식품의약품안전청 고시 제2010 - 호

「약사법」 제51조제1항에 의한 「대한약전」(식품의약품안전청고시 제20  -  호, 20  .  .  .)을 다음과 같이 개정고시합니다.

2010년 월 일

식품의약품안전청장

대한약전 일부개정고시(안)

대한약전 일부를 다음과 같이 개정한다.

일반시험법 제9호 무균시험법을 별지 1과 같이 한다.

일반시험법 제10호 미생물한도시험법을 별지 1과 같이 한다.

[별지 1]

9. 무균시험법

이 시험법은 무균이 요구되는 원료 또는 제제에 적용한다. 이 시험에 적합하다는 결과는 단지 이 시험조건에서 시험한 검체 중에 오염미생물이 검출되지 않았음을 의미한다.

미생물오염에 대한 예방조치  무균시험은 무균조건에서 시험한다. 따라서 시험환경은 무균시험을 실시하는데 적합하여야 한다. 오염을 피하기 위한 예방조치는 이 시험으로 검출되는 어떠한 미생물에도 영향을 주어서는 안된다. 시험하는 작업영역은 적절한 샘플링과 적절한 관리로 정기적으로 모니터링 한다.

배지와 배양온도

1) 일반요건

배지는 다음과 같이 조제하거나 배지성능시험에 적합한 경우에는 동등한 시판배지도 쓸 수 있다. 무균시험용으로 적합한 배지는 다음과 같다. 액상티오글리콜산배지는 혐기성균의 배양을 주목적으로 하지만 호기성균도 검출할 수 있다. 대두카제인소화배지는 진균 및 호기성균의 배양에 적합하다.

2) 액상티오글리콜산배지

L-시스틴	0.5   g

한천	0.75  g

염화나트륨	2.5   g

포도당	5.0   g

또는 포도당 일수화물	5.5   g

효모엑스 (수용성)	5.0   g

카제인제 펩톤	15.0   g

티오글리콜산나트륨	0.5   g

또는 티오글리콜산	0.3   mL

레자주린용액(1→1000), 쓸 때 조제	1.0   mL

물	1000 mL

(멸균 후의 pH 7.1 ± 0.2)

L-시스틴, 한천, 염화나트륨, 포도당, 효모엑스 및 카제인제 펩톤을 물과 혼합하고, 가열하여 녹인 다음 티오글리콜산나트륨 또는 티오글리콜산을 넣어 녹이고 필요하면 수산화나트륨시액을 넣어 멸균후의 pH가 7.1 ± 0.2가 되도록 조정한다. 필요하면 용액이 끓지 않도록 주의하면서 다시 가열하여 더울 때에 적신 여과지를 써서 여과한다. 레자주린용액(1→1000)을 넣어 잘 섞은 다음 배양이 끝났을 때 배지의 엷은 적색부분이 위로부터 1/2 이하로 되는 표면적과 깊이의 비를 가지는 용기에 필요한 양 씩 나누어 넣고 밸리데이션된 조건에서 멸균한다. 배지를 보존할 필요가 있을 때에는 미리 기밀용기에 넣어서 멸균하여 2 ∼ 25 ℃에서 보존한다. 배지의 윗부분이 1/3 이상 엷은 적색으로 변한 경우는 엷은 적색이 소실할 때까지 배지용기를 수욕 또는 유통증기 중에서 가열하고 용기 중에 비멸균공기가 침입하지 못하도록 주의하면서 급속하게 냉각시켜 1 회에 한하여 사용할 수 있다. 밸리데이션된 기간이 지난 배지를 사용해서는 안된다.

액상티오글리콜산배지는 30 ∼ 35 ℃에서 배양한다. 멤브레인필터법을 적용할 수 없는 수은계의 보존제를 함유하는 제품은 배지성능시험에 적합하면 대두카제인소화배지 대신에 액상티오글리콜산배지를 써서 20 ∼ 25 ℃에서 배양할 수 있다. 따로 규정된 경우에는 다음과 같이 조제한 변형티오글리콜산배지도 쓸 수 있다. 한천과 레자주린용액(1 → 1000)을 제외하고 액상티오글리콜산배지와 같은 조성으로 만들어, 밸리데이션된 조건에서 멸균한다. 멸균후의 pH가 7.1 ± 0.2가 되도록 조정하고, 사용직전에 수욕에서 가열한다. 변형티오글리콜산배지는 혐기조건에서 30 ∼ 35 ℃로 배양한다.

