의약품등의 독성시험기준

국립보건안전연구원 고시 제  94-  3호(1994. 4.14, 제정)

식품의약품안전본부 고시 제1996-  8호(1996. 4.16, 개정)

식품의약품안전청 고시 제1998- 56호(1998. 4.29, 개정)

식품의약품안전청 고시 제1998-116호(1998.12. 8, 개정)

식품의약품안전청 고시 제1999- 61호(1999.12.22, 개정)

식품의약품안전청 고시 제2005- 60호(2005.10.21, 개정)

식품의약품안전청 고시 제2009-116호(2009. 8.24, 개정)

식품의약품안전청 고시 제2009-116호(2009. 8.24, 개정)

식품의약품안전청 고시 제2012- 86호(2012. 8.24, 개정)

식품의약품안전처 고시 제2013-121호(2013. 4. 5, 개정)

식품의약품안전처 고시 제2014-  6호(2014. 1.29, 개정)

제1조(목적) 이 고시는 약사법 제31조, 제42조 및 「의약품 등의 안전에 관한 규칙」 제9조제4호의 규정에 따라 제출되는 의약품등 화학물질의 독성시험에 관한 표준적인 시험방법을 정함을 목적으로 한다.

제2조(정의) 이 고시에서 사용되는 용어의 정의는 다음과 같다.

1. "시험동물"이라 함은 건강동물로서 시험목적으로 사용되는 품종이 확실한 동물을 말하며, 설치류는 특정병원체부재(SPF)동물을 사용함을 원칙으로 한다.

2. "단회투여독성시험"이라 함은 시험물질을 시험동물에 단회투여(24시간이내의 분할 투여하는 경우도 포함)하였을 때 단기간 내에 나타나는 독성을 질적․양적으로 검사하는 시험을 말한다.

3. "반복투여독성시험"이라 함은 시험물질을 시험동물에 반복투여하여 중․장기간 내에 나타나는 독성을 질적, 양적으로 검사하는 시험을 말한다.

4. "생식․발생독성시험"이라 함은 시험물질이 포유류의 생식․발생에 미치는 영향을 규명하는 시험을 말하며 수태능 및 초기배 발생시험, 출생 전․후 발생 및 모체기능시험, 배․태자 발생시험 등이 있다.

5. "유전독성시험"이라 함은 시험물질이 유전자 또는 유전자의 담체인 염색체에 미치는 상해작용을 검사하는 시험을 말한다.

6. “항원성시험”이라 함은 시험물질이 생체의 항원으로 작용하여 나타나는 면역원성 유발여부를 검사하는 시험을 말한다.

7. "면역독성시험"이라 함은 반복투여독성시험의 결과, 면역계에 이상이 있는 경우 시험물질의 이상면역반응을 검사하는 시험을 말한다.

8. "발암성시험"이라 함은 시험물질을 시험동물에 장기간 투여하여 암(종양)의 유발여부를 질적, 양적으로 검사하는 시험을 말한다.

9. "국소독성시험"이라 함은 시험물질이 피부 또는 점막에 국소적으로 나타내는 자극을 검사하는 시험으로서 피부자극시험 및 안점막자극시험으로 구분한다.

10. "국소내성시험"이라 함은 시험물질이 시험동물의 주사부위에서 나타내는 임상․병리학적 반응을 검사하는 시험을 말한다.

11. "흡입독성시험"이라 함은 기체, 휘발성 물질, 증기 및 에어로솔 물질을 함유하고 있는 공기를 시험동물에 흡입 투여하여 나타나는 독성을 검사하는 시험을 말한다.

12. "개략의 치사량"이라 함은 서로 다른 용량에서 관찰된 동물의 생사 및 독성증상으로부터 판단되는 최소치사량을 의미한다.

13. "최대내성용량"이라 함은 시험물질을 시험동물에 투여하였을 때 대조군에 비하여 10% 이내의 체중증가 억제 또는 상승을 나타내면서 사망에 영향을 미치지 않는 독성증상이 나타날 것으로 기대되는 최소용량을 말한다.

14. "무해용량"이라 함은 시험물질을 시험동물에 투여하였을 때 시험동물에 어떠한 독성증상도 나타나지 않을 것으로 기대되는 최대용량을 말한다.

15. "확실중독량"이라 함은 시험물질을 시험동물에 투여하였을 때 독성이 명확하게 나타나는 최소용량을 말한다.

16. "무독성량"이라 함은 시험물질을 시험동물에 투여하였을 때 독성이 나타나지 않는 최대용량을 말한다.

17. "독성동태시험(Toxicokinetics)"이라 함은 독성시험 수행시 시험물질의 전신노출도를 평가하기 위하여 약물동태학적 자료[주1]를 산출하는 시험으로서, 시험물질의 노출도와 독성시험에서의 용량단계 및 시간경과와의 상관성을 연구하는 것을 목적[주2]으로 한다.

제3조(시험항목 및 시험방법) 독성시험에는 단회투여독성시험, 반복투여독성시험, 생식․발생독성시험, 유전독성시험, 항원성시험, 면역독성시험, 발암성시험, 국소독성시험, 국소내성시험, 단회투여흡입독성시험, 반복투여흡입독성시험 등이 있으며, 각 시험에 대한 시험방법은 [별표1-11]과 같다.

제4조(복합제에 대한 제제별 독성시험기준) 복합제 또는 그 복합제의 유효성분에 대하여 아래 각 호의 독성시험을 제제에 대하여 실시하여야 하며, 그 시험방법은 [별표 12]에 따른다. 다만, 시험조건과 시험방법이 객관적으로 동일하다고 인정되는 경우에는 문헌자료로 대체할 수 있다.

1. 경구투여제, 주사제 및 수액제의 경우, 단회투여독성시험, 1개월 반복투여독성시험, 3개월이상 반복투여독성시험 등을 실시하여야 한다.

2. 외용제의 경우, 단회투여독성시험, 1개월 반복투여독성시험, 국소독성시험 등을 실시하여야 한다.

3. 경구투여제, 주사제, 외용제 이외의 제제의 경우, 다음과 같다.

가. 트로키제는

경구투여제의 독성시험방법에 따르며, 점막자극시험을 실시하여야 한다.

나. 흡입제

주사제의 독성시험 항목에 준하여 흡입독성시험을 실시하여야 한다.

다. 전신흡수를 목적으로 하는 좌제

경구제의 독성시험방법에 따르며, 점막자극 시험도 실시하여야 한다.

라. 점안제

(1) 외용제의 독성시험방법에 따라, 단회투여독성시험, 점막자극시험을 실시하여야 한다.

(2) 점안제가 1회밖에 투여되지 않는 제제의 경우에는 점안제의 점막자극시험 의 투여기간은 1일 1회 1주간 투여로도 가능하다.

마. 트로키제, 흡입제, 전신흡수를 목적으로 하는 좌제 및 점안제의 독성시험 이외의 약제의 독성시험은 사람에게 적용하는 방법과 생체내 흡수가 가장 유사한 방법에 따라 실시해야 한다.

제5조(보칙) ① 의약품등의 안전성평가에 있어 시험물질의 독성에 따라 새로운 시험이 추가 또는 보조적으로 수행될 수 있으며, 수행된 독성시험의 결과가 인체적용을 위하여 적정한 안전성평가를 할 수 있는 경우에는 규정된 시험법을 적용하지 아니할 수 있다.

② 심사결과의 신뢰성 조사

식품의약품안전처장은 이 기준에 따라 실시된 독성시험 결과에 대한 신뢰성을 확인하기 위하여 필요한 경우 비임상시험관리기준에 따라 관계 공무원 및 식품의약품안전처장이 지정하는 전문가로 하여금 이 결과와 관련된 제반사항에 대한 실태조사를 할 수 있다.

제6조(재검토기한) 「훈령ㆍ예규 등의 발령 및 관리에 관한 규정」(대통령훈령 제248호)에 따라 이 고시 발령 후의 법령이나 현실여건의 변화 등을 검토하여 이 고시의 폐지, 개정 등의 조치를 하여야 하는 기한은 2015년 8월 24일까지로 한다.

부     칙

① (시행일) 이 기준은 고시한 날부터 시행한다.

② (경과조치) 이 규정시행 전에 착수 또는 완료된 독성시험은 종전의 규정을 준용할 수 있다.

부   칙<제2009-116호, 2009. 8.24>

이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

부   칙<제2012-86호, 2012. 8.24>

이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

부   칙<제2013-121호, 2013. 4. 5>

이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

부   칙<제2014-6호, 2014. 1. 29>

제1조(시행일) 이 고시는 고시 후 3개월이 경과한 날부터 시행한다.

제2조(적용례) 이 고시는 고시 시행 후 최초로 의약품등 제조(수입) 허가신청서, 임상시험 계획서를 접수한 경우부터 적용한다.

[별표1] 단회투여독성시험

① 시험동물

1. 2종 이상으로 하고 그 중 1종은 설치류, 1종은 토끼를 제외한 비설치류이어야 하며, 비설치류의 경우 반복투여독성시험의 적정용량 설정을 위하여 실시하는 예비시험을 단회투여독성시험으로 인정할 수 있다.

2. 최소한 1종에 대하여는 암․수 모두에서 조사하며, 군 당 동물 수는 시험결과를 해석할 수 있는 충분한 수로 한다.

② 시험방법

1. 투여경로는 적어도 2개의 투여경로로 시험한다(다만, 임상적용경로가 정맥인 경우에는 정맥투여로만 시험해도 무방하다.). 경구투여는 원칙적으로 강제투여로 하고, 통상 투여 전 일정시간 동물을 절식시킨다.

2. 용량단계는 설치류의 경우 개략의 치사량을 구하기에 적절한 단계를 설정하고, 비설치류의 경우는 독성증상을 명확히 관찰하기에 적절한 단계를 설정한다.

3. 관찰기간은 통상 2주간으로 하되, 명확한 증상이 지속되거나 사망이 지연될 경우, 그 이상으로 한다.

③ 단회투여독성시험의 시험결과에는 다음 각 호의 사항이 포함되어야 한다.

1. 개략의 치사량[주3]

2. 일반증상의 매일 관찰기록

3. 시험기간 중 3회 이상의 체중 측정기록

4. 관찰기간 종료 후 육안적 해부소견

5. 육안적 이상소견이 관찰된 장기․조직에 대하여 필요시 병리조직학적 검사

④ 독성동태시험

단회투여독성시험 중 독성동태시험은 다음 각호와 같이 적용할 수 있다

1. 단회투여독성시험은 대개 생체분석 방법이 개발되기 전인 개발 초기에 수행되므로, 단회투여독성시험에서 독성동태시험을 동시에 실시하는 것은 대체적으로 불가능하나, 필요한 경우 추후의 분석을 위해 혈장 시료를 채취하여 저장할 수도 있으며, 이 경우 채취된 생체시료에서의 분석물질에 대한 안정성 자료가 필요하다.

2. 독성시험결과에 대해 문제점이 제기될 경우 단회투여독성시험이 완료된 후에 추가적인 독성동태시험을 수행할 수도 있다.

3. 단회투여 독성동태시험결과는 제제의 선택 및 시험물질의 노출속도와 노출기간을 예측하고 다음 단계의 독성시험에서 적절한 용량 단계를 선택하는데 도움이 될 수 있다.

[별표2] 반복투여독성시험

① 시험동물은 2종 이상을 사용하여야 하며, 그 중 1종은 설치류로서 1군에 암․수 각각 10마리 이상으로, 하고 1종은 토끼를 제외한 비설치류로 하고 암․수 각각 3마리 이상으로 한다. 다만, 중간도살 및 회복성시험을 수행하는 경우 필요한 수를 추가한다.

② 시험방법

1. 투여경로는 원칙적으로 임상적용경로로 한다.

2. 투여기간은 임상시험기간 및 의약품으로서의 임상사용 예상기간에 따라 정하며, 시험물질투여는 1일 1회 주 7회 투여함을 원칙으로 한다. 3개월 이상의 반복투여독성시험을 수행하는 경우는 용량설정과 초기독성검사를 위하여 이에 앞서 보다 단기의 반복투여독성시험을 수행한다.

3. 용량단계는 적어도 3단계의 시험물질 투여군으로 하고, 최대내성용량 및 무해용량 등을 포함하여 용량반응관계가 나타날 수 있도록 설정한다. 대조군은 음성대조군과 필요에 따라 비투여대조군, 양성대조군을 둔다.

4. 독성변화의 회복성과 지연성 독성을 검토하기 위해 회복군을 두어 시험하는 것이 바람직하다.

③ 시험기간

1. 임상시험을 위한 반복투여독성시험의 최소 투여기간은 다음 표와 같다.

임상시험기간 중 약물투여기간	최소 투여기간
	설치류	비설치류
～2주	2주	2주
2주 ～ 6개월	임상시험 중 약물투여기간	임상시험 중 약물투여기간
> 6개월	6개월	만성[주5]

2. 허가신청을 위한 반복투여독성시험의 최소 투여기간은 다음 표와 같다.

약물투여기간	최소 투여 기간
	설치류	비설치류
～2주	1개월	1개월
～1개월	3개월	3개월
～3개월	6개월	6개월
> 3개월	6개월	만성[주5]
약물투여기간에 상관없이 특히 필요하다고 인정되는 경우[주6]	6개월	만성[주5]

④ 반복투여독성시험의 시험결과에는 다음 각 호의 사항이 포함되어야 한다.

1. 일반증상, 체중, 사료섭취량, 물섭취량

모든 시험동물에 대하여 일반증상을 매일 관찰하고, 정기적으로 체중 및 사료섭취량을 측정하며, 필요한 경우 물섭취량을 측정한다.

측정빈도는 다음 각목과 같이 정한다.

가. 체중은 투여 개시 전과 투여 개시 후 3개월까지는 적어도 매주 1회, 그  후에는 4주에 1회 이상 측정한다.

나. 사료섭취량은 투여 개시 전과 투여 개시 후 3개월까지는 적어도 매주 1  회, 그 후에는 4주에 1회 이상 측정한다. 다만, 시험물질을 사료에 혼합하여 투여할 경우 매주 1회 측정하며, 설치류의 경우 개별 또는 군별로 측정한다.

다. 물 섭취량은 필요에 따라 측정하며 측정시 횟수는 사료섭취량 측정방법  에 준한다.

2. 혈액검사

가. 설치류는 부검(중간도살군도 포함)시에 채혈한다. 비설치류는 투여 개시 전과 부검 시에, 1개월을 초과하는 시험에서는 투여기간 중에 적어도 1회 채혈하여 검사한다. 검사는 원칙적으로 모든 시험동물에 대하여 행할 수 있으나, 실시상의 이유로 각 군의 일부 동물에 한하여 행할 수도 있다.

나. 혈액검사는 혈액학적검사 및 혈액생화학적 검사 항목 중 가능한 한 많은 항목에 대하여 실시하고 그 검사항목은 다음과 같다.

다만, 검사항목은 시험물질의 특성에 따라 적절한 항목을 선정하되, 국제적으로  널리 사용되는 항목과 검사방법을 고려하여 선정한다.

⑴ 혈액학적 검사는 적혈구수, 백혈구수, 혈소판수, 혈색소량, 헤마토크리트치, 백혈구백분율, 혈액응고시간, 망상적혈구수 등

⑵ 혈액생화학적 검사는  혈청(혈장)단백, 알부민, A/G비, 혈당, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 빌리루빈, 요소질소, 크레아티닌, 트란스아미나제(AST, ALT), 알칼리포스파타제, 염소, 칼슘, 칼륨, 무기인 등

3. 뇨검사

가. 설치류는 각 군마다 일정수의 동물을 선정하여 투여기간 중 1회 이상, 비설치류는 각 군 전부에 대하여 투여 개시 전과 투여기간 중 1회 이상 뇨검사를 실시한다.

나. 뇨검사 항목은 다음과 같다.

뇨량, pH, 비중, 단백, 당, 케톤체, 빌리루빈, 잠혈, 침사 등

4. 안과학적 검사

가. 설치류에 경우 투여기간 중 적어도 1회, 각 군마다 일정수의 동물을 선정하여 안과학적 검사를 실시하며, 비설치류의 경우 투여 전 및 투여기간 중 적어도 1회 각 군 모두에 대하여 실시한다.

나. 검사는 육안 및 검안경으로 실시하고 전안부, 중간투광체 및 안저의 각각에 대하여 실시한다.

5. 기타 기능검사

필요에 따라 심전도, 시각, 청각, 신기능 등의 검사를 실시한다.

