최종제품의 요건

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량

(가) 식후혈당상승억제 : 난소화성말토덱스트린 식이섬유로서 11.9～29g(액상원료는 11.6～43g)

(나) 배변활동 원활 : 난소화성말토덱스트린 식이섬유로서 2.55～29g(액상원료는 2.32～43g)

4) (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.4.5 ～ Ⅱ.2.4.4.8 (생 략)

Ⅱ.2.4.4.5 ～ Ⅱ.2.4.4.8 (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.4.9 아라비아검(아카시아검)

1) ～ 2) (생 략)

3) 최종제품의 요건

(1) (생 략)

(2) 일일섭취량

아라비아검으로서 25g

Ⅱ.2.4.4.9 아라비아검(아카시아검)

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) 최종제품의 요건

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량

아라비아검 식이섬유로서 20g

Ⅱ.2.4.4.10 (생 략)

Ⅱ.2.4.4.10 (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.4.11 이눌린/치커리추출물

1) ～ 2) (생 략)

3) 최종제품의 요건

(1) (생 략)

(2) 일일섭취량

(가) 콜레스테롤 개선 : 이눌린으로서 9～10g

(나) 식후혈당상승 억제에 도움 : 이눌린으로서 9～10g

(다) 배변활동 원활 : 이눌린으로서 8～20g

4) (생 략)

Ⅱ.2.4.4.11 이눌린/치커리추출물

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) 최종제품의 요건

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량

(가) 콜레스테롤 개선 : 이눌린/치커리추출물 식이섬유로서 7.2～10g

(나) 식후혈당상승 억제에 도움 : 이눌린/치커리추출물 식이섬유로서 7.2～10g

(다) 배변활동 원활 : 이눌린/치커리추출물 식이섬유로서 6.4～20g

4) (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.4.12 차전자피

1) ～ 2) (생 략)

3) 최종제품의 요건

(1) (생 략)

(2) 일일섭취량

(가) 콜레스테롤 개선 : 차전자피로서 7g 이상

(나) 배변활동 원활 : 차전자피로서 5～25g

(3) (생 략)

4) (생 략)

Ⅱ.2.4.4.12 차전자피

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) 최종제품의 요건

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량

(가) 콜레스테롤 개선 : 차전자피식이섬유로서 5.53g 이상

(나) 배변활동 원활 : 차전자피 식이섬유로서 3.95～25g

(3) (현행과 같음)

4) (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.4.13 폴리덱스트로스

1) ～ 2) (생 략)

3) 최종제품의 요건

(1) (생 략)

(2) 일일섭취량

폴리덱스트로스로서 7～12g

4) (생 략)

Ⅱ.2.4.4.13 폴리덱스트로스

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) 최종제품의 요건

(1) (현행과 같음)

(2) 일일섭취량

폴리덱스트로스 식이섬유로서 4.55～12g

4) (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.4.14 (생 략)

Ⅱ.2.4.4.14 (현행과 같음)

Ⅱ.2.4.5 ～ Ⅱ.2.6 (생 략)

Ⅱ.2.4.5 ～ Ⅱ.2.6 (현행과 같음)

Ⅲ. 건강기능식품시험법

Ⅲ.1 일반원칙 ～ Ⅲ.2.5 유해물질시험법 (생 략)

Ⅲ. 건강기능식품시험법

Ⅲ.1 일반원칙 ～ Ⅲ.2.5 유해물질시험법 (현행과 같음)

Ⅲ.3 개별 성분별 시험법

Ⅲ.3.1 비타민

Ⅲ.3.1.1 비타민 A～ Ⅲ.3.1.7 비타민 B2(생 략)

Ⅲ.3 개별 성분별 시험법

Ⅲ.3.1 비타민

Ⅲ.3.1.1 비타민 A～ Ⅲ.3.1.7 비타민 B2 (현행과 같음)