3) 대두카제인소화배지

카제인제 펩톤	17.0  g

대두제 펩톤	3.0  g

염화나트륨	5.0  g

인산수소이칼륨	2.5  g

포도당	2.3  g

또는 포도당일수화물	2.5  g

물                                 1000 mL

(멸균후의 pH 7.3 ± 0.2)

모든 성분을 물에 녹이고 약간 가온하여 용액으로 한다. 용액을 실온으로 식히고 필요하면 수산화나트륨시액을 넣어 멸균후의 pH가 7.3 ± 0.2가 되도록 조정한다. 필요하면 여과하여 적당한 용기에 필요한 양씩 나누어 넣고 밸리데이션된 조건으로 멸균한다. 바로 쓰지 않을 경우에는 미리 기밀용기에 넣어 멸균하고, 2 ∼ 25 ℃에서 보존한다. 밸리데이션된 기간이 지난 배지를 사용해서는 안 된다. 대두카제인소화배지는 20 ∼ 25 ℃에서 배양한다.

배지의 적합성

배지는 다음의 시험에 적합하다. 이 시험은 검체의 무균시험 실시 전에 또는 병행하여 시험할 수 있다.

1) 배지의 무균성  배지의 일부를 14 일간 배양할 때 미생물의 증식이 나타나지 않는다.

2) 호기성균, 혐기성균 및 진균에 대한 배지성능시험  시판 액체배지 및 분말배지 또는 각 성분으로 조제한 배지의 각 배치에 대하여 시험한다. 적절한 미생물주는 표 1과 같다.

액상티오글리콜산배지에는 다음 미생물을 소량 (100 CFU 이하) 접종한다. 각 미생물에 대하여 별도의 배지용기를 쓴다.

: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

대두카제인소화배지에는 다음 미생물을 소량 (100 CFU 이하) 접종한다. 각 미생물에 대하여 별도의 배지용기를 쓴다.

: Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis, Candiida albicans

세균은 3일을 넘지 않도록 진균은 5일을 넘지 않도록 배양한다.

접종균의 계대수는 시드로트 배양관리방법 (seed lot system)을 채택하여 마스터시드로트 (master seed lot)로부터 5 대를 넘지 않도록 한다. 미생물의 증식이 육안으로 명백하게 관찰될 때 그 배지는 적합하다.

표 1  배지성능시험 및 측정법의 적합성시험에 적절한 시험용 균주

호기성세균
Staphylococcus aureus	ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276, KCTC 3881
Bacillus subtilis	ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134, KCTC 1021
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275, KCTC 2513
혐기성세균
Clostridium sporogenes	ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 또는 ATCC 11437, NBRC 14293
진균
Candiida albicans	ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594, KCTC 7965
Aspergillus brasiliensis	ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455, KCTC 6317 또는 6196

측정법의 적합성시험  다음에 서술하는 변경내용 이외에는 「제품의 무균시험｣에 제시한 방법과 엄밀하게 같은 방법으로 시험한다.

1) 멤브레인필터법  시험할 용기의 내용물을 여과한 다음, 최종회의 세정액에 시험용 균주 100 CFU 이하를 넣고 여과한다.

2) 직접법  시험할 용기의 내용물을 배지에 넣은 다음 시험용 균주 100 CFU 이하를 그 배지에 접종한다. 어느 접종방법에서든 배지의 적합성 2) 호기성균, 혐기성균 및 진균에 대한 배지성능시험 항에 제시된 균주를 쓴다. 양성대조로서 배지성능시험을 한다. 배지를 함유한 모든 용기는 규정온도에서 최장 5 일간 배양한다. 배양 후 양성대조와 동등하고 육안으로 명확한 증식이 있으면 검체는 이 시험조건에서 항균활성이 없거나 항균활성이 충분히 제거된 것으로 본다. 이 측정법은 무균시험으로 적합하며 시험조건을 변경할 필요가 없다.