6. 병리조직학적 검사

가. 생존 및 사망한 모든 동물의 장기무게를 측정한다. 원칙적으로 무게를 측정하여야 할 장기는 심장, 간장, 폐, 비장, 신장, 부신, 전립샘(선), 고환, 난소, 뇌 및 뇌하수체이고, 폐, 침샘(타액선), 가슴샘(흉선), 갑상샘(선), 정낭, 자궁에 대하여도 측정할 수 있다.

나. 설치류는 고용량군 및 대조군에 대하여, 비설치류는 모든 시험동물군에 대하여 병리조직학적 검사를 실시한다. 다만, 설치류에서 육안소견 상 용량에 따른 변화가 인정되거나 고용량군에서 관찰소견 상 필요하다고 인정되는 경우 기타 용량군의 해당 장기․조직에 대하여 병리조직학적 검사를 실시하되, 육안소견 등의 판단에 의해 적절히 삭감 또는 추가할 수도 있다. 원칙적으로 병리조직학적 검사를 하여야 할 장기조직은 다음과 같다. 피부, 젖샘(유선), 림프절, 침샘(타액선), 골 및 골수(흉골, 대퇴골), 가슴샘(흉선), 기관, 폐 및 기관지, 심장, 갑상샘(선) 및 부갑상샘(선), 혀, 식도, 위, 소장, 대장, 간장 및 담낭, 췌장, 비장, 신장, 부신, 방광, 정낭, 전립샘(선), 고환, 부고환, 난소, 자궁, 질, 뇌, 뇌하수체, 척수, 안구 및 그 부속기, 기타 육안적 병변이 관찰된 장기․조직 등.

7. 확실중독량 및 무독성량

8. 투여기간 중 빈사동물이 발생할 경우, 더 많은 소견을 얻기 위하여 도살하도록 한다. 먼저 충분한 임상적 관찰을 수행한 후 가능하다면 혈액검사를 위한 채혈을 행하고 부검을 수행한다. 기관․조직의 육안적 관찰, 병리조직학적 검사를 실시하는 것 외에 필요에 따라서 장기무게를 측정하고 그 시점에서의 독성변화정도를 관찰한다.

9. 투여기간 중 사망 례가 발생할 경우 즉시 부검하는 것을 원칙으로 한다. 장기․조직의 육안적 관찰 외에 필요에 따라 장기무게의 측정, 병리조직학적 검사를 실시함으로써 사망원인과 그 시점에서의 독성변화정도를 관찰한다.

⑤ 독성동태시험

반복투여독성시험 중 독성동태시험은 다음 각호와 같이 적용할 수 있다

1. 반복투여독성시험에서 투여방법 및 동물종은 가능한 한 시험물질의 효능 및 약물동태학적 원리에 근거하여 선택되어야 하나, 동물 및 사람에서의 약물동태학 자료가 대체적으로 입수가능하지 않은 시점인 초기 연구에서는 어려움이 있을 수 있다.

2. 반복투여독성시험 계획에 적절히 독성동태시험이 포함되도록 한다. 즉, 적절한 용량군에서 투여와 투여사이의 기간 또는 보통 14일간 수행되는 첫 단계의 반복투여독성시험기간 중에 적당 횟수의 생체시료를 채취하여 최고혈장농도(Cmax), 최고혈장농도에 도달하는 시간(Tmax), 특정시간에서의 혈장농도(Ctime) 및 혈중농도-시간반응곡선하면적(AUC)등을 산출할 수 있다.

3. 다음 단계의 반복투여독성시험 계획은 첫 단계에서 실시한 반복투여독성시험결과 및 독성동태시험결과에 의해 제안된 투여계획에 따라 수정될 수 있다. 진행된 독성시험결과를 해석하는데 문제가 있을 경우에는 생체시료의 채취횟수를 적절히 변경할 수 있다.

[별표3] 생식․발생독성시험

① 시험방법

1. 이 시험기준의 목적은 의약품등의 시험에 현재 사용되고 있는 시험계획들을 기초로 하여 시험 실시 방법을 통합 정리하는 것으로 차세대의 발생에 관여하는 의약품등의 안전성을 충분히 평가할 수 있어야 한다.

2. 동물의 생식․발생의 특정 단계에 시험물질을 투여하는 시험법은 사람에 대한 노출을 잘 반영하고 생식․발생단계별 위험성을 명확하게 식별할 수 있어야 한다. 이러한 접근은 대부분의 의약품등에서 유용하나, 저용량으로 장기간 투여하는 의약품에 있어서는 한 세대 또는 두 세대 시험법이 더 유용한 경우도 있다.

3. 실제 시험계획의 결정에 고려하여야 할 요인은 다음과 같다.

가. 특히, 생식과 관련되어 사용이 예상되는 의약품

나. 사람에게 적용이 예상되는 경로와 제형

다. 기존의 독성 자료, 약물동력학적, 약물동태학적, 구조나 활성에 있어서 다른 물질과의 유사성

4. 어떠한 기준도 가능한 모든 경우를 포괄하는 충분한 정보를 제공하지 못하므로 적절한 시험을 실시하기 위해서는 유연성이 요구된다[주7].  최신의 기술수준에 맞추어 사람과 동물시험의 윤리적 차원에 따라 시험법을 개량하는데 적극적으로 토의하고 고려하여야 한다.

② 시험단계별 검토사항

1. 생식․발생독성시험은 시험실시 및 결과의 해석에 모든 약리, 독성 자료를 사람에 대한 생식․발생의 위험성과 연관시켜 비교 검토하여야 한다.

2. 시험을 선택 또는 조합하는 경우 성숙동물 및 수정에서부터 성적 성숙에 이르는 발생의 전 과정에 걸쳐 약물이 노출되어야 한다. 이 경우 노출에 의해 즉시 또는 나중에 나타나는 영향을 검출하기 위해서는 하나의 완전한 생명주기 동안 즉, 한 세대의 수정에서부터 다음 세대의 수정까지 지속적으로 관찰하여야 한다. 시험실시의 편의상  연속적인 생식․발생과정을 다음과 같이 세분할 수 있다. 다만, 각 단계의 시기에 대하여는 “시기에 관한 결정”[주8]를 참고한다.

가. 교배전에서 수정까지 (성숙한 암․수동물의 생식능, 배우자의 발생 및 성숙, 교미행동, 수정)

나. 수정에서 착상까지 (성숙한 암컷동물의 생식기능, 착상전 발생, 착상)

다. 착상에서 경구개가 닫히는 시기까지 (성숙한 암컷동물의 생식기능, 배자 발생, 주요기관의 형성)

라. 경구개가 닫히는 시기에서 임신종료까지 (성숙한 암컷동물의 생식기능, 태자의 발생과 성장, 기관 발생과 발달)

마. 출생에서 이유까지 (성숙한 암컷동물의 생식기능, 출생자의 출생 후 생활에 대한 적응, 이유전 발달과 성장)

바. 이유에서 성적 성숙까지 (이유후 발달과 성장, 독자적인 생활적응, 완전한 성기능의 확립)

3. 생식․발생독성시험의 선택을 위해서 이 기준은 생식․발생에 대한 영향을 검사하기 위한 시험계획에 나타난 영향의 성격을 규명하기 위한 추가시험을 계획하여야 한다[주9].

4. 선택된 시험의 조합에 있어서는 논리적 근거를 제시하고 투여용량 설정사유도 설명하여야 한다. 최신의 기술수준에 맞추어 시험을 계획하고 화학구조 또는 약효가 유사한 물질의 생식․발생에 미치는 영향에 관한 정보를 고려하여야 한다.

5. 시험동물의 고통을 줄이고, 시험목적을 이루기 위하여 필요한 최소한의 동물을 사용하여야 한다.

6. 예비시험을 한 경우에 전반적인 시험평가에서 그 결과를 고려하고 고찰하여야 한다[주10].

③ 사용동물의 선택기준

1. 사용동물은 건강상태, 수태능, 생식능, 이상의 빈도, 배․태자 사망에 대하여 잘 알려져 있고 각 시험간에 균질한 동물을 선택하여야 한다. 동일시험 및 시험상호간에 있어서 시험 시작시기의 연령, 체중, 출산력 등이 거의 같은 동물을 사용하여야 한다. 교배시점에 젊고 성숙한 동물을 사용하고 암컷은 미교배 동물을 사용하도록 한다. 사용동물의 선택기준은 다음과 같다.

가. 동물 종의 선택과 동물수는 반드시 포유동물을 사용하여야 한다. 배․태자독성 시험에 한하여 두 종류의 포유동물 종이 사용되어져 왔는데 비설치류로서는 토끼를 많이 사용한다. 다만, 토끼가 부적절한 경우 다른 비설치류 또는 다른 설치류를 사용하여도 좋으나 상황에 따라 판단하여야 한다[주11].

나. 다른 시험계로는 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에서 분리된 포유류 또는 비포유류의 세포, 조직, 기관, 또는 개체의 배양계가 고려된다. 이들 시험계는 동물시험과 조합하여 화학구조 또는 약효가 유사한 물질 중에서 의약품으로서의 우선순위를 선택하기 위한 시험 또는 작용기전을 규명하기 위한 이차적인 시험으로서 생식․발생독성시험에서는 일반사항에서 언급한 목적을 달성하기 위하여 현재까지 사용되고 있는 전동물(whole animal)이외의 대체시험계는 없다[주12].

④ 투여용량 등

1. 투여에 대하여 일반적으로 고려해야 할 사항은 다음과 같다.

가. 투여용량

(1) 얻을 수 있는 모든 시험 자료(약리, 단회투여 및 반복투여 독성시험,   독성동태시험, [주13])를 참고하여 고용량을 설정해야 한다.

(2) 2 내지 4주간의 반복투여독성시험과 표준시험법의 생식․발생독성시험  의 투여기간은 매우 유사하다. 충분한 정보가 없을 때에는 예비시험을 하도록 한다[주10].

(3) 고용량이 결정되면, 단계적으로 저용량을 결정하여 용량 간격은 독성동  태시험과 그 외의 독성에 근거하여 설정한다. 무해용량을 설정하도록 하고 용량반응관계를 밝힐 수 있도록 충분히 좁은 용량간격을 설정하는 것이 우선이다[주14].

나. 투여경로 및 빈도

(1) 일반적으로 투여경로는 사람에서의 투여경로와 동일하여야 한다.

(2) 다른 투여경로에 있어서도 같은 독성동태양상을 나타내는 경우에는 단  일투여경로로 받아들여질 수 있다[주15].

(3) 보통 1일 1회 투여하지만 독성동태 변수를 고려하여 투여회수를 조     절하는 것이 고려된다[주16].

다. 동태시험

(1) 생식․발생독성시험을 시작하기 전에 동태시험 정보를 얻는 것이 바람직하다.

(2) 이 시점에서의 정보는 상세하거나 임신 또는 수유중인 동물을 사용한 것일 필요는 없다. 단, 시험을 평가하는 시점에 있어서는 얻어진 시험결과에 따라서 임신 또는 수유동물에서의 상세한 동태시험 정보가 필요하다[주16].

라. 대조군

(1) 대조군 동물은 시험물질 투여군 동물과 같은 방법으로 용매만을 투여하는 것이 권장된다.

(2) 용매에 의한 영향의 가능성이 있거나, 용매가 시험물질의 작용에 영향을 미칠 가능성이 있는 경우 비투여대조군의 설정을 고려하여야 한다.

⑤ 시험계획 및 방법

1. 시험계획을 수립(시험의 조합)할 때는 시험물질과 화학구조 또는 약효가 유사한 물질에 대해 얻은 약리, 독성동태, 독성 자료를 고려하여 가장 적절한 시험계획 및 실시방법을 결정하여야 한다. 우선 의약품에 관한 기존의 기준과 크게 다르지 않은 계획(표준시험법)의 고려가 예상된다. 대부분의 의약품에 대해서는 보통 표준시험법이 적절하다.

2. 그 외의 시험계획, 시험의 조합 및 시험방법도 상황에 따라서는 “표준시험법”과 동등이상으로 유용할 수 있다. 중요한 점은 전체적으로 생식․발생과정의 모든 단계에 걸쳐 직접 또는 간접적인 평가가 이루어져야 한다[주17]. 이 경우 선택한 시험방법의 타당성에 대하여 기술하여야 한다.

가. 표준시험법(The most probable option) 수태능 및 초기배 발생, 출생 전․후 발생 및 모체기능, 배․태자 발생에 미치는 영향에 관한 시험의 조합을 고려할 수 있다.

(1) 수태능 및 초기배 발생시험

1) 암․수 동물에 대하여 교배전부터 교미, 착상까지 시험물질을 투여하여 나타나는 독성 및 장애를 검사한다. 이 시험은 생식․발생과정 단계 [별표3] 제2항 제1호 및 제2호 가목 및 나목의 평가를 포함한다. 암컷에서는 성주기, 수정, 난관내 수송, 착상 및 착상전 단계의 배자발생에 미치는 영향을 검사한다. 수컷에서는 생식기관에 대한 병리조직검사에서 검출되지 않는 기능적인 영향(예: 성적 충동, 부고환내 정자성숙)을 검사한다[주18].

2) 평가항목

(가) 생식세포의 성숙

(나) 교미행동

(다) 수정

(라) 배자의 착상전 단계

(마) 착상

3) 동물

최소한 1종 이상이며, 통상 랫드가 권장된다.

4) 사용 동물수

군당 암․수 동물수는 의미있는 자료의 해석이 가능한 충분한 수로 한        다[주19].

5) 투여기간

(가) 특히 정자형성에 미치는 영향에 관한 시험에서는 독성시험에서 얻은 자료(병리조직소견, 생식기관의 무게, 어떤 경우에는 호르몬 측정 자료 및 유전독성 자료)가 유효하게 이용될 수 있다. 적어도 4주간 이상의 반복투여독성시험에서 영향이 없으면 교배전 투여기간을 암컷 2주, 수컷 4주로 설정할 수 있다[주18].

(나) 교배전 투여기간을 설정할 때는 그 이유를 명기하고 타당성을 기  재하여야 한다. 투여기간은 교배기간을 포함하여 수컷은 시험종료까지, 암컷은 적어도 착상까지는 계속 투여하여야 한다.

(다) 다른 시험 자료에서 암․수 동물의 생식기관의 무게 또는 조직소  견에 영향이 인정되는 경우 시험의 정밀도에 의문이 있거나 다른 시험자료가 없는 경우 보다 광범위한 시험 실시의 필요성에 대하여 검토하여야 한다[주18].

6) 교배

암․수 교배비는 1:1이 권장되며 차세대의 모체 및 부체를 식별할 수 있어야 한다[주20].

7) 최종부검

암컷동물은 임신중반 이후 적당한 시기에 부검한다. 수컷은 교미 후 적당한 시기에 부검할 수 있으나 임신성립을 확인한 후에 부검하는 것이 좋다[주21].

8) 관찰

(가) 시험중(모체동물)

1) 일반증상 및 사망여부 : 최소한 1일 1회

2) 체중 및 체중 변화량 : 최소한 주 2회[주22]

3) 사료섭취량 : 최소한 주 1회(교배기간은 제외)

4) 교미 혹은 교미성립전 기간에 미치는 영향 유무를 검사하기 위하여 최소한 교배기간 중에는 매일 질점막상피의 상태를 검사 기록한다.

5) 다른 독성 시험에서 관찰 의의가 인정된 항목

(나) 최종검사시

1) 모든 성숙동물의 부검(육안적 관찰)

2) 육안적 변화가 인정된 조직・기관을 보존하고 필요시 병리조직검사를 한다. 비교검토를 위해 대조군의 동일 조직・기관을 충분하게 보존한다.

3) 상황에 따라 조직검사 및 평가를 위하여 모든 동물의 고환, 부고환, 난소, 자궁을 보존하고 병리조직검사와 평가를 한다.

4) 황체수, 착상수[주22]

5) 생존배(태)자수, 사망배(태)자수

정자검사는 관찰된 영향을 확인하기 위하여 또는 그 영향을 보다 상세하게 특징짓기 위하여 이용 가능한 검사이다[주18].

(2) 출생 전․후 발생 및 모체기능시험

1) 암컷에 착상부터 이유까지 시험물질을 노출시켜 임신/수유기의 암컷, 수태산물 및 출생자의 발생에 미치는 독성을 검사한다. 이 시험기간 동안에 유발된 영향은 뒤늦게 발현할 수 있기 때문에 출생자의 성적 성숙기까지 관찰이 계속되어야 한다([별표3] 제2항 제1호 및 제2호 다목 내지 바목을 평가 : [주23, 24]).