Ⅲ.3.1.8 나이아신

Ⅲ.3.1.8.1 나이아신(제1법)～ Ⅲ.3.1.8.2 나이아신(제2법) (생 략)

<신  설>

Ⅲ.3.1.8 나이아신

Ⅲ.3.1.8.1 나이아신(제1법)～ Ⅲ.3.1.8.2 나이아신(제2법) (현행과 같음)

Ⅲ.3.1.8.3 나이아신(제3법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 니코틴산(나이아신)을 이동상으로 추출, 정제한 후 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수 파장인 260nm에서 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 HLB 카트리지 : N-vinylpyrolidine과 divinylbenzene이 copolymer 형태로 결합된 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 3mL) 또는 이와 동등한 것

2.1.3 여과용 멤브레인 필터

2.1.4 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.5 부피플라스크(100 mL)

2.1.6 원심분리기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그패프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 A용액(5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액), B용액( 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 메탄올 (35 : 65)) 을 이용하여 용매를 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 Nicotinic acid(3-Picolinic acid; Niacin; Pellagra preventive factor; Pyridine-3-carboxylic acid; Vitamin B3)

분자식 : C6H5NO2, 분자량 : 123.11, CAS No. : 59-67-6

3.2 일반시약

3.2.1 초산(Acetic acid)

3.2.2 헥산설폰산나트륨(Sodium hexanesulfonate)

3.2.3 메탄올(Methanol)

3.2.4 헥산(n-Hexane)

3.2.5 증류수(Distilled water)

4. 시험과정

4.1 시약제조

4.1.1 5 mM sodium hexanesulfonate 용액

Sodium hexanesulfonate 911.1 mg을 증류수 500 mL에 녹여 증류수로 1 L가 되게 한다.

4.2 표준용액의 조제

4.2.1 니코틴산 및 니코틴산아미드를 각각 증류수로 녹여 100 mg/L 로 제조하여 표준원액으로 한다

4.2.2 표준원액을 증류수로 적당히 희석하여 표준용액으로 만든다.

4.3 시험용액의 조제

4.3.1 시료를 취하여 균일하게 잘게 부순 후 적당량(1～10g)을 취한다.

4.3.2 100 mL 부피플라스크에 넣고 5 mM Sodium hexanesulfonate 용액을 넣는다.

4.3.3 30분간 초음파 추출한다.

4.3.4 5 mM Sodium hexanesulfonate 용액을 넣어 표선까지 맞춘다

4.3.5 0℃, 15,000 G로 30분간 원심분리하여 상등액을 취해 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과한다.

4.3.6 HLB 카트리지를 준비하고 메탄올 5 mL과 증류수 5 mL을 연속으로 통과시킨 후 카트리지에 여과액 10 mL를 통과시켜 니코틴산 및 니코틴산아미드가 카트리지에 흡착되도록 한다.

4.3.7 카트리지는 5 mL의 n-헥산으로 세척한 후 80% 메탄올용액 5 mL로 용출한다.

4.3.8 용출액은 10 mL 부피플라스크에 모으고 증류수를 가하여 10 mL로 정용한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40℃
이동상	A : 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 B : 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 메탄올 (35 : 65)
검출기 파장	260 nm
유량	1.0 mL/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간(분)	A용액(%)	B용액(%)
0	100	0
3	100	0
13	70	30
20	70	30

5.2 계산

5.2.1 니코틴산(mg/100g) = C × (a × b)/S × 100/1,000

C : 시험용액 중의 니코틴산의 농도(ug/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

Ⅲ.3.1.9 비타민 B6～ Ⅲ.3.1.10 판토텐산 (생 략)

Ⅲ.3.1.9 비타민 B6～ Ⅲ.3.1.10 판토텐산 (현행과 같음)

Ⅲ.3.1.11 엽산

<신  설>

1. ～ 5. (생 략)

Ⅲ.3.1.11 엽산

Ⅲ.3.1.11.1 엽산(제1법)