만일 검체 존재 하에 양성대조와 동등하고 육안으로 명확한 증식이 없으면, 검체는 이 시험조건에서 항균활성이 충분히 제거되지 않은 것이다. 이 때는 항균활성을 제거하기 위하여 조건을 변경하고 측정법의 적합성시험을 반복한다.

측정법의 적합성시험은 다음의 경우에 수행한다.

1) 새로운 검체에 대하여 무균시험을 하는 경우

2) 시험조건의 변경이 있는 경우

측정법의 적합성시험은「검체의 무균시험」과 동시에 시험할 수도 있다.

검체의 무균시험

1) 일반요건  멤브레인필터법 또는 직접법으로 시험한다. 시험에는 적당한 음성대조를 쓴다. 멤브레인필터법은 여과 가능한 제품에 적용한다. 예를 들면 여과 가능한 수성, 알코올성 또는 유성의 제품 및 이 시험 조건에서 항균력이 없는 수성 또는 유성의 용제에 혼화 또는 용해하는 제품에 대해서 적용한다.

2) 멤브레인필터법  멤브레인필터는 미생물의 포집효율이 확립되어 있는 공경 0.45 μm 이하의 것을 쓴다. 예를 들면 셀룰로오스질산염 필터는 수용성, 유성, 저농도의 알코올성 용액에, 셀룰로오스아세테이트 필터는 고농도의 알코올성 용액에 쓴다. 항생물질과 같은 의약품에는 따로 적절한 필터가 필요한 경우도 있다.

다음에 제시한 방법은 지름 50 mm의 멤브레인필터를 사용한다고 가정한 방법이다. 만약 지름이 다른 필터를 쓰면 희석 및 세정액의 용량은 이에 따라 조정한다. 여과기나 멤브레인필터는 적절한 방법으로 멸균한다. 여과장치는 무균조건에서 검액을 도입하여 여과할 수 있으며, 멤브레인필터를 무균적으로 취하여 배지에 이식할 수 있고, 여과기 자체에 배지를 넣어서 배양하기에 적합하도록 설계되어야 한다.

가) 수성액제  1 g/L의 육제 또는 카제인제 펩톤용액 (pH 7.1 ± 0.2)과 같은 무균 희석액의 소량을 여과기 중의 멤브레인필터 위로 옮기고 여과한다. 예를 들면 항생물질이 시험대상일 때에는 희석액에 적당한 중화제나 불활화제를 넣을 수 있다.

필요하면 시험할 용기의 내용물을 측정법의 적합성시험에서 선택한 무균 희석액으로 희석한 다음, 표 2에 제시된 검체의 양 이상을 1 장 또는 복수의 멤브레인필터 위에 넣어 즉시 여과한다. 검체가 항균활성을 가지고 있을 때에는 측정법의 적합성시험에서 사용한 무균 희석액의 양으로 멤브레인필터를 3 회 이상 세정한다. 측정법의 적합성시험에 있어서 항균활성을 충분히 제거되지 않은 것이 증명되어도, 멤브레인필터당 100 mL의 세정액으로 5 회 이상 세정하지 않는다. 멤브레인필터를 여과기로부터 꺼내어 반으로 절단하거나 미리 검액을 이등분하여, 각각에 대하여 동일한 여과조작을 하여 얻은 2 장의 멤브레인필터를 각각 배지에 넣는다. 각 배지의 양은 측정법의 적합성시험으로 확립된 양을 쓴다. 또는 멤브레인필터를 장착한 여과기 내에 검액을 이등분해 여과한 다음 각각에 배지를 넣는다. 배지를 14 일 이상 배양한다.