2) 평가되어야 할 부작용

(가) 비임신 암컷동물과 비교할 때 독성의 증가

(나) 출생 전 및 출생 후의 배자․태자․출생자의 사망

(다) 성장 및 발달의 변화

(라) 행동, 성숙(성적 성숙) 및 생식기능(차세대)을 포함한 출생자의 기능장애

3) 동물

최소한 1종 이상이며, 통상 랫드가 권장된다.

4) 동물수

군당 암․수 동물수는 의미있는 자료의 해석이 가능한 충분한 수로     한다[주19].

5) 투여기간

착상부터 이유기까지로 한다.

6) 시험방법

암컷을 모두 분만시켜 차세대를 포육하도록 한다. 이유시에 한배당 암․수 각 1마리씩을 선택하여(선택법을 기재할 것) 성적 성숙기까지 기른 후, 생식능을 평가하기 위해 교배시킨다[주25].

7) 관찰

(가) 시험중(모체동물)

1) 일반증상 및 사망여부 : 최소한 1일 1회

2) 체중 및 체중 변화량 : 최소한 주 2회[주22]

3) 사료섭취량 : 분만할 때까지 최소한 주 1회

4) 다른 독성시험 결과에서 관찰 의의가 인정되는 항목

5) 임신기간

6) 분만

(나) 최종검사시

1) 모든 성숙동물의 부검(육안관찰)

2) 육안적 변화가 인정되는 조직․기관은 보존하고 필요에 따라 병리조직검사를 한다. 비교검토를 위하여 충분한 수의 대조군의 동일 장기 혹은 기관은 보존한다.

3) 착상[주22]

4) 형태이상

5) 출산자

6) 사산자

7) 출생시 체중

8) 이유전, 이유후의 생존율, 성장/체중[주26], 성숙 및 수태능

9) 신체적 발달[주27]

10) 감각기능 및 반사[주27]

11) 행동[주27]

(3) 배․태자 발생시험

1) 착상부터 경구개가 폐쇄되는 시기까지 임신중의 암컷에 시험물질을 투여하여 모체와 배・태자의 발생에 미치는 영향을 검사한다([별표3] 제2항 제1호 및 제2호 다목 및 라목을 평가).

2) 평가되어야 할 부작용

(가) 비임신 암컷과 비교시 독성의 증가

(나) 배․태자의 사망

(다) 성장의 변화

(라) 형태학적인 변화

3) 동물

보통 2종을 사용한다. 1종은 설치류로 랫드가 바람직하다. 다른 1종은   비설치류로 토끼가 바람직하다[주11]. 1종만 사용할 경우에는 그에    대한 타당성을 설명하여야 한다.

4) 동물수

군당 암․수 동물수는 의미있는 자료의 해석이 가능한 충분한 수로 한다[주19].

5) 투여기간

착상부터 경구개의 폐쇄까지 투여한다.

6) 시험방법

(가) 분만 하루전에 암컷을 모두 부검한다. 모든 태자의 생사와 이상 유  무를 검사한다. 다른 관찰 결과와의 관련성을 평가하기 위하여, 태자는 개체식별이 되어야 한다[주28].

(나) 내장 및 골격검사를 위하여 별도로 태자를 분류하는 경우 한배새  끼의 약 50% 태자를 골격염색에 사용한다. 내장이상에 있어서는 검사방법에 상관없이 최소한 50%의 태자를 검사한다. 내장검사를 위해서 미세절개방법(신선한 표본의 현미해부법)을 사용하는 경우에는 모든 태자에 대하여 내장과 골격의 이상을 검사하여야 한다.

7) 관찰

(가) 시험중 (모체동물)

1) 일반증상 및 사망여부 : 최소한 1일 1회

2) 체중 및 체중 변화량 : 최소한 주 2회[주22]

3) 사료섭취량 : 최소한 주 1회

4) 다른 독성시험 결과에서 관찰 의의가 인정되는 항목

(나) 최종검사시

1) 모든 성숙동물의 부검(육안적 관찰)

2) 육안적 변화가 인정되는 조직․기관은 보존하고 필요에 따라 병리조직검사를 한다. 비교검토를 위하여 충분한 수의 대조군의 동일 장기 혹은 기관은 보존한다.

3) 황체수, 생존 태자수 및 사망배・태자수[주22]

4) 태자의 개체 체중

5) 태자의 이상[주28]

6) 태반의 육안적 관찰

나. 단일시험법(Single study design) :

(1) 설치류에서 수태능 및 초기배 발생시험과 출생 전․후 발생 및 모체기  능시험의 투여기간을 하나로 통합하면 생식․발생과정의 단계 제2호 가목에서 바목까지의 평가를 포함하게 된다([별표3] 제2항 제1호 및 제2호를 참조).

(2) 이 시험에서 태자검사를 실시하고 충분히 높은 용량에서도 명백히 음성  이 나타나는 경우에 한하여 더 이상의 생식․발생독성시험은 요구되지 않는다.

(3) 태자의 형태이상검사로서 배․태자 발생시험을 추가할 수 있으며 이 경  우에는 조합시험법이 된다.

(4) 제 2종 동물의 배․태자 발생시험은 필요하다([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (3) 참조).

다. 조합시험법(Two study design)

(1) 설치류에서 가장 단순한 조합시험법은 수태능 및 초기배 발생시험과 태  자검사를 포함한 출생 전․후 발생 및 모체기능시험으로 구성된다. 그러나 태자검사를 포함한 출생 전․후 발생 및 모체기능시험에 있어서 사람의 노출량을 초과한 고용량에 있어서도 출생전의 영향이 없는 경우에는 추가로 배․태자 발생시험([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (3) 참조)을 시행하여도 사람에 대한 위해성을 평가하는데 큰 차이를 나타내지 않는다.

(2) 다른 시험법으로 수태능 및 초기배 발생시험([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (1) 참조)에서 암컷동물에 대한 투여를 경구개의 폐쇄까지 계속하고, 배․태자 발생시험방법([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (3) 참조)에 따라 태자를 검사하여 출생 전․후 발생 및 모체기능시험([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (2) 참조)을 조합하면, 이것은 표준시험법에서 요구되는 모든 검사가 실시되어 사용동물수는 상당히 줄어들게 된다[주9, 17].

(3) 제 2종 동물의 배․태자 발생시험은 필요하다([별표3] 제5항 제1호 및 제2호 가목 (3) 참조).

⑥ 통계분석

통계분석은 시험성적을 해석하는 수단으로 기술통계 및 추측통계를 이용한다 [주 29].

⑦ 보고서 작성시 고려사항

보고서를 작성할 때 포함되어야 할 항목은 다음 각호와 같다[주 29-1].

⑧ 생식․발생독성 용어

생식․발생독성에 사용되는 용어는 [주 29-2]와 같다.

⑨ 독성동태시험

생식․발생독성시험 중 독성동태시험은 다음 각 호와 같이 적용할 수 있다.

1.  독성동태시험자료는 동물 종의 선택, 시험계획 및 투여방법을 조정할 필  요성을 제시할 수 있으므로, 생식․발생독성시험의 시작 전에 약물동태정  보를 입수하는 것이 바람직하다. 이때의 약물동태정보는 복잡하거나 또는  임신․수유동물에서 얻은 것일 필요는 없으나 시험결과에 따라서는 시험의 평가시점에 임신 또는 수유동물에서의 약물동태정보가 필요할 수도 있다.

2. 보통 생식․발생독성시험에서 노출의 한계는 모체독성에 따라 결정된다. 따라서 일부 생식․발생독성시험에서, 특히 저독성 화합물의 경우, 독성동태 모니터링의 가치가 있으나 모든 화합물에 대하여 일반적으로 필요한 것은 아니다.

3. 약리반응 또는 독성이 나타나지 않아, 전신적 노출이 충분히 이루어졌는가  의문이 생길 경우에 독성동태자료는 생식과정의 여러 단계에서 투여에 의  한 노출의 평가에 유효하게 응용할 수 있다.

4. 독성동태자료를 얻기 위하여 암컷동물의 여유동물군[주30]을 사용하는 것이 좋다.

5. 수태능시험 : 반복투여독성시험법의 일반적 원칙을 적용한다. 수태능시험을 모니터할 필요성은 사용되는 투여법 및 선택된 동물 종을 이용하여 실시한 그 이전의 시험에서 얻어진 정보에 의해 결정된다.

6. 임신․수유동물에서의 시험은 노출기간 동안의 투여계획은 독성관찰 결과  와 독성동태시험 원칙에 따라 결정되어야 한다. 임신동물과 비임신동물간  에 약물동태가 다를 가능성을 고려할 수 있다. 모체, 배자, 태자 또는 신생  자의 특정 일령에서의 노출평가를 독성동태시험에 포함하는 수도 있다[주31]. 신생자의 노출에 대한 역할을 명확하게 하기 위하여 유즙으로의 분  비를 측정할 수 있다. 어떤 경우에는 배․태자 이행 및 유즙으로의 분비를  조사하기 위하여 추가시험이 필요하거나 적절한 경우도 있다. 시험물질의  태반이행을 증명할 수 없는 동물 종에 대하여는 생식․발생독성시험의 해  석에 주의하여야 한다.

[별표4] 유전독성시험

① 시험종류

1. 원칙적으로 모든 시험물질에 대하여 최소한 아래 각호의 유전독성시험을   실시하여야 한다. 상기 규정에도 불구하고 시험물질의 특성 및 시험의 실시목적 등을 고려하여 필요하다고 인정되는 경우에는 OECD 유전독성시험기준에서 정한 그 밖의 유전독성시험으로 대체하거나 추가적으로 실시할 수 있다. 이 경우 본 기준에 언급되지 아니한 시험에 대하여는 OECD 유전독성시험 기준에 준한다[주32].

가. 박테리아를 이용한 복귀돌연변이 시험

나. 포유류 배양세포를 이용한 체외 염색체이상 시험 또는 마우스 림포마 tk 시험

다. 설치류 조혈세포를 이용한 체내 소핵시험

② 복귀돌연변이시험

1. 박테리아를 이용한 복귀돌연변이 시험은 다음과 같이 한다.

가. 최소한 아래 5개의 균주

(1) Salmonella typhimurium TA98

(2) Salmonella typhimurium TA100

(3) Salmonella typhimurium TA1535

(4) Salmonella typhimurium TA1537 또는 TA97 또는 TA97a

(5) Salmonella typhimurium TA102 또는 E. Coli WP2 uvrA 또는 E. Coli WP2 uvrA(pKM101)를 사용한다

나. 시험방법

(1) 용량단계는 5단계 이상을 설정하며 최고용량은 시험물질의 특성에 따라  선정한다[주33].

매 용량마다 3매 이상의 플레이트를 사용한다.

(2) S9 mix를 첨가한 대사활성화법을 병행하여 수행한다[주34].

(3) 대조군은 대사활성계의 유, 무에 관계없이 동시에 실시한 균주-특이적 양성 및 음성 (용매 또는 담체) 대조물질을 포함한다[주35].

다. 결과의 판정

대사활성계 존재 유, 무에 관계없이 최소 1개 균주에서 평판 당 복귀된 집  락수에 있어서 1개 이상의 농도에서 재현성 있는 증가를 나타낼 때 양성으  로 판정한다. 또한, 음성 결과에 대해서는 필요에 따라 재현성을 확인한다.

③ 체외염색체이상시험

1. 포유류 배양세포를 이용한 체외 염색체이상 시험은 다음과 같이 한다.

가. 세포주

사람 또는 포유동물의 초대 또는 계대배양세포를 사용한다.

나. 시험방법

(1) 시험물질의 최고용량은 시험물질의 특성에 따라 선정한다[주36]. 용량     단계는 3단계 이상을 설정한다.

(2) S9mix등 적절한 대사활성화법을 병행한다.

(3) 염색체 표본은 시험물질 처리 후 적절한 시기에 제작한다[주37].

(4) 염색체이상의 검색은 농도당 200개의 분열중기상에 대하여 염색체의 구조이상 및 숫적이상을 가진 세포의 출현빈도를 구한다[주38].

(5) 대조군은 대사활성계의 유, 무에 관계없이 적합한 양성과 음성 (용매 또  는 담체) 대조군들을 포함한다. 양성대조군은 알려진 염색체이상 유발   물질을 사용해야 한다.

다. 결과의 판정

염색체이상을 가진 분열중기상의 수가 통계학적으로 유의성있게 용량의존   적으로 증가하거나, 하나 이상의 용량단계에서 재현성있게 양성반응을 나   타낼 경우를 양성으로 한다.

④ 체외 마우스 림포마 TK 시험

1. 포유류의 배양세포를 이용한 체외 마우스 림포마 TK 시험은 다음과 같이 한다.

가. 세포주

마우스 림포마 L5178Y 세포를 이용한다.

나. 시험방법

(1) 적절한 대사활성화법을 병행하여 행한다.

(2) 4단계 이상의 용량단계를 설정하며 시험물질의 최고용량은 시험물질의  특성에 따라 선정한다[주39].

(3) 대조군은 대사활성계의 유, 무에 관계없이 적합한 양성과 음성(용매 또  는 담체) 대조군들을 포함한다. 양성대조군은 알려진 염색체 및 유전자  손상 유발 물질을 사용한다.

(4) 시험물질의 처리는 3～4시간으로 하며 24시간까지 연장할 수 있다.

(5) 유발변이의 표현형발현을 위하여 최적에 가까운 발현기간을 부여한다.

다. 결과의 판정

돌연변이 발생빈도가 통계학적으로 유의성 있게 용량의존적으로 증가하거나, 적어도 하나 이상의 용량단계에서 재현성 있게 양성반응을 나타내는 경우를 양성으로 한다.

⑤ 체내 소핵시험

1. 설치류 조혈세포를 이용한 체내 소핵 시험은 다음과 같이 한다.

가. 시험동물

(1) 마우스나 그 밖의 설치류를 사용한다.

(2) 수컷과 암컷 사이에 독성 및 대사에 차이가 없다면 1군당 성숙한 수컷  5마리를 사용한다. 성 특이 시험물질의 경우는 그에 적합한 성의 동   물을 이용한다.

나. 시험방법

(1) 용량단계는 3단계 이상으로 하며 시험물질의 최고용량은 시험물질의 특  성에 따라 선정한다[주40].

(2) 투여경로는 원칙적으로 복강투여 또는 임상적용경로로 한다[주41].

투여회수는 1회 투여를 원칙으로 하며 필요에 따라 24시간 간격으로 2          회 이상 연속 투여한다.

(3) 대조군은 병행실시한 양성과 음성(용매/담체) 대조군을 포함한다[주42].

(4) 시험물질 투여 후 적절한 시기에 도살하여 골수도말표본을 만든다[주43]. 원칙적으로 개체 당 2,000개의 다염성적혈구에 대해서 소핵의 유무를 검색한다. 동시에 전적혈구에 대한 다염성적혈구의 출현빈도를 구한다.

다. 결과의 판정

소핵을 가진 다염성적혈구의 수가 통계학적으로 유의성있게 용량의존적으로 증가하거나, 하나 이상의 용량단계에서 재현성있게 양성반응을 나타낼 경우를 양성으로 한다.

⑥ 독성동태시험

유전독성시험 중 독성동태시험은 다음과 같이 적용할 수 있다.

생체내(in vivo) 유전독성시험에서 음성의 결과가 나온 경우, 사용된 시험종에서의 전신적 노출을 증명하거나 지표 조직에서의 노출의 특성을 확인하는 것이 바람직하다.

[별표5] 항원성시험

① 시험종류

1. 항원성시험으로 아나필락시스 쇼크 반응시험 및 수동 피부 아나필락시스   반응시험 등을 실시한다. 단, 피부외용제의 경우는 피부감작성시험을 실시한다[주44].

② 아나필락시스 쇼크 반응시험[주45]

1. 시험동물

시험동물은 기니픽을 사용한다.

2. 시험방법

가. 용량은 추정되는 임상용량으로부터 선정한다[주46].

나. 투여경로는 피하, 또는 복강내로 하는 것이 일반적이나, 임상적용 경로로 투여하여도 무방하다.

다. 시험군은 원칙적으로 1군당 5마리 이상으로 하여 대조군, 양성대조군 및 시험물질 투여군을 두며, 시험물질 투여군은 저용량군과 고용량군의 2군 이상으로 하고 거대분자와의 결합 여부, 면역보조제와의 혼합투여 여부에 따라 필요한 군을 설정한다[주47].

라. 시험물질에 따라 거대분자와의 결합 여부를 결정하여[주48] 시험을 실시하며 용매는 0.9%(w/v) 생리식염수를 사용한다[주48]. 대조물질로는 시험물질에 따라 항원성이 알려진 저분자 물질, 또는 이종단백을 사용한다[주47].