1. ～ 5. (현행과 같음)

<신  설>

Ⅲ.3.1.11.2 엽산(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 이동상으로 시료 중 엽산을 충분히 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 280 nm에서 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1. 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.5 원심분리기

2.2. 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 A용액(5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액), B용액(5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액: 메탄올(70:30))을 이용하여 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1. 표준물질

3.1.1 엽산(Folic acid)

분자식 : C19H19N7O6, 분자량 : 441.40, CAS No. : 59-30-3

3.2. 일반시약

3.2.1 수산화나트륨(Sodium chloride)

3.2.2 증류수(Distilled water)

3.2.3 헥산설폰산나트륨(Sodium hexanesulfonate)

3.2.4 초산(Acetic acid)

3.2.5 메탄올(Methanol)

4. 시험과정

4.1 시약 제조

4.1.1 0.1 N 수산화나트륨 용액(Sodium hydroxide)

1 N 수산화나트륨액을 취하여 증류수로 10배 용량으로 희석하여 사용하거나 수산화나트륨 4.5 g을 취하여 일정량의 증류수에 녹이고 1 L 부피플라스크에 옮겨 담은 후 증류수를 표선까지 채운 다음 표정하여 사용한다.

4.1.2 5 mM Sodium hexanesulfonate /0.1% 초산 용액

Sodium hexanesulfonate 911.1 mg을 증류수 500 mL에 녹이고 초산 1 mL를 첨가한 후 증류수에 녹여 1 L가 되게 한다.

4.2 표준용액의 조제

4.2.1 엽산 표준물질을 0.1 N 수산화나트륨 용액에 녹여 1000 mg/L가 되도록 조제한다.

4.2.2 표준원액을 증류수로 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.3 시험용액의 조제

4.3.1 시료 일정량을 정밀히 취한다.

4.3.2 위의 시료를 50 mL 부피플라스크에 넣고 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액을 넣는다.

4.3.3 30분 동안 초음파 추출한다.

4.3.4 5 mM Sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3.5 35,000 G로 10분간 원심분리를 하고 상등액을 취해 0.2 um 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표.1 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40 ℃
이동상	A : 5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 B : 5 mM sodium hexanesulfonate/0.1% 초산 용액 : 메탄올(35:65)
검출기파장	280 nm
유속	1.0 mL/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간(분)	A용액(%)	B용액(%)
0	70	30
5	70	30
15	60	40

5.2 계산

5.2.1 엽산(mg/100g) = C × (a × b) / S × 100 / 1,000

C : 시험용액 중의 엽산의 농도(ug/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

Ⅲ.3.1.12 비타민 B12 (생 략)

Ⅲ.3.1.12 비타민 B12 (현행과 같음)

Ⅲ.3.1.13 비오틴

<신  설>

1 ～ 5 (생 략)

Ⅲ.3.1.13 비오틴

Ⅲ.3.1.13.1 비오틴(제1법)

1 ～ 5 (현행과 같음)

<신  설>

Ⅲ.3.1.13.1 비오틴(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 비오틴을 이동상으로 충분히 추출하고 액체크로마토그래프(육방전환밸브시스템)/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 200 nm에서 정량분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1. 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.5 원심분리기

2.2. 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 육방전환밸브시스템

2.2.4 칼럼오븐

2.2.5 칼럼

2.2.5.1 전처리 컬럼 : Capcellpak MF SCX, SG80(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm) 또는 이와 동등한 것

2.2.5.2 농축 컬럼 : Capcellpak C18 UG120V(안지름 2.0 mm, 길이 35 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.2.5.3 분석 컬럼 : Capcellpak C18 UG120V(안지름 1.5 mm, 길이 250 mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 0.01 M 인산이수소칼륨용액과 0.01 M 인산이수소칼륨용액:메탄올(80:20)을 이용하여 전처리칼럼은 분당 500 uL, 분석칼럼은 분당 100 uL를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다