용기의 내용량	따로 규정이 없는 한 각각의 배지에 접종하는 최소량
액제
1 mL 미만 1 mL 이상 40 mL 이하 40 mL 초과 100 mL 이하 100 mL 초과 항생물질의 액제	전량 반량, 단, 1 mL 이상 20 mL 10 %, 단, 20 mL이상 1 mL
현탁 또는 유화시켜 쓰는 비수용성 의약품, 크림 또는 연고제	200 mg 이상
고형제
50 mg 미만 50mg 이상 300mg 미만 300 mg 이상 5 g 이하 5 g 초과	전량 반량, 단, 50 mg 이상 150 mg 500 mg

표 2  각 배지 당 최소 검체 채취량

나) 수용성 고형제  각 배지에 대하여 표 2에 규정된 양 이상을 쓴다. 첨부한 용제, 주사용수, 생리식염액 또는 1 g/L 육제 또는 카제인제 펩톤중성용액과 같은 적당한 용제에 녹이고, 선택한 용제에 적합한 멤브레인필터를 써서 가) 수성액제 항에 따라 시험한다.

다) 기름 및 유성액제  각 배지에 대하여 표 2에 규정된 양 이상을 쓴다. 점도가 낮은 기름 및 유성액제는 희석시키지 않고 마른 멤브레인필터로 여과한다. 점조성 기름은 해당 시험조건에서 항균성이 없는 것이 증명된 미리스틴산이소프로필과 같은 적절한 무균용제로 희석할 수 있다. 기름이 자체 무게로 멤브레인필터에 스며들게 한 다음 서서히 가압 또는 흡인하여 여과한다. 측정법의 적합성시험으로 적절하다고 증명된 농도의 적절한 유화제 (예를 들면 10 g/L 폴리소르베이트 80)를 함유하는 1 g/L 육제 또는 카제인제 펩톤중성용액과 같은 적당한 무균용액을 써서 멤브레인필터 당 약 100 mL씩 적어도 3 회 세정한다. 가) 수성액제 항에 기재된 것과 같이 멤브레인필터를 배지에 넣거나 여과기에 배지를 넣어 같은 온도에서 같은 기간 배양한다.

라) 연고제 및 크림  각 배지에 대하여 표 2에 규정한 양 이상을 쓴다. 지방기제의 연고제나 유중수형의 유제는 위에 서술한 바와 같이 미리스틴산이소프로필로 1 %로 희석한다. 필요하면 40 ℃ 이하로 가온한다. 예외적으로 44 ℃ 이하까지의 가온이 필요한 것도 있다. 가능한 신속히 여과한 다음 다) 기름 및 유성액제 항에 따라 조작한다.

3) 직접법  따로 규정이 없는 한 표 2에 규정된 양의 검체를 그 용량이 배지용량의 10 %를 넘지 않도록 배지에 직접 접종한다. 검체가 항균활성이 있을 때에는 적당한 중화제로 중화시키거나 충분한 양의 배지로 희석하여 시험한다. 대용량의 검체를 사용할 필요가 있을 때에는 접종에 의한 희석영향을 고려하여 고농도의 배지를 쓰는 것이 바람직한 경우도 있다. 적절하다면 고농도 배지를 용기내의 검체에 직접 넣는 것도 가능하다.

가) 유성액제  측정법의 적합성시험에서 적합하다는 것이 증명된 적당한 유화제를 적절한 농도 (예를 들면 10 g/L 폴리소르베이트 80)로 넣은 배지를 쓴다.

나) 연고제와 크림  1 g/L 육제 또는 카제인제 펩톤중성용액과 같은 적당한 무균희석용액에 선택한 유화제를 넣고 유화하여 약 1 : 10으로 희석한 다음 유화제를 함유하지 않은 배지에 이식한다. 접종된 배지는 14일 이상 배양한다. 배양기간 중에 배양 상태를 수 회 관찰한다. 유성검체를 함유한 배양물을 매일 조용히 흔든다. 그러나 혐기성균 검출을 위하여 액상티오글리콜산배지를 쓸 때에는 혐기조건을 유지하기 위하여 흔들어 섞는 것을 최소한으로 한다.

관찰과 결과의 판정  배양기간 중 및 최종일에 배지에서의 미생물의 증식유무를 육안으로 조사한다. 검체가 배지를 혼탁시켜 미생물증식의 유무를 육안으로 쉽게 판정할 수 없을 때에는 배양 시작일로부터 14 일 후에 해당 배지의 일부 (1 mL 이상)를 같은 배지의 새로운 용기에 이식하고, 본래의 배지와 이식시킨 배지를 4 일 이상 배양한다.