마. 모든 용액은 시험 당일에 조제하며 감작과 야기시 원하는 농도로 준비한다.

바. 감작시 대조군에는 0.9%(w/v) 생리식염수를 투여하고, 양성대조군에  는 양성대조물질을 투여하여 감작한다. 면역보조제를 사용하지 않는 시험군에는 시험물질을 단독으로 피하, 복강내 또는 임상경로에 준하여 반복투여(주 2-3회, 2-4 주간)하여 감작한다. 면역보조제를 사용하는 시험군은 적당한 면역보조제와 혼합하여 피하, 복강내, 또는 피내에 적절한 간격(1-3주)으로 3회 이상 반복투여하여 감작한다[주47].

사. 최종 감작 1-3주 후에 시험물질(야기항원)을 정맥내 투여하여 아나필락시스 쇼크 증상의 발현 유무를 검색한다. 야기항원량은 원칙적으로 감작에 이용한 저용량의 수배로 한다.

3. 결과의 판정

시험결과는 아나필락시스 쇼크 반응시험 판정기준에 따라 판정한다[주49].

③ 수동 피부 아나필락시스 반응시험[주45]

１. 시험동물

이종 수동 피부 아나필락시스 반응시험의 경우 항혈청 제조에 C57BL/6계 마우스 또는 적당한 근교계 마우스를 사용하며, 반응 야기에는 랫드를 사용하고, 동종 수동 피부 아나필락시스 반응시험의 경우 항혈청제조 및 반응 야기에 기니픽을 사용한다.

2. 시험방법

가. 용량은 추정되는 임상용량으로부터 선정한다.[주46]

나. 투여경로는 피하, 또는 복강내로 하는 것이 일반적이나, 임상적용 경로로 투여하여도 무방하다.

다. 시험군은 원칙적으로 1군당 5마리 이상으로 하여 대조군, 양성대조군 및 시험물질 투여군을 두며, 시험물질 투여군은 저용량군과 고용량군의 2군 이상으로 하고 거대분자와의 결합 여부, 면역보조제와의 혼합투여 여부에 따라 필요한 군을 설정한다[주47].

라. 시험물질에 따라 거대분자와의 결합 여부를 결정하여[주47] 시험을 실시하며 용매는 0.9%(w/v) 생리식염수를 사용한다[주48].  대조물질로는 시험물질에 따라 항원성이 알려진 저분자 물질, 또는 이종단백을 사용한다[주47].

마. 모든 용액은 시험 당일에 조제하며 감작과 야기시 원하는 농도로 준비한다.

바. 감작시 대조군에는 0.9%(w/v) 생리식염수를 투여하고, 양성대조군에는 양성대조 물질을 투여하여 감작한다. 면역보조제를 사용하지 않는 시험군에는 시험물질을 단독으로 피하, 복강내 또는 임상경로에 준하여 반복투여(주 2-3회, 2-4 주간)하여 감작한다. 면역보조제를 사용하는 시험군은 적당한 면역보조제와 혼합하여 피하, 복강내, 또는 피내에 적절한 간격(1-3주)으로 3회 이상 반복투여하여 감작한다[주47].

사. 최종 감작 1-3주 후에 채혈하여 항혈청을 개체별로 분리한다.

아. 반응 야기를 위하여 위에서 얻은 개체별 항혈청을 제모한 시험동물의 등부위에 피내주사한다. 항혈청은 적당한 배율까지 연속배수희석(4배, 8배, 16배,...)해서 약 0.05-0.1 ml정도 주사하며 이때 대조군 시험동물의 혈청도 동량 주사한다. 각 혈청당 2-3마리의 시험동물에 주사한다.  감작시킨 시험동물은 사육상자에 넣어 수용하며 24시간 후에 시험물질(야기항원)을 시험동물에 투여한다. 이때 투여할 시험물질 용액은 동량의 1-3%(w/v) Evans blue와 혼합하여 각 시험동물의 정맥내에 투여한다. 야기항원량은 원칙적으로 감작에 이용한 저용량의 수배로 한다.

자. 야기항원 주사 30분 후에 시험동물 각 개체를 경추탈골 또는 마취하에 치사시켜 등부위 피부를 절취해서 피부안쪽의 청색 반점을 관찰한다.

3. 결과의 판정

출현한 청색반의 장경과 단경의 평균치가 5 mm 이상이면 양성으로 하고, 양     성을 나타내는 가장 마지막 혈청희석액의 희석 배수(최대 희석 배수)를 그      혈청의 최종 역가(항체가)로 정한다.

④ 피부감작성시험[주50]

1.  시험동물

가. 원칙적으로 기니픽을 1주정도 순화하여 사용한다. 암컷을 사용하는 경우에는 임신하지 않은 것 또는 임신의 경험이 없는 것을 사용한다.

나. 시험군은 각 군당 5마리이상으로 하며 원칙적으로 시험물질군, 용매대조군 및 양성대조군을 설정한다.

2. 시험방법

가. 시험물질이 고형제일 경우 증류수 또는 적절한 용매에 습윤시켜 균일하게 적용하며 반고형제 및 액제의 경우 희석하지 않고 사용한다. 에어로졸제는 필요에 따라 희석하여 사용한다.

나. 1차 감작 : 제모한 시험동물의 등부위 피부(약 2×4cm)에 다음과 같은 3종의 시료를 좌우 대칭으로 피내주사한다[주51].

(1) 증류수(또는 생리식염수)와 Freund's Complete Adjuvant(FCA)의 유화물(1:1 혼합물)

(2) 시험물질

(3) 시험물질과 FCA의 유화물(1:1 혼합물)

다. 2차 감작 : 1차 감작 1주 후 시험물질을 피내주사했던 부위에 시험물질을  포함하는 패취(2×4cm)를 부착하여 48시간동안 폐색첩포한다[주52].

라. 야기 : 폐색첩포 2주 후 시험동물의 등부위 혹은 측복부(감작부위와는 다  른 부위여야함)를 제모하고 시험물질을 포함하는 패취(2×2cm)를 부착하여 24시간동안 폐색첩포하여 야기시킨다[주52].

3. 결과의 판정

패취제거 24시간 및 48시간 후의 피부반응을 평가[주53]하며 이에 기초하       여 시험물질의 피부감작성을 평가[주54]한다.

⑤ 독성동태시험

항원성시험 중 독성동태시험을 적용할 수 있다.

[별표6] 면역독성시험

① 시험종류

1. 면역독성시험은 반복투여독성시험 등의 결과 면역기능 및 면역장기의 이상이 의심될 경우[주55] 세포매개성 면역시험 및 체액성 면역시험에 대하여 각 1종 이상의 시험을 실시하며, 필요시 대식세포기능시험이나 자연살해세포 기능시험을 추가로 실시할 수 있다[주56].

가. 세포매개성 면역시험

(1) Concanavalin A, phytohemagglutinin 및 특이항원에 대한 세포 유약화 시험

(2) 혼합 백혈구 배양시험

(3) 난백알부민, tuberculin, Listeria 등 T 림프구 의존 항원에 의한 지연   형 과민반응시험

나. 체액성 면역시험

(1) 비장세포의 플라그 형성시험

(2) T 림프구 의존성 항원에 대한 항체의 혈중농도 시험

(3) T 림프구 비의존성 항원인 lipopolysaccharide에 대한 항체의 혈중농도 시험

(4) Lipopolysaccharide에 대한 세포 유약화 반응시험

다. 대식세포 기능시험

(1) Listeria monocytogenes에 대한 탐식 작용시험

(2) YAC-1 세포에 대한 세포독성시험(마우스의 경우이며 사람의 경우는 K562 세포를 사용함)

(3) Carbon clearance시험

라. 자연살해세포 기능시험

YAC-1 세포에 대한 세포독성시험(마우스의 경우이며 사람의 경우는 K562 세포를 사용함)

[별표7] 발암성시험

① 시험동물

1. 시험동물은 6주령까지의 동일 주령의 동물을 사용하며 이유 후 가능한 한  빠른 시기에 투여를 시작하는 것이 바람직하다.

2. 시험동물의 종 및 계통을 선택할 때 감염성질환에 대한 저항성, 수명, 자연  발생종양의 발생빈도, 이미 알려진 발암물질에 대한 감수성 등을 고려한다.

3. 동일한 시험물질에 대하여 발암성 예비시험 및 본시험을 실시할 경우 동일  종 및 계통의 시험동물을 선택한다.

② 시험 종류

시험의 종류는 1종의 설치류에 대한 장기투여 발암성시험과 1종의 추가시험으로 한다. 1종의 설치류에 대한 장기투여 발암성시험에 사용되는 동물종은 확실한 근거가 없는 경우에는 랫드가 권장된다.

1. 추가시험은 다음 각호의 1을 말한다[주58].

가. 단기, 중기 설치류 시험계[주59]

종양발생을 지표로 한 생체내 시험.

(1) 설치류의 개시-촉진(Initiation promotion)모델

(2) 형질전환 설치류를 사용한 발암모델

(3) 신생아 설치류를 사용한 발암모델

나. 다른 1종의 장기발암성 시험

③ 예	비시험

발암성시험에서 이용할 투여량을 결정하기 위하여 발암성 예비시험을 실시할 수 있으며, 발암성 예비시험 기준은 다음 각호와 같다. 다만, 충분히 신뢰할만한 시험결과가 있는 경우 다음 시험의 전부 또는 일부를 생략할 수 있다

1. 단회투여 예비시험

반복투여 예비시험에 대한 최고용량을 결정하기 위하여 적절한 수의 동물을 이용하여 수행한다.

2 반복투여 예비시험

발암성시험에 대한 최고용량을 결정하기 위하여 수행한다.

가. 용량단계는 암․수 각각에 대하여 3단계 이상의 시험군을 설정하고 별도로 대조군을 둔다. 동물수는 각 군당 암․수 각 10마리 정도로 한다. 용량단계는 공비 2 또는 3으로 하는 것이 바람직하다. 최고용량은 독성변화가 나타나는 용량이어야 하나 기술적으로 투여 가능한 최대량에서도 아무런 독성변화가 나타나지 않는 경우에는 그 용량을 최고용량으로 한다.

나. 투여경로는 발암성시험과 동일한 투여경로로 한다. 경구투여의 경우에는 강제투여 또는 사료, 물 등에 혼합하여 자유롭게 섭취되도록 하며, 사료에 혼합하여 투여하는 경우 사료 중 시험물질의 농도는 최고 5%까지로 한다.

다. 투여기간은 90일로 하고 투여는 원칙적으로 주 7일로 한다. 그러나 지연성독성 또는 체내축적성이 있는 시험물질의 경우에는 장기간 투여가 요구될 수 있다.

라. 검사방법은 다음과 같다.

(1) 각 군의 모든 동물에 대하여 일반상태를 매일 관찰하고 체중을 주 1회 이상 측정한다.

(2) 투여기간 중 사망례가 발생할 경우는 즉시, 생존례에 대하여는 투여종료 시점에 부검하여 기관․조직의 육안적 관찰을 행한다. 또한 육안적으로 변화가 인정되는 기관․조직에 대하여 병리조직학적 검사를 행한다.

3. 발암성시험에서 사용할 최고용량은 발암성 반복투여 예비시험결과 대조군에 비해 10% 이내의 체중증가를 억제하거나 중독에 의한 사망이 없고, 일반상태 및 부검소견에서 현저한 독성변화가 나타나지 않는 양으로 하며, 시험동물의 종 및 성별 등에 따라 결정하는 것이 바람직하다.

④ 용량단계

암․수 각각에 대하여 3단계 이상의 시험군을 설정하고 별도로 대조군을 둔다. 동물수는 암․수 각각에 대하여 1군당 50마리 이상으로 하며, 발암성시험의 용량단계는 다음 각호와 같다[주57].

1. 시험군에 있어서 최고용량은 발암성 반복투여 예비시험의 결과에서 정한 양으로 하고, 최저용량은 원칙적으로 해당 사용 동물 종에서 약리효과가 발현되는 양 또는 추정 임상용량을 기준으로 하며, 중간용량은 최고용량과 최저용량과의 등비중항으로 한다.

2. 예외적으로 사람의 치료량에 비해 현저히 저독성인 경우에는 최고용량을 추정 임상용량의 약 100배로 설정할 수 있으며, 이 경우 해당용량의 설정근거를 제시할 필요가 있다.

3. 일반적으로 최저용량은 최고용량의 10% 이상이 바람직하나, 추정 임상용량과의 차이가 클 경우에는 최고용량의 10% 미만의 용량으로 설정하여도 좋다.

4. 시험물질을 사료 또는 물에 혼합 투여하는 경우에는 투여기간 중 개별 또는 군당 사료섭취량 또는 물섭취량을 측정하여 시험물질 섭취량을 산출하며, 그 측정간격은 투여 개시 후 3개월간은 주 1회 이상, 그 후는 3개월에 1회 이상으로 하는 것이 바람직하다. 또한 시험개시전 및 시험 중에 시험물질의 순도, 안정성 및 불순물을 정성적 또는 정량적으로 분석한다.

5. 대조군은 음성대조군과 필요에 따라 비투여 대조군, 양성대조군을 둔다.

⑤ 시험방법

1. 투여경로는 원칙적으로 임상적용경로로 하고, 경구투여의 경우에는 강제투여 또는 사료, 물 등에 혼합하여 자유롭게 섭취하도록 하며 사료에 혼합하여 투여하는 경우 사료 중 시험물질의 농도는 최고 5%까지로 한다.

2. 투여기간은 랫드에서는 24개월 이상 30개월 이내, 마우스 및 햄스터에서는 18개월 이상 24개월 이내로 하고, 투여는 1일 1회, 주 7회 투여함을 원칙으로 한다.

3. 관찰기간은 시험물질 투여 종료시 또는 투여 종료 후 1-3개월까지로 한다.  저용량군 또는 음성대조군의 누적사망률이 75%가 되는 경우 그 시점에서 생존 동물을 도살하여 시험을 종료한다. 종양이외의 원인에 의한 사망률이 투여 개시 후 랫드에서는 24개월, 마우스 및 햄스터에서는 18개월의 시점에서 50%이내인 것이 바람직하다. 시험동물의 10% 이상이 서로 잡아먹거나 사육상의 문제가 발생하지 않도록 관리한다.

4. 검사방법은 다음 각호와 같다.

가. 각 군의 모든 동물에 대하여 일반 증상을 매일 관찰하고, 체중을 투여 개시 후 3개월간은 주 1회 이상, 그 후는 4주에 1회 이상 측정한다.

나. 시험기간 중의 사망례에 대하여는 신속히 부검하여 기관․조직의 육안적 관찰 및 병리조직학적 검사를 실시한다.

다. 시험기간 중에 빈사상태의 시험동물에 대하여는 신속히 도살, 부검하여 기관․조직의 육안적 관찰 및 병리조직학적 검사를 실시한다.  또한 도살시 필요에 따라 혈액을 채취하여 적혈구수 및 백혈구수를 측정하고, 도말검체를 제작하여 빈혈이나 림프절, 간장, 비장의 종대 등 혈액질환이 예상되는 동물에 대하여는 도말검체를 검사한다.

⑥ 결과의 관찰

1.  관찰 종료시의 생존례에 대하여는 각 군의 모든 동물에 대하여 기관․조직  의 육안적 관찰을 실시한다. 병리조직학적 검사는 최고용량군 및 대조군의  모든 동물에 대하여 실시한다. 단, 최고용량군과 대조군 사이에서 종양발생률에 차이가 있는 기관․조직에 대하여는 기타 시험군의 모든 동물에 대하  여도 해당 기관․조직의 병리조직학적 검사를 실시한다.

2. 도살시 필요에 따라서 혈액을 채취하여 적혈구수 및 백혈구수를 측정하고 도말검체를 제작하여, 빈혈이나 림프절, 간장, 비장의 종대 등 혈액질환이 예상되는 예에 대하여는 도말검체를 검사한다.

3. 육안적으로 확인되는 모든 종양성병변은 반드시 검사한다.

4. 원칙적으로 검사하여야 할 장기․조직은 다음과 같다. 피부, 젖샘(유선), 림프절,  침샘(타액선), 흉골, 척추 또는 대퇴골(골수포함), 가슴샘(흉선), 기관, 폐 및  기관지, 심   장, 갑상샘(선) 및 부갑상샘(선), 혀, 식도, 위, 소장, 대장, 간장, 췌장,  비장, 신장, 부신, 방광, 정낭, 전립선, 고환, 부고환, 난소, 자궁, 질, 안구 및 부속기, 뇌, 뇌하수체, 척수. 다만 육안적 소견 등의 판단에 의해 적절히 가감할 수도  있다.