3. 표준물질 및 일반시약

3.1. 표준물질

3.1.1 비오틴(Biotin)

분자식 : C10H10N2O3S, 분자량 : 244.31, CAS No. : 58-85-5

3.2. 일반시약

3.2.1 인산이수소칼륨(Potassium dihydrogen phosphate)

3.2.2 증류수(Distilled water)

3.2.3 메탄올(Methanol)

4. 시험과정

4.1 시약 제조

4.1.1 0.01 M 인산이수소칼륨 용액(pH 4.8)

인산이수소칼륨 1.35 g을 증류수에 녹여 1 L로 한다.

4.2 표준용액의 조제

4.2.1 비오틴 표준물질을 0.01 M 인산이수소칼륨용액에 녹여 1,000 mg/L가 되도록 조제한다. (4℃ 이하 암소 보관)

4.2.2 상기 표준원액을 0.01 M 인산이수소칼륨용액으로 희석하여 표준용액으로 사용한다.(사용시 제조)

4.3 시험용액의 조제

4.3.1 균질화한 시료 일정량(약 5g)을 정밀히 취한다.

4.3.2 위의 시료를 50 mL 갈색 부피플라스크에 넣고 0.01 M 인산이수소칼륨용액을 넣는다.

4.3.3 30분 동안 초음파 추출한다.

4.3.4 0.01 M 인산이수소칼륨용액 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3.5 추출액을 원심분리관으로 옮겨 10분간 shaker에서 격렬하게 흔든다

4.3.6 0 ℃, 35,000 G로 30분간 원심분리한 후 상층액을 취한다.

4.3.7 이 액을 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	100 μL
칼럼온도	40℃
이동상	전처리컬럼 : 0.01 M 인산이수소칼륨용액 분 석 컬 럼 : 0.01 M 인산이수소칼륨용액/메탄올(80:20)
검출기파장	200 nm
유속	전처리컬럼 : 500 μL/분 분석컬럼 : 100 μL/분

5.2 계산

5.2.1 비오틴(mg/100g) = C × (a × b) / S × 100 / 1,000

C : 시험용액 중의 비오틴의 농도(ug/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

Ⅲ.3.1.14 비타민 C (생 략)

Ⅲ.3.1.14 비타민 C (현행과 같음)

Ⅲ.3.2 무기질 ～ Ⅲ.3.4 당 및 탄수화물류 (생 략)

Ⅲ.3.2 무기질 ～ Ⅲ.3.4 당 및 탄수화물류 (현행과 같음)

Ⅲ.3.5 지방산 및 지질류

Ⅲ.3.5.1 지방산 ～ Ⅲ.3.5.13 총(-)-Hydroxycitric acid (생 략)

<신  설>

Ⅲ.3.5 지방산 및 지질류

Ⅲ.3.5.1 지방산 ～ Ⅲ.3.5.13 총(-)-Hydroxycitric acid (현행과 같음)

Ⅲ.3.5.14 루테인

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 용매혼합용액으로 추출하고 에탄올로 희석한 용액을 자외분광광도계 446 nm에서 총 카로티노이드 함량을 구하고 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 446 nm에서 검출하여 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인필터 및 디스크형 멤브레인필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 부피플라스크(100 mL)

2.1.5 질소농축기

2.1.5 질소가스

2.2 분석장비

2.2.1 자외분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer)

2.2.2 고속액체크로마토그래프

2.2.3 자외부흡광광도검출기

2.2.4 silica 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진재 silica gel) 또는 이와 동등한 것

2.2.4 컬럼오븐

2.3 분석장비의 준비

이동상은 헥산과 에틸아세테이트를 70:30으로 혼합한 용액을 분당 1 mL씩 충분한 시간동안 흘려서 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 루테인(Lutein)