미생물의 증식이 관찰되지 않을 때 검체는 무균시험에 적합하다. 미생물의 증식이 관찰될 때에는 해당 검체와 관계없는 원인에 의하여 시험이 무효함을 명확하게 증명할 수 없는 한 검체는 무균시험에 적합하지 않다. 아래 조건 중 1 개 이상 해당될 경우 이 시험은 무효로 한다.

a) 무균시험시설의 미생물학적 모니터링 데이터에 문제가 나타난 경우

b) 무균시험 중에 쓴 시험방법을 조사한 결과 문제가 나타난 경우

c) 음성대조 중에 미생물의 증식이 나타난 경우

d) 해당 무균시험으로부터 분리된 미생물을 동정한 다음 그 균종의 증식이 무균시험 실시 중에 쓴 재료 및 용기 모두, 또는 어느 한 쪽에 문제가 있음이 명확히 판단되는 경우

시험이 무효인 것이 판명되면 최초 시험과 같은 수의 용기를 써서 재시험을 행한다. 재시험에서 미생물의 증식이 관찰되지 않을 때 검체는 무균시험에 적합하다. 재시험에서 미생물의 증식이 관찰될 경우에는 검체는 무균시험에 적합하지 않다.

무균시험 적합이 요구되는 주사제, 안연고제, 점안제 및 다른 비주사제에 대한 시험 적용  멤브레인필터법을 쓸 때에는 가능하면 용기내의 전량을 쓴다. 단, 표 2에 표시한 양 이상을 쓴다. 필요하면 1 g/L 육제 또는 카제인제 펩톤 중성용액과 같은 적당한 무균용액으로 약 100 mL로 희석한다.

직접법을 쓸 때에는 따로 규정이 없는 한 표 2에 제시한 양을 쓴다. 시험제품의 동일한 검체에 대하여 세균 및 진균에 대한 무균시험을 한다. 1 용기 중의 내용량이 두 시험을 하는데 불충분한 경우는 2 용기 이상의 내용물을 다른 배지에 접종하는데 쓴다.

시험에 필요한 최소 검체수  시험에 필요한 최소 검체수는 로트 크기에 따라 표 3에 표시한 개수를 쓴다.

표 3  시험에 필요한 최소 검체수

로트당 제조 개수*	따로 규정이 없는 한, 각 배지당 최소 검체수**
주사제
100 개 이하 101 개 이상 500 개 이하 501 개 이상	10 % 또는 4 용기 중 많은 쪽 10 용기 2 % 또는 20 용기 (대용량제제의 경우는 10 용기)중 작은 쪽
안연고제 및 점안제 등의 비주사제
200 개 이하 201 개 이상	5 % 또는 2 용기 중 많은 쪽 10 용기
1회용 제품의 경우에는 주사제에 준한 개수를 채취한다.
고형 벌크제품
4 용기 이하 5 용기 이상 50 용기 이하 51 용기 이상	각 벌크용기 20 % 또는 4 용기 중 많은 쪽 2 % 또는 10 용기 중 많은 쪽
* 로트 크기를 알 수 없는 경우에는 여기에 제시한 최대수를 사용한다. ** 한 용기의 내용량이 두 배지에 접종하는데 충분한 양이면 여기에 제시한 용기 수로 한다.

10. 미생물한도시험법

미생물한도시험법은 생균수시험 및 특정미생물시험을 포함한다. 원료 또는 제제에서 임의로 선택한 다른 수 개소 (또는 부분)에서 채취한 것을 잘 섞어 검체로 하여 시험한다. 검체를 액체배지로 희석할 때는 신속하게 시험한다. 또한 이 시험을 할 때에는 생물학적 위해가 일어나지 않도록 충분히 조심한다.

비무균제품의 미생물학적시험 : 생균수시험

1) 서문  이 시험은 호기조건에서 증식할 수 있는 중온성 (中溫性)의 세균 및 진균을 정량적으로 측정하는 방법이다. 이 시험은 원료 또는 제제가 규정된 미생물학적 품질규격에 적합한지 여부를 판정하는 것을 주 목적으로 한다. 채취검체수를 포함하여 지시된 시험방법에 따라 시험하여 결과를 판정한다. 생균을 유효성분으로 함유하는 제품에는 이 시험을 적용하지 않는다. 약전시험법과 동등성이 인정되는 경우에는 자동화법을 포함한 다른 미생물학적방법을 적용할 수 있다.