⑦ 독성동태시험

투여용량, 투여방법 및 시험동물 종과 계통을 선택하기 위해 발암성시험 중   독성동태시험을 적용할 수 있다.

1. 용량설정시의 적용 : 선행된 독성시험에서 사용한 시험동물과 다른 종 및 계통을 사용하는 경우와 투여경로 및 투여방법이 다른 경우, 특히 시험물질을 사료에 혼합하여 투여하는 경우에는 독성동태시험 계획 수립시 특별한 주의를 기울여야 한다. 독성동태시험자료는 임상에서의 노출정도를 고려하여 발암성시험 용량을 설정하는데 참고가 되며, 비선형 약물동태에 의해서 시험결과의 해석이 곤란한 경우 용량설정에 도움이 된다. 원칙적으로, 발암성시험의 용량은 임상에서 사용하는 사람에서의 최대노출량을 초과하도록 설정하는 것이 바람직하나 ‘종특이성’이 고려되어야 한다. 발암성시험 각 단계 및 적절한 용량군에서 시험물질과 대사체의 전신노출을 측정하는 독성동태시험 결과는 동물모델과 사람간의 노출을 비교하는 관점에서 고찰되어야 한다.

2. 본시험에서의 적용 : 별도로 실시한 시험 또는 용량설정시험에서 결정된 시험물질의 독성동태양상과 발암성 본시험에서의 노출이 일치하는지를 모니터링을 통하여 재확인하는 것이 바람직하다. 이러한 모니터링은 시험기간중에 여러번 행하는 것이 적당하나 6개월을 초과하여 지속할 필요는 없다.

[별표8] 국소독성시험

① 시험종류

국소독성시험은 피부자극시험, 안점막자극시험으로 한다.

② 피부자극시험

1. 시험동물

젊고 건강한 백색토끼(2.0～3.0kg)6마리 이상을 사용한다.

2. 시험방법

가. 투여량은 시험물질이 액체인 경우 0.5ml, 고체 또는 반고체인 경우 0.5g  으로 한다.

나. 도포부위는 털 깎은 등부위의 피부이고, 2.5cm×2.5cm의 비찰과피부 2개  부위와 찰과피부 2개 부위로 한다.

다. 도포 방법은 가로세로 2.5cm의 피부에 시험물질을 적용한 후 가아제로   덮고, 가아제를 테이프로 고정한다. 가아제의 위에 시험물질의 증발을 막  기 위해 침투성이 없고 반응성이 없는 고형 재질의 박지로 덮고 테이프  등을 사용하여 고정한다.

3. 적용부위의 관찰

시험물질 투여 후 24, 72시간에 실시하고 표 1에 의해 평가한다.

③ 안점막 자극 시험

1. 시험동물

가. 젊고 건강한 백색토끼(2.0～3.0kg)를 사용한다.

나. 시험동물의 양쪽 안구는 시험개시 24시간 전에 미리 안검사를 실시하여 안구손상 등 각막의 손상이 없어야 한다.

2. 시험방법

가. 점안량은 액체인 경우 0.1ml, 고체 또는 반고체인 경우 0.1g으로 한다.

나. 시험물질을 9마리의 토끼 한쪽 눈에 점안하고, 그 중 3마리는 20～30초 후 양쪽 눈에 미온 무균생리식염수 20ml 정도로 1분간 세안하고, 나머지 6마리는 세안하지 않는다.

3. 관찰

시험물질을 투여하지 않은 다른 쪽 눈을 대조로 하여, 시험물질을  투여 후  1, 2, 3, 4, 7일에 실시하여 표 2에 의해 평가하고, 그 후에도 상해가 잔존    하면 3일 간격으로, 투여 13일 이상 행한다.

(표 1) 피부반응의 평가

(1) 홍반과 가피형성

등 급

◦ 홍반이 전혀 없음............................................................................................... 0

◦ 아주 가벼운 홍반(육안으로 겨우 식별할 정도)......................................... 1

◦ 분명한 홍반.......................................................................................................... 2

◦ 약간 심한 홍반.................................................................................................... 3

◦ 심한 홍반(홍당무 색의 발적)과 가벼운 정도의 가피............................... 4

◦ 총 가능한 홍반 점수.......................................................................................... 4

(2) 부종 형성

◦ 부종이 전혀 없음................................................................................................ 0

◦ 아주 가벼운 부종(육안으로 겨우 식별할 정도).......................................... 1

◦ 가벼운 부종(뚜렷하게 부어 올라서 변연부가 분명히 구별될 경우) ... 2

◦ 보통의 부종(약 1㎜정도 부어 올랐을 경우)................................................ 3

◦ 심한 부종(1㎜ 이상 부어오르고 노출부위 밖에까지 확장된 상태) ..... 4

◦ 총 가능한 부종 점수.......................................................................................... 4

(표 2) 안구병변의 등급

(1) 각 막

(A) 혼탁 : 안구의 농후한 정도(가장 농후한 지점을 관찰함)

◦ 화농이나 혼탁이 없음 ...................................................................................... 0

◦ 혼탁이 분산 혹은 밀집되어 있으나(정상적인 투명성이 약간 둔화

된 것과는 다름)홍채의 말단이 명확히 관찰됨............................................ 1

◦ 반투명한 부분이 쉽게 관측되나, 홍채의 말단이 약간 불명확함 ......... 2

◦ 진주 색깔을 나타내고 홍채의 말단이 관찰되지 않으며 동공의

크기가 가까스로 관측됨.................................................................................... 3

◦ 각막이 불투명하고 혼탁 때문에 홍채가 관찰 안됨................................... 4

(B) 혼탁된 각막의 범위

◦ 1/4 이하(그러나 0은 아니다)........................................................................... 1

◦ 1/4 이상 1/2 미만 ............................................................................................. 2

◦ 1/2 이상 3/4 미만 ............................................................................................. 3

◦ 3/4 이상 1까지 ................................................................................................... 4

A×B×5                            최대치 = 80

(2) 홍채

(A) 반응치

◦ 정상 ....................................................................................................................... 0

◦ 현저한 주름의 형성, 충혈, 종창, 각막 주위에 중등도의 충혈이

단독 혹은 혼합되어 나타나고 홍채는 빛에 대해 반응함(둔한 반응

은 양성).................................................................................................................. 1

◦ 빛에 대해 반응 없으며, 출혈되고 대부분 파괴됨(이상과 같은

증상의 일부 혹은 전부)..................................................................................... 2

A×5                               최대치 = 10

(3) 결막

(A) 발적(안검결막 및 안구결막에 한함)

◦ 혈관은 정상........................................................................................................... 0

◦ 몇몇 혈관은 명확히 충혈.................................................................................. 1

◦ 넓은 심홍색 색조, 각각의 혈관은 쉽게 관찰 안됨.................................... 2

◦ 엷은 선홍색........................................................................................................... 3

(B) 결막 부종

◦ 부풀지 않음........................................................................................................... 0

◦ 정상보다 약간 종창(순막 포함)....................................................................... 1

◦ 안검의 부분적 외전을 동반한 현저한 종창................................................. 2

◦ 눈이 반쯤 감길 정도의 안검의 종창.............................................................. 3

◦ 눈이 반 이상 감길 정도의 안검의 종창........................................................ 4

(C) 배출물

◦ 배출물 없음	0

◦ 약간의 배출물(정상 동물의 내부 눈꼬리에서 관찰되는 작은 양 제외)	1

◦ 속눈섭과 눈꺼풀을 적시는 배출물	2

◦ 눈 주위의 상당 부위와 속눈섭과 눈꺼풀을 적시는 배출물	3

점수(A+B+C)×2                    최대치 = 20

[별표9] 국소내성시험

시판되는 제형 혹은 (타당성이 있으면) 유사한 제형을 사용하여 주사부위의 임상․병리학적 평가를 실시한다. 그러나 단회 혹은 반복투여독성시험에서 임상에 적용되는 조성 및 제형에 대하여 주사부위변화를 병리학적으로 검사하였다면 별도의 국소내성시험은 생략될 수 있다[주 60].

[별표10] 단회투여흡입독성시험

① 시험동물

1. 원칙적으로 랫드를 사용하고 그 외의 사유가 있는 경우 포유동물 중에서   선택하여 사용할 수 있다.

2. 동물수는 각 군당 10마리(암․수 각각 5마리) 이상으로 하고, 시험당시 임  신하였거나 임신경력이 있는 암컷은 사용하지 않는다.

② 시험방법

1. 시험물질의 투여농도

가. 최소한 세 가지 이상의 농도를 사용하고,

나. 사용할 각 농도는 예비시험을 통하여 결정하거나

다. 가장 높은 농도는 LC50값보다는 높지만 100% 치사율을 발휘하지 않는 농도를 취하고

라. 중간농도는 LC50값 부근,

마. 가장 낮은 농도는 LC50값 보다 낮고 전혀 치사를 가져오지 않는 농도보다는 높은 농도를 취한다.

2. 대조군

비투여군 및 용매투여군 등으로 한다.

3. 시험물질 투여 방법

가. 흡입챔버(exposure chamber)를 사용하여 동물을 챔버속에 넣어 시험하거나 머리 부분만 챔버안에 넣어 시험한다.

나. 선정된 농도의 시험물질을 공기와 섞어 챔버안에 주입시키고, 이때 챔버내의 공기유통은 시간당 12～15회 정도가 되도록 공기주입 속도를 조절한다. 또한 산소의 비율은 19%, 온도는 22±3˚C, 습도는 30-70%로 유지하여야 한다.

다. 동물을 챔버에 넣어 시험하는 경우 한 마리씩 따로 사육케이지에 넣어 시험하는 것이 적합하며, 동물이 차지하는 공간은 챔버전체 공간의 5%이내가 되어야 한다.

라. 투여시간은 챔버안의 시험물질 농도가 균일하게 된 후 4～6시간으로 단회 투여한다.

마. 투여기간동안 챔버내 공기의 주입속도, 온도, 습도를 매 30분마다 기록하고 공기중 시험물질의 실제 농도는 가능하면 연속적으로 측정하되 최소한 시작과 끝, 그리고 중간에 측정하고, 분무제의 경우 입자크기의 분포를 시작과 끝, 그리고 중간에 각각 측정하여야 한다.

③ 관찰

1. 관찰기간

14일로 하고 동물을 사육하면서 다음과 같은 시험 및 관찰을 한다.

가. 체중은 시험직전과 시험종료시 측정하고 시험기간 중에는 일주일 간격으로 측정한다.

나. 일반적 독성증세로서 피부, 모피, 안구, 점막, 호흡기계, 순환계, 자율신경계 및 중추신경계, 운동 및 행동양식, 진전, 경련, 타액분비, 설사, 기면, 수면과 혼수상태 등을 사육상자 옆에서 매일 관찰한다.  증세가 나타날 경우 증세, 발병시간, 정도, 지속시간을 기록한다.  관찰기간 중 사망한 동물은 부검하기 위해 냉동시키고, 쇠약한 동물은 따로 격리한다.

다. 사망동물 및 관찰기간이 끝난 생존 동물에 대하여는 부검, 육안적 관찰을  실시하고 생존 동물 중 이상이 발견된 장기․조직에 대하여는 필요시 병리조직학적 검사를 실시한다.

2. 시험결과의 기록

LC50값과 이의 95% 신뢰도 범위로써 표현하며 일반독성 증세 및 병리조직학적 시험결과를 기록한다.

[별표11] 반복투여흡입독성시험

① 시험동물

1. 마우스, 랫드, 기니픽, 토끼, 개 중 1종 이상으로 한다.

2. 동물수는 각 군당 20마리(암․수 각각 10마리) 이상으로 하고, 개의 경우는  8마리(암․수 각각 4마리) 이상으로 한다.

② 시험방법

1. 시험물질의 투여농도

최소한 세 가지 이상의 농도를 사용하고 가장 높은 농도는 시험기간동안 LC10값 이하의 치사율을 일으키는 농도를 취하고 가장 낮은 농도는 전혀 독성증세를 나타내지 않으나 실제 사용농도 보다 높은 농도를 취한다.

2. 대조군

비투여군 및 필요한 경우 용매투여군을 둘 수 있으며, 용매투여군의 농도는 투여군중에서 가장 높은 농도의 용매농도를 실시한다.

3. 시험물질 투여방법

단회투여흡입독성시험과 동일하며 시험기간은 하루 6시간씩 주당 5일로써 90일간 투여를 원칙으로 하고 시험목적에 따라 2주간 또는 28일간 투여로 할 수도 있다.

③ 시험결과

1. 시험결과에는 다음 사항이 포함되어야 한다.

가. 매일 시험동물의 임상 관찰 결과

나. 매주 마다 시험동물의 체중 및 사료섭취량

다. 시험종료시 시험동물로부터 혈액을 채취하여 다음 시험을 한다.

(1) 혈액검사로서 헤마토크리트치, 적혈구수, 백혈구수, 백혈구 백분율, 혈액응고시간, 혈소판수 등을 측정한다.

(2) 혈액생화학적 검사로서 칼슘, 인, 염소, 나트륨, 혈당, 트란스아미나제(AST, ALT), γ-GT, 요소질소, 알부민, 크레아티닌, 빌리루빈, 혈청단백, 오르니틴디카복실라제를 측정하고 그 외 필요에 따라 독성효과를 평가하는데 있어 지표가 될 수 있는 지질, 산, 염기도, 메트헤모글로빈, 콜린에스터라제 활성 등을 측정한다.

라. 사망동물 및 관찰기간이 끝난 생존 동물에 대해서는 부검 즉시 간, 신장, 부신, 고환(난소), 폐의 장기무게를 측정하고 최대용량군과 대조군에 대하여는 상기장기 및 상부호흡기계(기관, 비인두조직), 림프절, 침샘(타액선), 골 및 골수, 가슴샘(흉선), 심장, 갑상샘(선), 부갑상샘(선), 식도, 위, 소장, 대장, 간(담낭), 췌장, 비장, 심장, 부신, 방광, 고환(난소), 자궁, 뇌, 뇌하수체, 대동맥, 말초신경 및 병변이 관찰된 기타 장기․조직에 대해서 병리조직학적 검사를 실시하지만 육안소견으로 보아 그 필요성이 인정되지 않는다고 판단되는 경우에는 그 일부를 생략할 수 있다.

[별표12] 복합제의 제제별 독성시험

① 경구투여제의 독성시험

1. 단회투여독성시험

가. 동물의 종류 : 1종 이상

나. 관찰기간 : 72시간이상

다. 투여방법 : 경구투여

라. 복합제의 유효성분 모두가 경구투여시, 문헌 등에 의한 LD50값 등으로 보아 저독성(LD50이 2g/kg 이상인 경우)이라 판단되는 경우에는 그 유효성분 및 복합제의 시험을 생략할 수 있다.

2. 1개월 반복투여독성시험

가. 동물의 종류 : 1종 이상

나. 관찰기간 : 1개월 이상

다. 투여량 : 용량단계는 적어도 3단계의 시험물질 투여군으로 하고, 최대내성용량 및 무해용량 등을 포함하여 용량반응관계가 나타날 수 있도록 설정한다.

라. 투여방법 : 경구투여

마. 복합제의 유효성분 모두가 경구투여시 문헌 등에 의한 LD50값 등으로 보아 저독성(LD50이 2g/kg 이상인 경우)이라 판단되는 경우에는 그 유효성분 및 복합제의 시험을 생략할 수 있다.

바. 복합제의 단회투여독성 시험결과 및 약리작용 등으로 보아 1개월 반복투여독성시험을 생략할 수 있다.

3. 3개월이상 반복투여독성시험

가. 동물의 종류 : 1종 이상

나. 관찰기간 : 3개월 이상

다. 투여방법 : 경구투여

라. 복합제의 반복투여독성과 각 유효성분의 반복투여독성시험결과가 독성학적으로 차이가 없다고 추정되는 경우에는 3개월이상 반복투여독성시험을 생략할 수 있다.

마. 연용 가능성이 전혀 없는 복합제에 대해서는 3개월이상 반복투여독성시험을 생략할 수 있다.

② 주사제의 독성시험

1. 단회투여독성시험

가. 동물의 종류 : 1종 이상

나. 관찰기간 : 72시간 이상

다. 투여방법 : 원칙적으로 임상적용 경로

라. 사람에 적응하는 방법이 정맥주사인 복합제에서 정맥주사시 정확한 LD50값을 구하기 어려운 경우 그 유효성분 및 복합제의 시험을 생략할 수 있다.