Lutein (3R,3"R,6"R-β,ε-carotene-3,3'-diol, l-trans-lutein, 5'didehydro-5'6'dihydro-beta, beta-caroene-3,3'diol)

분자식 : C40H56O2 분자량 : 568.871, CAS No. : 127-40-2

3.2 일반시약

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 헥산(Hexane)

3.2.3 아세톤(Acetone)

3.2.4 톨루엔(Ethanol)

3.2.5 에틸아세테이트(Ethyl Acetate)

4. 시험과정

4.1 용매혼합용액 제조

4.1.1 헥산 1000 mL, 에탄올 600 mL, 아세톤 700 mL, 톨루엔 700 mL을 2000 mL 부피플라스크에 담아 흔들어 섞는다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료(루테인으로서) 80～120 mg을 100 mL 부피플라스크에 담는다.

4.2.2 용매혼합용액(헥산:에탄올: 아세톤:톨루엔 10:6:7:7)을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.2.3 위 시료혼합액 중 1 mL을 취하여 100 mL 부피플라스크에 담고 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3 정량시험

4.3.1 에탄올을 대조액으로 하여 4.2.3 용액을 자외분광광도계 446 nm에서 흡광도를 측정한다.

4.3.2 4.2.3용액 1 mL을 취한 후 질소가스를 이용하여 완전히 건조시킨 후 이동상 2 mL을 넣어 충분히 용해시킨 것을 액체크로마토그래피로 측정한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	30 ℃
이동상	헥산:에틸아세테이트 (70:30)
검출기 파장	446 nm
유량	1.5 mL/분
분석시간	25분

5.2 계산

5.2.1 총카로티노이드 함량(%)=(A×10,000) /(B×2,550)

A : 446 nm에서 측정된 흡광도시료의 농도(μg/mL)

B : 시료의 채취량(g)

2,550  : 에탄올 분산 제형에서 루테인의 계수(1%, 1cm)

10,000 : 희석배수

5.2.2 루테인 함량(%) = 총 카로티노이드 함량(%)×(루테인 peak 면적(%)/100)

<신  설>

Ⅲ.3.5.15 아스타잔틴

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료를 아세톤으로 녹여 추출하고 cholesterolesterase를 넣어 아스타잔틴에 붙어있는 ester기를 분리시켜, 정제하여 아세톤으로 녹인 것을 실리카 칼럼을 통하여 아스타잔틴을 분리하는 방법으로 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 정량분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(200 mL, 100 mL)

2.1.2 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.5 원심분리기

2.1.6 10 mL 원심분리관

2.1.7 초음파진탕기

2.1.8 항온수조

2.1.9 감압농축기

2.2 분석장비

2.2.1 자외분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer)

2.2.2 고속액체크로마토그래프

2.2.3 자외부흡광광도검출기

2.2.4 YMC Carotenoid 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250mm) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상인 메탄올, MTBE, 1% 인산용액(81:15:4)을 분당 1.0 mL씩 충분한 시간동안 흘려 기기를 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 아스타잔틴(Astaxanthin)

Astaxanthin(3,3'-Dihydroxy-β,β-carotene-4,4'-dione)

분자식 : C40H52O4, 분자량 : 596.84, CAS No. : 19044-06-5

3.2 일반시약

3.2.1 헥산(Hexane)

3.2.2 아세톤(Acetone)

3.2.3 석유 에테르(petroleum ether)

3.2.4 메탄올(Methanol)

3.2.5 MTBE(t-buthylmethylether)

3.2.6 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)

3.2.7 황산나트륨(Sodium sulfate decahydrate)

3.2.8 Cholesterolesterase(22unit/mg)

3.2.9 인산용액(Phosphoric acid)

3.2.10 무수황산나트륨(Sodium sulfate Anhydrous)

4. 시험과정

4.1 Cholesterol esterase 용액의 조제(사용직전에 조제)

4.1.1 Cholesterol esterase가 4 unit/mL이 되도록 50 mM Tris-HCL 완충액(pH7.0)에 용해 시킨다.

4.2 내부표준용액의 조제

4.2.1 내부표준용액(trans-β-apo-8'-Carotenal) 1 mg/mL 농도의 용액 7.5 mL을 200 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.2.2 아세톤 100 mL을 첨가하여 완전히 용해시킨 후 방냉한다.