2) 기본조작  생균수 측정은 검체가 외부로부터의 미생물 오염을 방지할 수 있도록 설계된 조건에서 시험한다. 오염을 방지하기 위한 예방조치는 시험에서 검출하고자하는 어떤 미생물에 대해서도 영향을 주어서는 안 된다. 검체가 항균활성을 가지고 있을 때는 항균활성을 가능한 한 제거 또는 중화한다. 이를 위하여 불활성화제를 쓸 때는 그 불활성화제가 유효성이 있으며, 미생물에 대한 독성이 없음을 확인한다. 검체의 조제에 계면활성제를 쓸 때는 미생물에 대한 독성이 없으며 또한 사용하는 불활성화제와 상호작용이 없음을 확인한다.

3) 생균수측정법  보통 멤브레인필터법 또는 한천평판법을 쓴다. 최확수 (Most Probable Number ; MPN)법은 대체로 정밀도가 낮은 균수 측정법이기는 하나 오염균수가 아주 적은 검체에 대해서는 최적의 방법이 될 수도 있다. 측정법의 선택은 검체의 특성과 규정된 미생물한도값 등에 근거하며, 선택한 측정법은 규격에 적합한지 여부를 판단하기에 충분한 양의 검체를 시험할 수 있어야 하고 적합성이 확인되어야 한다.

4) 배지성능, 측정법의 적합성 및 음성대조  가) 일반요건  검체 존재 하의 미생물 검출능력을 확인한다. 그리고 시험결과에 영향을 주는 시험법의 변경이나 검체의 처방변경이 있는 경우에는 다시 적합성을 확인한다.

나) 시험균의 조제  시험균은 표준화된 안정한 현탁액을 사용하거나 다음과 같은 방법으로 조제한다. 시험에 쓰는 미생물은 최초의 마스터시드로트 (master seed lot)로부터 계대수 5 회를 넘지 않도록 시드로트 배양관리수법 (seed lot system)으로 관리한다. 세균 및 진균의 각 시험균에 대하여 표 I-1에 기재한 조건으로 각각 따로 배양한다.

표 I-1 시험균의 조제와 사용법

미생물	시험균의 조제	배지성능		제품존재 하에서의 생균수 측정법의 적합성
		총 호기성 미생물수	총 진균수	총 호기성 미생물수	총 진균수
Staphylococus aureus 예를 들면, ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP4.83, NBRC 13276또는 KCTC 3881	대두카제인소화한천배지 또는 대두카제인소화액체배지 30 ～ 35 ℃ 18 ～ 24 시간	대두카제인소화한천배지 또는 대두카제인소화액체배지 ≦100 CFU 30 ～ 35 ℃ ≦ 3일간		대두카제인소화한천배지 / MPN대두카제인소화액체배지 ≦100 CFU 30 ～ 35 ℃ ≦ 3일간
Pseudomonas aeruginosa 예를 들면, ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275, 또는 KCTC 2513	대두카제인소화한천배지 또는 대두카제인소화액체배지 30 ～ 35 ℃ 18 ～ 24 시간	대두카제인소화한천배지 또는 대두카제인소화액체배지 ≦100 CFU 30 ～ 35 ℃ ≦ 3일간		대두카제인소화한천배지 / MPN대두카제인소화액체배지 ≦100 CFU 30 ～ 35 ℃ ≦ 3일간
Bacillus subsilis 예를 들면, ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62, NBRC 3134 또는 KCTC 1021	대두카제인소화한천배지 또는 대두카제인소화액체배지 30 ～ 35 ℃ 18 ～ 24 시간	대두카제인소화한천배지 또는 대두카제인소화액체배지 ≦100 CFU 30 ～ 35 ℃ ≦ 3일간		대두카제인소화한천배지 / MPN대두카제인소화액체배지 ≦100 CFU 30 ～ 35 ℃ ≦ 3일간
Candida albicans 예를 들면, ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, NBRC 1594 또는 KCTC 7965	사부로포도당한천배지 또는 사부로포도당액체배지 20 ～ 25 ℃ 2 ～ 3 일간	대두카제인소화한천배지 ≦100 CFU 30 ～ 35 ℃ ≦ 5일간	사부로포도당한천배지 ≦100 CFU 20 ～ 25 ℃ ≦ 5일간	대두카제인소화한천배지 ≦100 CFU 30 ～ 35 ℃ ≦ 5일간 MPN : 적용하지 않는다.	사부로포도당한천배지 ≦100 CFU 20 ～ 25 ℃ ≦ 5일간
Aspergillus brasiliensis 예를 들면, ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83, NBRC 9455, KCTC 6317 또는 KCTC 6196	사부로포도당한천배지 또는 감자덱스트로오스한천배지 20 ～ 25 ℃ 5 ∼ 7 일간 또는 양호한 포자형성이 인정될 때 까지	대두카제인소화한천배지 ≦100 CFU 30 ～ 35 ℃ ≦ 5일간	사부로포도당한천배지 ≦100 CFU 20 ～ 25 ℃ ≦ 5일간	대두카제인소화한천배지 ≦100 CFU 30 ～ 35 ℃ ≦ 5일간 MPN : 적용하지 않는다.	사부로포도당한천배지 ≦100 CFU 20 ～ 25 ℃ ≦ 5일간