마. 복합제의 유효성분 모두가 정맥주사시 문헌 등에 의한 LD50값 등으로 보아 저독성이라 판단되는 경우에는 그 유효성분 및 복합제의 시험을 생략할 수 있다.

2. 1개월 반복투여독성시험 : 투여방법은 임상적용 경로로 하며 기타 사항은 경구투여제의 시험방법에 준한다.

가. 사람에 적응하는 방법이 근육주사인 경우 피하주사방법으로 대체할 수 있으며, 정맥주사인 경우 복강내 주사방법으로 대체할 수 있다.

3. 3개월이상 반복투여독성시험 : 투여방법은 임상적용 경로로 하며 기타 사항은 경구투여제의 시험방법에 준한다.

가. 사람에 적응하는 방법이 근육주사인 경우 피하주사방법으로 대체할 수 있으며, 정맥주사인 경우 복강내 주사방법으로 대체할 수 있다.

③ 수액제의 독성시험

1. 단회투여독성시험

가. 동물의 종류 : 1종 이상

나. 관찰기간 : 72시간

다. 투여방법 : 정맥주사

라. 시험약제 : 수액 및 대조수액

마. 대조수액은 원칙적으로 다음의 것을 사용한다.

(1) 당 제 제 : 대응하는 농도의 포도당 주사액

(2) 혈장증량제 : 기존의 것으로서 화학적으로 유사하고 널리 사용되는 제제

(3) 전해질제제 : 링겔액

(4) 아미노산제제 : 기존의 것으로서 가장 유사하고 널리 사용되는 제제

바. 상기 각 항이 조합된 제제의 경우에는 유효성분에 해당하는 대조수액을 각각 당해 제제의 농도에 대응하도록 혼합 제조한 것을 사용하여야 한다.

사. 독성이 낮아서 LD50값을 구하는 것이 곤란한 제제의 경우는 200g/㎏을 투여한 경우에서의 독성소견을 제시한다.

2. 1개월 반복투여독성시험

가. 동물의 종류 : 1종 이상

나. 관찰기간 : 1개월 이상

다. 투여방법 : 정맥주사 또는 점적정주

라. 시험약제 : 수액 및 대조수액

마. 투여량 : 수액제의 단회투여독성시험에 따라서 적의 투여 가능한 양으로 한다.

바. 대조수액은 원칙적으로 다음의 것을 사용한다.

(1) 당제제 : 대응하는 농도의 포도당 주사액

(2) 혈장증량제 : 기존의 것으로서 화학적으로 유사하고 널리 사용되는 제제

(3) 전해질제제 : 링겔액

(4) 아미노산제제 : 기존의 것으로서 가장 유사하고 널리 사용되는 제제

사. 상기 각 항이 조합된 제제의 경우에는 유효성분에 해당하는 대조수액을 각각 당해 제제의 농도에 대응하도록 혼합 제조한 것을 사용하여야 한다.

아. 상기 투여량으로 변화가 없을 경우에는 최대 안전량으로 시험한다.

3. 3개월 이상 반복투여독성시험

가. 동물의 종류 : 1종 이상

나. 관찰기간 : 3개월 이상

다. 투여방법 : 정맥주사 또는 점적정주

라. 투여량 : 1개월 반복투여독성의 투여량과 같음

마. 1개월 반복투여독성시험에서 차이가 없다고 추정된 경우에는 3개월이상반복투여독성시험을 생략할 수 있다.

④ 외용제의 독성시험

1. 단회투여독성시험

가. 동물의 종류 : 1종 이상

나. 관찰기간 : 72시간 이상

다. 투여방법 : 피하주사

라. 복합제의 유효성분 중 모두가 피부적용시, 문헌 등에 의한 LD50값 등으로 보아 저독성이라고 판단되는 경우에는 그 유효성분 및 복합제의 시험을 생략할 수 있다.

2. 1개월 반복투여경피독성시험

가. 동물의 종류 : 1종 이상

나. 관찰기간 : 1개월 이상

다. 시험약제의 농도 : 복합제 및 복합제의 유효성분의 농도를 사람에게 적용하는 농도의 약 5배에 해당하는 양으로 조제한다.

3. 점막자극시험

가. 동물의 종류 : 토끼

나. 투여방법 : 점안

다. 점막자극시험을 필요로 하는 외용제는 사람에 적용하는 방법이 점막에 사용하는 것 또는 점막에 사용될 가능성이 있는 것으로 한다.

라. 점막에 대한 자극성을 알기 쉬운 시험방법이 이 방법보다 우수한 것이 있을 경우 그 방법에 따라서 시험할 수 있다.

[주1]

약물동태학적자료는 시험물질 및 시험종류별로 다르기는 하나, 보통 혈장(또는 전혈 또는 혈청)에서 시험물질 및 그 대사체의 농도를 적절한 시점에 측정하여 산출한다. 그러나, 시험물질에 따라서 혈장외의 다른 생체시료(예 : 뇨 또는 장기조직 등)에서 측정하는 것이 적절할 수 있다. 독성동태시험에서 노출도를 평가하는데 가장 일반적으로 사용되는 약물동태학적 지표는 혈장(또는 전혈 또는 혈청)으로부터 산출한 혈중농도-시간반응곡선하면적(AUC), 최고혈장농도(Cmax), 최고혈장농도에 도달하는 시간(Tmax) 및 특정시간에서의 혈장농도(Ctime)이다. 시험물질에 따라서 혈장단백과 결합하지 않은 시험물질의 농도에 근거하여 노출도를 산출하는 것이 바람직할 수도 있다. 또한 생체이용율, 생체내반감기, 혈장단백과 결합하지 않은 시험물질의 비율, 체내분포용적등이 독성동태시험결과를 해석하는데 유용할 수도 있다. 이러한 약물동태학적지표와 생체시료 채취시간은 시험물질과 시험목적에 따라 적절하게 선택되어야 한다.

[주2]

독성동태시험의 2차적 목적은 독성시험에서 얻어진 노출 자료와 독성학적 소견과의 상관성을 규명하여 임상사용시의 안전성을 적절히 평가하며, 독성시험에서 동물종의 선택과 투여계획 설정 근거를 제공할 뿐 아니라 다음 독성시험 계획 수립시 정보를 제공하는 것이다.

[주3]

비설치류는 독성증상을 명확하게 관찰할 수 있는 용량도 가능함.

[주4]

단기사용(1주 이내) 또는 생명을 위협하는 질환치료를 목적으로 하는 생물공학의약품의 경우, 2주 반복투여독성시험을 수행할 수 있다.

[주5]

비설치류에 있어서는 9개월의 반복투여독성시험을 고려한다.

[주6]

시험물질이 고도의 체내축적성, 비가역적인 독성의 발현, 투여기간의 장기화에 의해 현저히 독성이 증가하는 특성을 가진 경우

[주7]

과학적 유연성 : 이 기준은 강제 규칙이 아니며 최종적인 것이라기 보다는 출발점이다. 이 기준은 연구자가 시험물질이나 기술수준에 관한 이용 가능한 정보에 따라 시험계획을 강구할 수 있는 기본적 근거가 된다. 이 기준에는 몇 가지 대체시험방법이 언급되어 있으나 방법을 탐구하거나 고안해 낼 수 있는 것도 있다. 시험계획을 고안하는 중요한 목적은 생식․발생에 대한 독성의 징후를 밝혀내는 것이다. 시험방법 및 기술적인 진행과정의 세세한 부분들은 본문에서 제외했다. 어떤 실험실에서는 적절한 기술이 다른 실험실에는 적절하지 않을 수도 있으므로 그러한 결정은 연구자들의 재량으로 맡기는 것이 옳다.

[주8]

시기에 관한 결정 : 이 기준에서는 교미가 밤사이에 이루어졌더라도 질정검사에서 정자가 확인되거나 질전이 확인된 날을 임신 0일로 한다. 다른 언급이 없으면 랫드, 마우스, 토끼의 착상시기는 임신 6-7일이고, 경구개가 폐쇄되는 시기는 임신 15-18일로 추정한다. 다른 방법도 마찬가지로 인정되나 보고서에 반드시 명시하여야 한다. 또한 투여기간에 공백이 없도록 다른 시험에서도 시기를 일치시켜야 한다. 일련의 시험에서 투여기간은 적어도 하루정도 중복이 되도록 기간을 설정하는 것이 바람직하다. 교미일은 태자 및 신생자에 관한 수치에 영향을 주기 때문에 정확성을 기해야 한다. 차세대에 대해서도 비슷한 방법으로, 특별한 언급이 없는 한 신생자가 태어난 날을 출산 후 또는 수유 0일로 산정한다. 그러나, 특이하게 분만이 지연되거나 분만시간이 연장될 경우 교배 후 시간을 참조하는 것이 유익할 것이다.

[주9]

일차시험 및 추가시험 : 정도의 차이는 있으나 모든 일차시험(기준에 근거한 시험)은 그 성질상 집약된 최종 반응결과를 나타낸 것이다. 즉 어느 하나의 지표에서 보인 영향에는 몇 개의 다른 원인이 있을 수 있다. 예로서 출생시 한배새끼수 감소의 원인은 배란율(황체수)의 감소, 착상전 흡수의 증가, 착상 후 흡수의 증가 또는 출생 직후의 사망증가가 원인일 수 있다. 또한 이러한 사망은 초기에 유발된 기형에 기인할 수 있으며, 이러한 기형은 그 후에 따르는 이차적인 변화에 의해 관찰할 수 없게 되었을 수도 있다. 특히 대조군에서 낮은 빈도로 발생하는 자연발생적 영향에 대해서는, 약물투여에 의한 것과 자연적으로 발생하는 것의 구별은 다른 종류의 영향과 연관성을 고려하여 판단한다. 독성물질은 보통 한가지 이상의 영향을 용량의존적으로 유발한다. 예를 들면, 태자사망의 증가와 경도의 형태적 변화의 발생률 증가는 기형 유발과 거의 일정하게 연관이 있다. 어떤 지표에 대한 영향이 밝혀지면, 그와 연관된 항목에 대하여 추가시험을 고려하지 않으면 안된다. 즉, 그 물질의 독성의 본질, 범위 및 기원을 명확히 밝혀야 한다. 추가시험에서는 사람의 위험성 평가에 이용되는 용량반응관계를 확인하여야 한다. 이것은 일차시험에서 투여에 의한 변화와 자연발생적 변화를 구별하기 위해 용량의존성 여부를 조사하는 것과는 다르다

[주10]

예비시험 : 생식․발생독성시험들을 계획하고 시작할 때, 보통 단회투여독성 및 1개월 이상 반복투여독성시험에서 얻은 정보를 활용할 수 있다.  이러한 정보로부터 생식․발생독성시험의 시험물질 투여량을 설정하는 것이 충분히 가능한 것으로 생각된다. 예비시험을 충분히 실시한 경우 그 결과는 본시험 용량설정에 대한 과학적 근거의 일부가 된다. 이러한 시험은 원칙적으로 GLP 기준에 관계없이 제출되어야 한다. 이로써 동물의 불필요한 사용을 피할 수 있게 된다.

[주11]

동물 종과 계통의 선택 : 생식․발생독성시험을 위한 동물 종과 계통을 선택하는데 있어서 적절한 동물모델 선정에 주의를 기울여야 한다. 다른 독성시험에서 사용한 동물과 같은 종 및 계통을 선택할 경우 부가적인 예비시험을 실시하는 것을 피할 수도 있다. 만약 선택된 동물 종이 사람의 모델로서 적절하다는 것이 독성동태자료나 약리 및 독성 자료에 의해 밝혀질 수 있다면 단일종의 시험만으로도 충분하다. 제2의 동물 종을 사용하더라도 사람과 유사성을 나타내지 않는다면 그 동물 종을 사용하는 의미가 거의 없다. 시험물질, 시험계획, 그리고 결과의 해석과 연관지어서 동물 종(계통)의 장․단점을 고려해야 한다. 모든 동물 종에는 나름대로 장점이 있다. 랫드, 그 다음으로 마우스가 일반적인 목적에 좋은 모델이다. 토끼는 배․태자독성시험을 제외한 다른 생식․발생독성시험에서나 반복투여독성시험에서 “비설치류”로서는 경시되어 온 경향이 있으나 수태능시험 특히 수컷의 생식능시험에는 유용한 모델동물로서의 특성을 갖고 있다. 토끼나 개(반복투여독성시험에서 제2의 동물 종으로 자주 사용됨)는 모두 고통을 주는 기술(전기자극 사정)을 사용치 않고도 정액 시료를 쉽게 얻을 수 있다. 같은 개체에서 시간에 따른 정액분석이 가능하다. 그 외 대부분의 다른 종은 일반적 목적의 모델동물로서는 좋지 않으나 매우 특수한 목적의 시험에는 유용할 수 있다. 모든 동물 종은 다음과 같은 단점을 갖고 있다.

가. 랫드 : 성호르몬에 대해 민감하다. 프로락틴이 임신성립과 초기 임신유지에 주요한 호르몬이기 때문에 프로락틴 분비에 영향을 주는 도파민 작용약에 대하여는 부적절하다. 임신말기에 비스테로이드성 항염증제에 대해 감수성이 높다.

나. 마우스 : 대사속도가 빠르다. 스트레스에 대하여 감수성이 높다.  태자기형이 무리지어 일어나는 것이(모든 종에서 일어나지만) 특징이다. 태자의 크기가 작다.

다. 토끼 : 종종 독성동태시험이나 독성시험의 자료가 충분치 않다. 일부 항생물질과 소화관 장애에 대한 감수성이 높다. 일반증상의 해석이 쉽지 않다.

라. 기니픽 : 종종 독성동태시험자료나 독성시험의 자료가 충분치 않다. 일부 항생물질과 소화관 장애에 대한 감수성이 높다. 임신기간이 길다. 배경자료가 충분치 않다.

마. 집돼지 또는 미니 돼지 : 배경자료의 변동이 크고 기형발현이 높다. 다량의 시험물질이 필요하다. 사육설비에 비용이 소요된다. 배경자료가 충분치 않다.

바. 페렛(Ferrets) : 적절한 관리시스템이 없으면 계절성 번식을 한다(번식 성공률이 사람/동물 사이의 관계에 매우 의존적이다). 배경자료가 충분치 않다.

사. 햄스터 : 정맥내 투여가 불가능하지는 않으나 매우 어렵다. 투여한 약물을 볼주머니에 저장할 가능성이 있다. 성질이 공격적이고 소화관장애에 대하여 감수성이 높다. 많은 약물에 대하여 민감한 최기형 유발 반응을 보인다. 태자의 크기가 작다.

아. 개 : 계절성 번식을 한다. 근친교배에 의한 폐해가 나타나기 쉽다. 배경자료가 불충분하다.

자. 영장류 : 다른 동물 종과 마찬가지로 사람과 독성동태자료가 다를 수 있다. 배경자료가 불충분하다. 종종 위해성을 검출하기에 충분한 수의 동물사용이 쉽지 않다. 장애를 검출하는 것을 목적으로 하는 시험보다는 생식․발생독성이 알려진 물질의 특성을 검사하는 목적의 시험에 적합하다.

[주12]

전동물(whole animal) 이외의 시험계의 사용 : 전동물을 사용하는 것 이외에 여러 시험계가 개발되어 예비시험(예비검색 또는 우선순위 결정시험)과 추가시험에 이용되고 있다. 화학구조 또는 약효가 유사한 화학물질을 예비적으로 검색하기 위해서는 적어도 한물질 이상에 대하여는 동물시험에서의 결과를 아는 것이 필수적이다(추정에 의하여 효과가 예측됨). 이러한 시험계획으로 보다 높은 단계의 시험을 위한 시험물질을 선택할 수 있다. 추가시험 또는 물질의 특성을 알아보기 위해서는 전동물 시험이 아닌 다른 시험계를 이용하여 상세한 발생과정에 대한 연구가 가능하다. 예를 들면, 독성의 기전연구, 농도-반응 관계의 확인, 감수성이 높은 시기의 선택, 또는 특정 대사체의 영향을 검출하는 것 등이다.

[주13]

용량설정 : 반복투여독성시험과 비슷한 용량을 생식․발생독성시험에서 사용함으로써 전신성 일반독성과 관련지어 수태능에 대한 영향의 해석이 가능하다. 고용량투여군 모체에서 어느 정도의 약한 독성이 유발되는 것이 바람직하다. 시험물질의 종류에 따라 반복투여독성시험이나 생식․발생독성의 예비시험으로부터 고용량을 설정하는 경우 그 규정요소는 다음과 같다.