4.2.3 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.3 표준원액의 조제

4.3.1 아스타잔틴 표준품 5 mg을 200 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.3.2 100 mL의 아세톤을 넣고 10분간 초음파 처리하여 용해 후 방냉한다.

4.3.3 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.4 표준용액 농도산출을 위한 시험

4.4.1 30 mL 부피플라스크에 표준 원액 1.5 mL 3.0 mL, 3.6 mL을 정밀히 취한다.

4.4.2 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.4.3 4.4.2용액을 아세톤을 대조액으로 하여 474nm에서 흡광도를 측정한다.

4.5 HPLC 측정을 위한 표준용액 조제

4.5.1 30 mL 부피플라스크에 표준 원액 1.5 mL 3.0 mL, 3.6 mL을 정밀히 취한다.

4.5.2 내부표준용액 10 mL을 넣는다.

4.5.3 아세톤을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.6 시험용액의 조제

4.6.1 시료를 60～70 ℃ 수욕 상에서 가온하여 시료를 용해시킨다.

(시료가 응고되어 있거나 침전물 발생시)

4.6.2 용해된 시료(아스타잔틴으로서) 약 50 mg을 100 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.6.3 아세톤 50 mL을 넣어 완전히 용해시킨 후 표선까지 맞춘다

4.6.4 4.6.3용액을 아세톤으로 10배 희석한 것을 시험용액으로 한다.

4.6.5 10 mL 원심분리관에 시험용액 3 mL 내부표준용액 1 mL, Cholesterol esterase 용액 3 mL을 넣는다.

4.6.6 37 ℃ 수욕상에서 5～15분마다 흔들어주면서 45분간 반응시킨다.

4.6.7 효소 분해 후 황산나트륨 1 g과 석유 에테르 2 mL을 첨가한다.

4.6.8 위 용액을 30초간 혼합 후 2,000 G로 3분간 원심 분리한다.

4.6.9 석유에테르층을 취한 것에 황산나트륨 1 g을 넣어 탈수한다.

4.6.10 탈수된 석유 에테르층을 감압 농축하여 건조 후 아세톤 3 mL을 넣어 초음파 처리하여 용해시킨다.

4.6.11 위 용액을 0.45μm 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	25 ℃
이동상	A : 메탄올, B : MTBE, C : 1%인산용액
유속	1.0 mL/분
검출기 파장	474 nm

표 2. 이동상 조건(예)

시간	A용액 (%)	B용액 (%)	C용액 (%)
0	81	15	4
15	66	30	4
23	16	80	4
27	16	80	4
27.1	81	15	4
35	81	15	4

5.2 계산

5.2.1 아스타잔틴의 농도(μg/mL)           =(474nm흡광도×10,000)/2,100

2,100 : 474nm에서 1cm cuvette의 1%  아스타잔틴의 기준 흡광도값

5.2.2 내부표준물질 대비 아스타잔틴 이성질체 RT

(이성질체의 상대머무름시간 = 각 아스타잔틴 이성체의 머무름시간/내부표준물질 머무름시간)

아스타잔틴의 이성질체명	상대머무름시간
13-cis 아스타잔틴	0.545
trans 아스타잔틴	0.606
9-cis 아스타잔틴	0.800

5.2.3 면적비=(Ptrans+(1.3×P13-cis)× (1.1×P9-cis))/Pi.s

Ptrans A : trans 아스타잔틴의 피크면적

P13-cis A : 13-cis 아스타잔틴의 피크면적

P9-cis A : 9-cis 아스타잔틴의 피크면적

1.3 : 13-cis를 trans 아스타잔틴으로 전환계수

1.1 : 9-cis를 trans 아스타잔틴으로 전환계수

5.2.4 아스타잔틴의 함량(%)=A×(1000*/B) ×1/1000×1000

A : 시험용액 중 아스타잔틴의 농도 (μg/mL)