가. 체중증가의 억제

나. 체중증가의 항진, 특히 항상성 기전의 변화와 관련되는 경우

다. 특이적 표적장기 독성

라. 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사

마. 과도한 약리반응. 뚜렷한 임상반응(예 : 진정, 경련)을 수반하거나 수반하지 않는 것도 있다.

사. 투여경로와 관련이 있는 시험물질 또는 처방의 물리화학적 성상에 의하여 실제 투여 가능한 용량은 한계가 있다. 보통 1g/kg/day가 적당한 한계용량이다.

아. 독성동태시험은 저독성 시험물질의 최고용량을 결정하는데 유용하다. 그러나 투여량을 증가시켜도 혈장중 또는 조직내 약물농도가 증가하지 않을 때에는 용량을 증가시키는 것이 의미가 없다.

자. 예비시험에서 배․태자 사망률의 현저한 증가

[주14]

용량-반응 관계의 결정 : 생식․발생독성시험에서 변이가 많은 경우 자연발생적인 것인지 투약에 의한 영향인지를 구별하기가 어려우므로 용량의존성 여부가 투약에 의한 영향 가능성을 결정하는 중요한 수단이 된다. 생식․발생독성시험에서는 용량-반응 기울기가 급경사를 이루므로, 용량사이 간격이 넓은 것은 권장되지 않는다. 어떤 관찰된 효과에 대해 한 시험에서 용량-반응관계를 검토하는 경우, 최소한 세용량 이상의 용량군과 적절한 대조군을 두는 것이 권장된다. 용량-반응관계가 의심스러우면 네번째 용량군을 두어 용량간격이 너무 차이가 나지 않도록 한다. 이러한 계획으로 생식․발생독성에 대한 "무독성량"을 찾아내야 한다. 무독성량을 구하지 못한 경우, 보다 상세한 연구와 추가시험을 하여야 한다.

[주15]

다른 투여경로에 의한 노출 : 어떠한 투여경로가 신체에 큰 부담을 주는 것을 혈중농도-시간반응곡선하면적(AUC)등으로 보여줄 수 있다면 이보다 작은 신체부담을 주는 경로 혹은 현실적으로 어려운 경로(예 : 흡입)를 연구할 이유가 거의 없다. 새로운 투여경로를 적용하는 시험을 계획하기 전에 기존의 독성동태자료를 이용하여 그 시험의 필요성을 검토하여야 한다.

[주16]

임신동물에서의 독성동태시험 : 임신, 수유동물에 대한 독성동태연구는 급격한 생리적 변화 때문에 문제를 일으킬 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 2상 혹은 3상 연구를 고려하는 것이 최선이다. 시험을 계획할 때 독성동태 자료(종종 비임신 동물에서의 자료)는 시험동물 종의 일반적 적합성에 대한 전반적 정보를 제공하며 연구방법의 결정과 용량설정에 참고가 된다. 시험 중에 독성동태연구를 수행하게 되면 약물투여량의 적정성을 확인하거나 예측되는 동태패턴으로부터 벗어난 것을 입증할 수 있다.

[주17]

다른 대체안의 선택예 : 2g/㎏에서 사망예가 없고 1g/㎏에서 반복투여에 의하여 아무런 독성이 없는 물질에 있어서는 대조군, 2개의 시험군(0.5와 1.0g/㎏)이면 이세대시험으로서 충분한 것으로 생각된다. 그러나 동물 종의 선택이 적절했느냐와 시험물질이 효과가 있는 약물이냐에 대한 문제가 발생할 수 있다.  일생에 한번, 단회투여되는 약물(예 : 진단약, 수술용 의약품)은 투여기간에 관계없이 임상치료용량의 두배 이상을 반복투여하는 것은 곤란할 수 있으며, 이런 경우에는 기간을 단축시켜 고용량을 투여하는 것이 적절하다. 암컷에 대해서는 사람에서의 노출을 고려할 때 기관형성기 이후에 노출시킬 필요는 거의 없다. 도파민 작용약 혹은 혈중 프로락틴 수준을 저하시키는 약물의 경우 생식․발생독성시험에 랫드는 적절하지 않고 토끼가 적절할 수 있으나 많이 사용되지 않고 있다. 반복투여에 의해 혈장 중 독성동태에 변화가 나타나는 약물은, 배․태자발생시험에서 배․태자발달에 대한 위해 가능성이 충분히 평가되지 않을 수 있다. 이러한 경우 수태능 및 초기배 발생시험에서 암컷의 투여기간을 임신 17일까지 연장시키는 것이 바람직하다. 시험 말기 부검에서 수태능과 배자․태자발생에 미치는 영향을 같이 평가할 수 있다.

[주18]

교배전 투여 : 수컷의 교배전 투여기간의 단축은 종래 교배전 장기간 투여하도록 요구했던 수태능에 관한 시험계획에서 정자형성 과정에 대한 기초적 연구자료의 축적과 재평가에 근거한 것이다. 즉 수컷의 생식에만 선택적으로 영향을 주는 약물은 드물고 정자형성에 영향을 주는 화학물질은 대부분 감수분열 이후의 과정에 영향을 미쳐 고환의 무게에 영향을 미친다. 암컷과의 교배는 정자형성에 미치는 영향을 검출하는데 감도가 낮은 방법이다. 고환의 병리조직검사는 정자형성에 미치는 영향을 검출하는 가장 감도가 높은 방법이다. 수컷 생식기관의 적절한 병리조직검사(예: 부잉액에 고정, 파라핀포매, 고환의 2내지 4㎛ 횡단절편, 부고환 종단절편, PAS 및 헤마톡실린 염색)는 정자형성에 미치는 영향을 검출하기 위한 직접적인 검사방법이다. 정자검사(정자수, 정자운동성, 정자형태)는 다른 방법에 의해 얻은 지식을 확인하고 다시 한번 영향을 특징짓기 위하여 이용 가능한 검사이다. 정자검사에는 정관 또는 부고환 미부에서 채취한 시료를 사용하는 것이 보다 적절하다. 정자형성(및 암컷의 생식기관)에 미치는 영향에 관한 정보는 반복투여독성시험 또는 생식․발생독성시험에서 얻어질 수 있다.  수컷 생식기관의 병리조직검사 및 정자검사에 의해 검출되지 않는 수컷 생식에 미치는 영향을 찾아내기 위하여는 교배전 4주간 투여 후 암컷과 교배하는 방법이 그 이상 장기간 투여 후 암컷과 교배시키는 방법과 비교하여 같은 정도로 유효하다는 것이 밝혀졌다. 경우에 따라서는 2주간 투여가 허용될 수도 있다. 그러나 교배전 투여를 2주간 하는 경우에는 그 타당성이 충분히 납득될 수 있도록 설명이 필요하다. 수태능시험의 검색범위를 넓게 실시하지 않으면 안된다는 것을 시사하는 자료가 인정되는 경우에는 보다 상세히 해당되는 영향의 특징을 명확히 하기 위한 적절한 시험이 계획되어야 한다.

[주19]

동물수 : 과거 및 기존의 기준, 그리고 이 기준에서도 각 군당 동물수에 대한 과학적 근거는 거의 없다. 동물수는 시험관리 전반에 지장을 초래하지 않고 취급할 수 있는 최대시험규모에 의해서 결정된다. 이는 동물의 구입․사육비용이 많이 들수록 동물수가 작아진다는 사실에 의해 알 수 있다. 이상적으로는 모든 종에 대하여 최소한 같은 규모의 동물수가 요구되어야 하며, 영장류등 사용빈도가 낮은 동물 종에서는 동물수를 보다 많이 하는 경우도 있다. 또한 필요한 동물수는 그 군에서 영향이 나타날 것으로 예상되는지의 여부에 따라 결정하는 것도 명확하다. 높은 빈도로 영향이 검출되는 것에 대해서는 적은 수의 동물만 필요하며, 영향이 없는 것을 추정하기 위해 필요한 동물수는 검토되는 지표를 고려하여야 하는데, 대조군에서의 발현율(희귀 사건) 또는 중앙주변에의 분산경향(계량치적 혹은 계량치적 변수)을 고려하여 동물수를 정해야 한다. “출생자에 대한 투여”[별표 23]을 볼 것. 희귀사건(기형, 유산, 총태자의 손실 등)을 제외한 모든 경우에, 설치류와 토끼에서 16내지 20 한배새끼에 대한 평가로 연구간에 일관성을 얻을 수 있다. 각 군당 16 한배새끼 이하에서는 연구간 결과에 일관성이 없으며, 군당 20내지 24 한배새끼 이상에서도 일관성과 정확성이 크게 높아지지는 않는다.  이러한 동물수는 평가와 관계가 된다. 만약 다른 평가를 위해 투여군을 나누어야 하는 경우에는 시험시작 시점에서 동물수가 배가 되어야 한다. 마찬가지로 2세대 번식시험에서도 F1 세대의 최종평가에 16내지 20 한배새끼가 필요하다. 자연감소가 있으므로 시험을 시작할 때의 F0 세대의 수가 더 커야 한다.

[주20] 교배

교배비율 : 암․수 모두에 투여할 때 또는 암․수동물에 대해 같은 목적으로 연구할 때 교배비율은 1:1이 좋다. 그 이유는 임신성공률이 높고 분석오류를 피할 수 있으며 결과 해석에 가장 안전하기 때문이다.

교배기간과 방법 : 대부분의 연구기관에서는 2 내지 3주간의 교배기간을 두며, 질전 확인 혹은 질정 검사에서 양성인 암컷은 격리시켜 놓거나 또는 그대로 동거시키기도 한다. 대부분의 랫드는 동거한지 5일 이내에 교미하게(동거 후 첫 발정주기에) 되나 일부 암컷은 위임신이 된다. 위임신 암컷을 수컷과 약 20일 정도 두면 발정주기가 다시 시작되고 임신할 수 있게 된다.

[주21]  최종도태

암컷 : 암컷에서 착상기에 투여를 중지한 경우에는 일반적으로 임신 13 내지 15일에 부검하는 것이 수태능 또는 생식기능의 영향평가(예 : 착상과 흡수자리 구분)에 적당하다. 일반적으로, 수태능시험에서 후기 배자손실, 태자사망과 형태적 이상에 대한 정보를 얻고자 임신 20/21일에 부검하는 것은 유해작용의 검출에 필요하지 않을 수 있다.

수컷 : 교배결과가 나올 때까지 수컷 부검을 연기하는 것이 바람직하다. 수컷 부검을 연기하여도 교배결과가 모호할 때에는 수태능 혹은 불임을 확인하기 위해 비투여 암컷과 교배시킬 수 있다. 수태능 및 초기배 발생시험의 일부로서 투여된 수컷은 투여가 교배기간 이후 부검시까지 계속된다면 수컷 생식계에 대한 독성 평가에 사용될 수 있다.

[주22]

관찰 : 투여기간 중 임신 암컷의 체중을 매일 측정하여 유용한 정보를 얻을 수 있다. 의약품에 대하여는 임신을 제외한 기간(교배전, 교배기간, 수유기간)에도 주 2회 이상 체중을 측정하는 것이 바람직하다. 임신이 의심되는 랫드 또는 마우스(토끼는 제외)의 자궁을 황화암모늄으로 염색하여 착상 후 초기 배자사망을 확인한다.

[주23]

출생자에 대한 투여 : 이 기준은 의약품에 대한 기존 기준에서 유래된 것이므로 이유기에서 성적 성숙에 이르기까지의 전과정에 걸쳐 노출시키지 못하며 생식수명의 단축가능성도 다루지 못한다. 어린이와 청소년에게 사용될 수 있는 의약품등의 유해작용을 검출하기 위해서는 특정 일령의 출생자에게 직접 투여하는 특수시험(사례별로 시험계획을 세우는 것)이 고려되어야 한다.

[주24]

출생 전․후 발생 및 모체기능시험 : 출생 전․후 발생 및 모체기능시험을 두 가지 시험, 즉 배자발생기간에 노출하는 시험과 태자기간, 출산 및 수유기간에 노출하는 시험으로 각각 분리한다면 두시험 모두에서 출생자의 출생 후 평가가 요구된다.

[주25]

F1-동물 : 이 기준에서는 생식기능의 평가에 이용할 F1개체를 이용하여 행동 및 다른 기능시험을 실시할 수 있으므로 이유 후에 한배새끼 당 암․수 각 1수의 F1 동물을 관찰하는 것이 권장된다. 이럴 경우 각 개체 간에 다른 시험에서 나타난 결과와의 연관성을 서로 참고할 수 있다. 그러나 실험실에 따라 행동평가와 생식기능평가에 다른 쌍의 동물을 이용하고 있다. 각 실험실에 따라 어느 방법이 적합한지는 적용되는 시험조합과 이용할 수 있는 설비 등에 따라 다르다.

[주26]

한배새끼수의 조정 : 생식․발생독성시험에서 한배새끼수의 조정여부에 대하여는 아직 논란중이다. 연구자는 반드시 한배새끼수의 조정여부를 설명하여야 한다.

[주27]

신체발달, 감각기능, 반사 및 행동 : 신체발달의 가장 중요한 지표는 체중이다. 개안, 이개개전, 피모발달, 절치맹출 등 이유 전 발달지표는 출산자의 체중과 상관성이 높다. 적어도 임신기간이 유의적인 차이를 보이는 경우에는 체중은 출생 후 시간보다도 교미 후 시간경과에 관련된다. 정향반사, 청각반사, 공중낙하 정향반사 및 빛에 대한 반사등도 마찬가지로 신체발달에 관련된다. 이유 후 발달지표로서 권장되는 항목은 암컷의 질개구와 수컷의 귀두와 포피와의 분리가 있다. 수컷의 귀두와 포피와의 분리는 테스토스테론의 증가와 관련이 있고 정소하강과는 관련이 없다. 이러한 지표들은 성적 성숙이 시작되었음을 보여주며, 대조군과의 차이가 특이적인 것인지 또는 일반적 성장과 관련이 있는 것인지를 명확히 하기 위해 성적 성숙기의 체중을 기록하는 것이 권장된다. 현재까지 기능검사는 거의 행동검사에 방향이 맞추어져 왔고 많은 노력이 경주되었지만 권장되는 특정한 시험방법은 인정되지 않는다. 연구자들이 감각기능, 운동기능, 학습 및 기억에 미치는 영향을 평가할 수 있는 방법을 찾아내는 노력이 필요하다.

[주28]

태자의 개체식별 및 평가 : 이상형태를 검출하기 위하여 한 개체에 대한 여러 다른 검사(예를 들어, 체중, 외부검사, 내장 및 골격검사)의 결과를 모두 관련지을 수 있어야 한다. 대조군 및 고용량군의 골격 및 내장 기형검사에서 의미 있는 차이가 관찰되지 않을 경우 중용량 및 저용량군 태자의 관찰이 필요치 않을 수도 있다. 그러나 미래의 검사 가능성에 대비해 고정표본을 보관하는 것이 바람직하다. 고정하지 않은 표본을 미세절개방법으로 관찰한 경우, 고정된 태자표본과 비교하는 것은 곤란하다.

[주29]

통계분석에서 가장 중요한 부분은 서로 다른 변수간의 상관성 검토와 자료의 분포를 명확히 하는데 있다(기술통계). 이 검토에 의해 군 간의 비교방법이 결정된다. 생식․발생독성시험에서 얻은 각종 지표는 보통 정규분포를 따르지 않고, 계량치로 보이는 것부터 극단적 분류까지 다양하다. 추측통계학(통계학적인 유의성을 결정하는 방법)을 사용할 때는 태자나 신생자가 아닌 번식쌍(교미쌍)이나 한배새끼가 비교의 기본 단위로서 사용되어야 한다. 사용된 검정에 대해서는 그 타당성을 설명하여야 한다.

추측통계 : "유의성" 검정(추측통계학)은 결과해석에 있어서 보조수단으로 사용될 뿐이다. 결과의 해석은 생물학적 타당성에 근거하여야 한다. 단순히 "통계적 유의성"이 없기 때문에 대조군과의 차이를 생물학적으로 의의가 없다고 하는 것은 좋지 않다. 또한 "통계적 유의차"가 있기 때문에 생물학적으로 의의가 있다고 생각하는 것도 현명하지 않다. 특히 낮은 빈도로 일어나며 한 쪽으로만 치우쳐 분포하는 사건들(배자사망, 기형)에서는 시험의 통계적 검출력이 낮은 것을 유의하여야 한다. 사용하는 지표의 신뢰구간은 영향의 크기 등이 범위에 있는가를 나타내는 것이다. 통계방법을 사용하는 경우 비교하는 표본단위를 고려하여야 한다. 즉, 개개의 수태산물로서가 아니라 모체(한배새끼)를, 암․수 모두에 투여하였을 때에는 교미쌍을, 2 세대연구에서는 친세대의 교미쌍을 표본단위로 하는 것이 고려된다.