B : 시료 채취량(mg)

1000* : 시험용액의 전량(mL)

Ⅲ.3.6 페놀류

Ⅲ.3.6.1 카테킨 ～ Ⅲ.3.6.6 총 모나콜린K (생략)

Ⅲ.3.6 페놀류

Ⅲ.3.6.1 카테킨 ～ Ⅲ.3.6.6 총 모나콜린K (현행과 같음)

<신  설>

Ⅲ.3.6.7 코엔자임Q10

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 코엔자임Q10을 에탄올 용액으로 추출하여 액체크로마로그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 275nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 용매용 일회용 실린지

2.1.2 여과용 멤브레인필터 및 디스크형 멤브레인필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.4 부피플라스크(50 mL)

2.1.5 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm,  충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상은 메탄올과 에탄올 13:7로 혼합한 용액을 이용하여 분당 1.0 mL를 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 코엔자임Q10(Coenzyme Q10, Ubiquinone, Ubidecarenone)

분자식 : C59H90O5, 분자량 : 863.37, CAS No. : 303-98-0

3.2 일반시약

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2 메탄올(Methanol)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 코엔자임Q10 표준물질 50 mg을 정밀히 측정한다.

4.1.2 정밀히 측정한 표준물질을 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.3 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.1.4 에탄올로 적당히 희석하여 표준용액으로 한다

4.2 시험용액 제조

4.2.1 시료(코엔자임Q10으로서) 약 50 mg을 정밀히 측정한다.

4.2.2 정밀히 측정한 시료를 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.2.3 여기에 에탄올을 20 mL를 넣고 조심스럽게 흔든다.

4.2.4 시료가 전부 용해될 때까지 초음파진탕기로 용해시킨다.

4.2.5 에탄올을 넣어 표선까지 맞춘다.

4.2.6 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 용액을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	35 ℃
이동상	메탄올:에탄올(13:7)
검출기 파장	275 nm
유속	1.3 mL/분

5.2 결과 분석

코엔자임Q10(mg/g)= A×(B/S)×P×(1/1,000)

A  : 시료의 농도(μg/mL)

B  : 시험용액의 전량(mL)

S  : 시료채취량(g)

P  : 표준품의 순도

<신  설>

Ⅲ.3.6.8 대두이소플라본

Ⅲ.3.6.8.1 대두이소플라본(제1법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 메탄올을 이용하여 시료 중 이소플라본을 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 260 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(100 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm, 충진재 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상을 이용하여 용매를 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 이소플라본류

3.1.1.1 다이드진(Daidzin)

분자식 : C21H20O9, 분자량 : 416.38, CAS No. : 552-66-9

3.1.1.2. 글리시틴(Glycitin)

분자식 : C22H22O10, 분자량 : 446.41, CAS No. : 40246-10-4

3.1.1.3. 제니스틴(Genistin)

분자식 : C21H20O10, 분자량 : 432.38, CAS No. : 529-59-9

3.1.1.4. 다이드제인(Daidzein)

분자식 : C15H10O4, 분자량 : 254.23, CAS No. : 486-66-8

3.1.1.5. 제니스테인(Genistein)

분자식 : C15H10O5, 분자량 : 270.24, CAS No. : 446-72-0

3.1.1.6. 글리시테인(Glycitein)

분자식 : C16H12O5, 분자량 : 284.26, CAS No. : 40957-83-3

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol)

3.2.2 아세토니트릴(Acetonitril)

3.2.3 초산(Acetic acid)

3.2.4 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide)

4. 시험과정

4.1 표준용액 제조

4.1.1 각각의 이소플라본(Daidzin, Genistin, Glycitin, Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준물질 50 mg을 정밀히 측정한다.