[주 29-1]

자료를 제시할 때에는 시험에 이용된 모든 동물의 시험자료를 설명할 수 있도록 명확하고 간결한 방법으로 각각의 수치를 표시하여 보고서를 작성한다. 시험 시작부터 끝까지 모든 동물개체의 이력을 추적할 수 있도록 총괄하여, 각 개체값 등이 군별 총괄치에 기여하고 있는 바를 쉽게 추정할 수 있게 하여야 한다. 군별 총괄치는 오류를 피하기 위하여 생물학적으로 모순이 없는 형식으로 또는 변수의 분포를 반영하는 형식으로 표시한다. 체중, 사료섭취량, 한배새끼 수 등 개체별 결과표는 간결하고, 가능한 계산된 수치보다는 절대적인 수치로 구성이 되어야 한다. 불필요한 중복은 피하여야 한다. 일반증상, 육안적 해부소견, 이상 등과 같은 출현빈도가 낮은 관찰항목들을 표로 만들려면 양성소견을 나타내는 (소수의) 개체를 한데 모아 기재하는 것이 바람직하다. 특히 형태적 변화(태자기형) 같은 자료를 표시하는 경우 일차 표를 만드는데 이상태자를 갖는 모동물과, 그 한배새끼 중에서 이상이 있는 태자를 명기하고, 이상태자에서 관찰된 모든 변화를 제시하여야 한다. 필요에 따라 위의 표에 근거하여 변화의 유형별로 표를 작성한다.

[주 29-2]

생식․발생독성에 사용되는 용어는 다음 각 호와 같다.

1. 생식․발생독성은 성숙동물의 생식능력에 미치는 영향 이외에 다음을 포함한다.

가. 발생독성 : 동물이 성숙될 때까지 유발된 장애. 즉 배자 또는 태자기에 유발 또는 발현된 장애 및 출생 후에 유발되거나 발현된 장애가 포함된다.

나. 배자독성, 태자독성, 배・태자독성 : 출생 전 노출의 결과로서 수태산물에 나타나는 장애로서 형태이상, 기능이상 및 그러한 영향이 출생 후에 발현되는 것이 포함된다. "배자독성" 또는 "태자독성"과 같은 용어는 장애가 검출되는 시기에 상관없이 유발된 시점/시기에 관계가 있다.

2. 일, 이, 삼세대 연구 : 시험물질에 직접 노출된 동물의 세대수에 의하여 정의된다. 예로서 일세대시험에서는 F0 세대의 직접 노출과 F1세대의 간접 노출(모체를 통한)이 있으며, 시험은 보통 F1세대의 이유기에 끝난다. 농약이나 공업용 화학물질에 대하여 이용되는 이세대시험에서는 F0세대의 직접노출, F1세대의 간접 및 직접 노출, F2세대의 간접적인 노출이 이루어진다. 삼세대시험도 같은 방법에 의해 정의된다.

3. 신체부하 : 물질의 투여에 의해 생기는 개체의 체내에서 약물의 노출량 즉, 원약물이나 대사물의 분포와 축적을 고려하는 것이 포함된다.

[주30]

여유동물군 : 독성시험계획에 포함되는 군으로 본시험동물과 동일한 조건으로 사육, 처치되나 주로 독성동태시험에 사용된다.

[주31]

배․태자 콤파트먼트로의 물질의 이행을 고려하는 것도 중요하나 실제로 태자의 노출은 별개의 시험에서 주로 평가되는 지표이며, 태반통과성으로서 표시하므로 유의하여야 한다.

[주32]

시험물질의 특성 및 시험의 실시목적 등을 고려하여 필요하다고 인정되는 경우에 대체하거나 추가적으로 실시할 수 있는 OECD 유전독성시험은 다음과 같다.

1. 포유동물 골수세포 염색체이상시험

2. 포유동물 세포를 이용한 체외 유전자 돌연변이시험

3. 초파리를 이용한 반성열성치사시험

4. 설치류를 이용한 우성치사시험

5. 포유동물세포를 이용한 체외 자매염색분체교환시험

6. Saccharomyces cerevisiae를 이용한 유전자 돌연변이시험

7. Saccharomyces cerevisiae를 이용한 유사분열 재조합시험

8. 포유동물세포를 이용한 체외 DNA 손상, 수복, 부정기 DNA 합성시험

9. 포유동물 정원세포의 염색체 이상 시험

10. 마우스 스포트 시험

11. 마우스를 이용한 유전성전좌시험

12. 포유동물 간세포를 이용한 체내 부정기 DNA 합성시험,

[주33]

1. 비독성 시험물질은 원칙적으로 5mg/plate 또는 5㎕/plate

2. 세포독성 시험물질은 복귀돌연변이체의 수 감소, 기본 성장균층의 무형성 또는 감소를 나타내는 세포독성 농도

3. 난용성 시험물질은 시험 조건하에서 육안으로 시험물질 침전이 관찰되고 계수를 방해하지 않는 농도

[주34]

S9은 랫드에 적절한 약물대사 효소계의 유도체를 투여한 후 간장으로부터 조제하며, 이 S9에 보효소 등을 넣은 S9 mix를 이용한다.

[주35]

대사활성계를 이용하는 경우, 양성대조 표준물질들은 사용되는 세균 균주의 종류에 기초해서 선택한다.

[주36]

1. 비독성 시험물질은 5㎕/ml, 5mg/ml 또는 10mM 상당의 농도

2. 세포독성 시험물질은 집약적 세포 단층의 정도, 세포 수 또는 유사분열 지표에서의 50% 이상의 감소를 나타내는 농도

3. 난용성 시험물질은 시험 조건하에서 육안으로 시험물질 침전이 관찰되고 계수를 방해하지 않는 농도

[주37]

직접법 및 대사활성화법의 경우 시험물질 처리 시간을 3～6시간으로 하고 다시 정상배지에서 배양하여 시험물질 처리 후 1.5 정상세포주기 경과시기에 제작한다.

[주38]

구조이상에 대하여는 염색분체 및 염색체에 나타나는 구조이상의 종류를 명기한다.

[주39]

1. 비독성 시험물질은 5mg/ml 또는 10mM 상당의 농도

2. 세포독성 시험물질의 최고농도는 용량설정시험 결과로부터 80%이상의 세포독성을 나타내는 농도

3. 난용성 시험물질은 시험 조건하에서 육안으로 시험물질 침전이 관찰되고 계수를 방해하지 않는 농도

[주40]

1. 더 높은 처리용량이 치사를 예상하게 하는 독성의 징후를 나타내는 용량

2. 골수 혹은 말초혈액에서 전체 적혈구 가운데 미성숙 적혈구의 비율 감소를 나타내는 용량

3. 호르몬과 유사분열인자 같이 낮은 비독성 용량에 특이적인 생물학적 활성을 지닌 물질은 처리용량 설정기준에서 제외하고, 사례별 근거로 평가

[주41]

경구투여는 보통 강제투여로 하고 다른 노출경로는 과학적으로 인정되는 경우 수용할 수 있다.

[주42]

대조군의 동물들은 처리군의 동물들과 동등한 방식으로 다루어져야 한다. 양성대조군은 노출량에서 기본값 이상으로 증가할 것으로 예상되는 생체내(in vivo) 소핵이 형성되어야 한다.

[주43]

표본은 시험물질 투여 후 특정의 시간(18-72시간)에 행하는 방법이 일반적이나 경시적으로 수회 행할 수 있다.

[주44]

해당 시험물질의 특성과 임상적용법 등에서 타당한 사유가 인정되면 본 시험의 생략이 가능하다. 고분자나 단백질이 결합한다고 생각되는 시험물질에 대하여는 시험물질의 중합성 및 단백결합 정도를 고려하여야 한다. 또한 유사시험물질에서 특별한 항원성 및 여기에 기인한다고 의심되는 부작용이 있는 경우 교차 항원성의 가능성을 고려하여야 한다.

[주45]

원칙적으로 본 시험 실시방법에 따라서 시험을 실시하여야 하나 세부사항에 있어서 시험의 본질에 영향을 주지 않는 한도 내에서 조정이 가능하며, 동일한 목적의 다른 시험법이 실시 가능한 경우에는 다른 시험법의 적용도 가능하다.

[주46]

감작하는 시험물질의 양은 원칙적으로 최대 임상용량 이상을 저용량으로 하고 고용량은 저용량의 수배 량을 투여하며, 필요시 적당한 다른 용량의 추가도 무방하다.

[주47]

가. 시험물질의 분자량에 따라 일반 의약품과 고분자 물질로 분류하여 시험을 실시한다. 일반 의약품의 경우 약물 단독 및 혈청알부민과 같은 거대분자와 결합된 형태로 시험을 실시하며, 고분자 물질은 그 자체로 시험을 실시한다.

나. 대조물질로는 원칙적으로 생리식염수를 사용하며, 양성대조물질은 시험물질이 일반 의약품인 경우 aminoantipyrine 혹은 penicillin 등과 같은 저분자 물질을 사용하거나 이종단백을 사용하고, 고분자 물질의 경우는 이종단백을 사용한다.

다. 면역보조제로는 주로 Freund's Complete Adjuvant(FCA)를 사용하나, 경우에 따라서 alum 등 다른 면역 보조제를 사용할 수도 있다.

[주48]

용매는 원칙적으로 생리식염수를 사용하며 시험물질이 비수용성인 경우 여러가지 용해보조제를 사용하여 가능한 한 고농도의 수용액의 형태로 투여한다.

[주49]

아나필락시스 쇼크 반응시험 판정기준

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1. 불안(Restlessness)

2. 기모(Piloerection)

3. 진전(Tremor)

4. 코를 문지르거나 핥음(Rubbing or licking nose)

5. 재채기(Sneezing)

6. 기침(Coughing)

7. 과호흡(Hyperpnea)

8. 배뇨(Urination)

9. 배변(Evacuation)

10. 유루(Lacrimation)

11. 호흡곤란(Dyspnea)

12. 찍찍거리는 소리(Rhonchus)

13. 청색증(Cyanosis)

14. 보행불안(Staggering gait)

15. 도약(Jumping)

16. 헐떡거리고 몸부림침(Gasping and writhing)

17. 경련(Convulsion)

18. 횡와(Side position)

19. Cheyne-Stokes 호흡(Cheyne-Stokes respiration)

20. 사망(Death)

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[-] Asymptomatic : 무증상

[±] Mild : 1-4의 증상

[+] Moderate : 1-10의 증상

[++] Severe : 1-19의 증상

[+++] Death : 사망

[주50]

본 시험법은 시험물질의 피부 감작성 여부를 시험하는 방법 중 가장 널리 사용되고 있는 maximization 시험법으로써 이 외에도 아래 열거된 시험법에 의한 실시가 가능하며 이 경우 각각의 판정기준에 따라 평가한다.

가. Adjuvant and Patch 시험법

나. Buehler 시험법

다. Draize 시험법

라. Freund's Complete Adjuvant 시험법

마. Open Epicutaneous 시험법

바. Optimization 시험법

사. Split Adjuvant 시험법

[주51]

시험물질이 수용성일 경우 수용액으로 만든 후 FCA와 유화시키며 시험물질이 불용성이거나 지용성일 경우 먼저 FCA에 현탁시킨 후 적정절한 용매와 유화시킨다.  양성대조군에는 기지의 감작성 물질을 투여한다. 1차 감작시 시험물질의 농도는 부분적 괴사나 전신독성을 나타내지 않는 농도이어야 한다. 일반적으로 피내주사에는 0.1ml의 용량이 사용된다.

[주52]

피부자극시험을 통해 2차 감작 및 야기시의 시험물질 농도를 결정하되 2차 감작시에는 가벼운 염증을 유발하는 농도, 야기시에는 무자극 최대농도를 사용한다. 시험물질이 무자극성일 경우, 시험물질의 침투를 용이하게 하기 위해 2차 감작 24시간 전 바세린을 이용하여 만든 10% 라우릴 황산나트륨을 도포한다.

일반적으로 2차 감작시 0.2ml 또는 0.2g의 용량이 사용되고 야기시 0.1ml 또는 0.1g의 용량이 사용된다.

[주53]

피부반응 평가기준

점 수	증 상
0 1 2 3	무반응 홍반이 적용부위에 흩어져 나타남 홍반이 적용부위 전체에 나타남 전체적으로 강한 홍반 및 부종이 나타남

[주54]

피부감작성 평가기준

감작율(%)	등 급	분 류
0-8 9-28 29-64 65-80 81-100	Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅳ	매우약함 약 함 보 통 강 함 매우강함

[주55]

이 경우 일반 독성시험 자료에 원칙적으로 혈액검사자료 및 면역장기의 무게를 포함한 병리조직학적 자료가 포함되어야 한다.

[주56]

각 시험항목은 원칙적으로 생체내(in vivo)시험으로 수행하여야 하고, 동일한 목적의 다른 시험법이 실시 가능한 경우에는 다른 시험법의 적용도 가능하며, 해당 의약품의 특성과 임상적용법 등에서 타당한 사유가 인정되면 본 시험의 생략이 가능하다.

[주57]

발암성시험에서의 최고용량은 이 기준에서 사용하고 있는 최대내성용량 외에도 ICH 기준에서 제시하고 있는 다음과 같은 방법을 근거로 설정할 수 있다 ; 1) 약물동태학적 지표 : 설치류에서 시험물질 또는 대사체의 AUC가 사람혈장 중 AUC의 25배가 되는 용량, 2) 약동력학적 작용 : 선택한 용량 이상에서 나타날 수 있는 약동력학적 반응과 동일한 반응이 나타나고, 시험의 신뢰성을 방해하는 생리적 또는 항상성의 장애를 일으키지 않는 용량, 3) 흡수가 포화되는 양 : 전신이용률시험에서 측정된 흡수의 포화량, 4) 투여가능 최대량, 5) 기타 지표 : ICH 기준에서 특별히 정의하지 않은 기타 지표.

[주58]

1종의 중단기 생체내 설치류 시험, 장기 발암성 시험 혹은 유전독성시험의 소견이나 그 밖의 시험 성적을 통해 그 의약품이 명확히 사람에게 발암성을 갖는 것이 나타났을 경우에는 제2의 발암성 시험은 반드시 요구되지는 않는다.

[주59]

1. 일반적으로 이 시험은 사람에게 외삽되고 사람에 대한 위해도 평가에 응용할 수 있다고 생각되는 발암기전을 근거로 해야 한다. 이것은 장기발암성시험을 보완하면서 발암성시험에서 얻을 수 없는 새로운 정보를 가져오는 것이어야 한다.

또 동물 수, 동물 애호나 발암성시험에서의 전체적인 경제성에 대해서도 고려되어야 한다. 이 기준을 만족하는 대표적인 시험방법은 다음과 같다.

가. 설치류를 사용한 개시-촉진 모델 : 간 발암성 물질을 검색하기 위한 랫드의 개시-촉진 모델은 initiator를 투여 후 시험물질을 수 주간 투여한다. 또한 다장기 발암모델은 최대 5종류의 initiator를 투여하고 다음으로 시험물질을 수 개월간 투여한다.

나. p53+/- 결손 모델, Tg․AC 모델, TgHras2 모델,  XPA결손 모델 등 형질전환 마우스 시험

다. 신생아 설치류 발암 모델

2. 중간기 생체내 설치류 시험계의 선택 상 고려해야 할 점

시험계는 발암성에 관한 종합평가에 유용한 정보를 얻을 수 있도록 그 시험에서 이용되는 시험물질에 대한 약력학이나 사람과의 노출 차이 등의 정보 혹은 그 밖의 관련 정보 등 과학적 근거의 중요성을 고려하여 선택하여야 한다. 시험법의 선택 이유는 기록으로 남겨야 하며, 선택된 시험법의 장단점에 대한 과학적인 고찰도 포함해야 한다.

[주60]

(국소내성시험 예시)

1. 시험동물 : 토끼

2. 대조군 : 양성대조군, 음성대조군

3. 투여방법

가. 우측 귀정맥 : 시험물질 또는 양성대조군

나. 좌측 귀정맥 : 음성대조군

4. 투여기간 : 8일간 1일 2회

5. 측정항목

가. 육안소견

나. 조직병리소견