4.1.2 정밀히 측정한 표준물질을 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.3 배당체(Daidzin, Genistin, Glycitin) 표준품은 메탄올을 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.3 비배당체(Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준품은 Dimethylsulfoxide를 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.4 위의 용액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 시료 약 0.5 g을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취하여 메탄올로 정용한다.

4.2.2 30분간 초음파 처리한다.

4.2.3 0.45μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
칼럼온도	40 ℃
이동상	A : 물/메탄올/초산(88:10:2) B: 메탄올/초산(98:2)
검출기 파장	260nm
유량	1.0ml/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간	A용액 (%)	B용액 (%)
0	90	10
21	60	40
32	60	40
35	40	60
36	90	10

5.2 계산

5.2.1 이소플라본 함량(mg/g)= A×(B/S)×P×(1/1,000)

A  : 시료의 농도(μg/mL)

B  : 시험용액의 전량(mL)

S  : 시료채취량(g)

P  : 표준품의 순도

※ 이소플라본 배당체일 경우 1/1.6(0.625) 전환계수 적용함

Ⅲ.3.6.8.2 대두이소플라본(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 메탄올을 이용하여 시료 중 이소플라본을 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 260 nm에서 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 삼각플라스크(250 mL)

2.1.2 항온수조

2.1.3 원심분리기

2.1.4 용매용 일회용 실린지

2.1.5 여과용 멤브레인 필터

2.1.6 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.7 부피플라스크(50 mL)

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 자외부흡광광도검출기

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm, 충진재 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상을 이용하여 용매를 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 이소플라본류

3.1.1.1. 다이드제인(Daidzein)

분자식 : C15H10O4, 분자량 : 254.23, CAS No. : 486-66-8

3.1.1.2. 제니스테인(Genistein)

분자식 : C15H10O5, 분자량 : 270.24, CAS No. : 446-72-0

3.1.1.3. 글리시테인(Glycitein)

분자식 : C16H12O5, 분자량 : 284.26, CAS No. : 40957-83-3

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol)

3.2.2 초산(Acetic acid)

3.2.3 증류수(Distilled water)

3.2.4 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

3.2.5 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 표준물질 각 20 mg을 정밀하게 취한다.

4.1.2 위의 표준물질을 50 mL 부피플라스크에 넣고 Dimethylsulfoxide를 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.3 위 용액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 시료 10 g을 정밀히 취한다.

4.2.2 위의 시료를 250 mL 삼각플라스크에 넣는다.

4.2.3 여기에 80% 메탄올 40 mL를 넣은 후 호일을 씌운다.

4.2.4 65℃ 항온수조에서 2시간 추출한다.

4.2.5 냉각시킨 후 2 M 수산화나트륨용액 3 mL를 넣는다.

4.2.6 이를 상온에서 10분간 회전 교반한 후 빙초산 1 mL를 넣는다.

4.2.7 80% 메탄올을 사용하여 50 mL로 하여 혼합한다.

4.2.8 여액 5 mL에 증류수 4 mL를 넣고 메탄올을 사용하여 10mL로 한다.

4.2.9 5,000 G로 5분간 원심분리한 상등액을 0.45 um 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10μL
칼럼온도	40℃
이동상	A : 물:메탄올:초산(88:10:2) B: 메탄올:초산(98:2)
검출기 파장	260nm
유량	1.0ml/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간	A용액(%)	B용액(%)
0	90	10
21	60	40
32	60	40
35	40	60
36	90	10

5.2 계산

각 이소플라본(비배당체) 함량(mg/g)=A×(B/S)×P×(1/1,000)

A : 시료의 농도(μg/mL)

B : 시험용액의 전량(mL)

S : 시료채취량(g)

P : 표준품의 순도