시험균 현탁액의 조제는 pH 7.0 펩톤염화나트륨완충액 또는 pH 7.2 인산완충액을 쓴다. Asperigillus brasiliensis의 포자를 현탁할 때는 완충액에 폴리소르베이트 80을 0.05 % 넣어도 된다. 현탁액은 2 시간 이내에 쓰며 2 ～ 8 ℃로 보존하는 경우에는 24시간 이내에 쓴다. Asperigillus brasiliensis 또는 Baccilus subtilis의 영양형세포의 신선한 현탁액을 조제하여 희석하는 것을 대신 포자현탁액 또는 아포현탁액을 조제하여 접종균액으로 쓸 수 있다. 각 현탁액은 보증된 기간 내에서는 2 ～ 8 ℃로 보존할 수 있다.

다) 음성대조  시험조건을 확인하기 위하여 검액 대신 사용한 희석액을 써서 음성대조시험을 한다. 미생물이 증식해서는 안 된다. 음성대조는 5)항에 따른 검체시험 시에도 측정한다. 시험에 실패한 음성대조는 고찰한다.

라) 배지성능  시판배지는 배치마다 시험한다. 건조분말배지 또는 기술한 각 성분을 써서 조제한 배지는 조제한 배치마다 시험한다. 표 I-1에 기재한 미생물의 소량 (100 CFU 이하)을 대두카제인소화액체배지의 일부, 대두카제인소화한천배지 및 사부로포도당한천배지의 평판에 접종한다. 균주마다 별개로 액체배지 또는 평판을 써서 표 I-1에 기재한 조건으로 각각 배양한다. 한천배지에서는 접종균의 출현집락수가 표준화된 균액의 측정값의 2 배 이내 이어야 한다. 신선한 배양균을 써서 시험하는 경우에는 유효성이 확인된 배지 배치에서 이전에 얻은 증식과 동등한 증식이 인정되어야 한다. 액체배지에서도 유효성이 확인된 배지 배치로 미리 시험하여 얻은 증식과 동등한 증식이 인정되어야 한다.

마) 검체 존재 하의 측정법의 적합성

① 검액의 조제  검액의 조제법은 검체의 물리학적 특성에 의존한다. 아래에 기재한 어느 방법도 만족할 수 없을 때에는 따로 적절한 다른 방법을 확립한다.

ⅰ) 수용성제제  검체를 pH 7.0 펩톤염화나트륨완충액, pH 7.2 인산완충액 또는 대두카제인소화액체배지로 녹이거나 희석한다 (보통 10 배 희석액을 조제한다). 필요하면 pH 6 ～ 8로 조정한다. 희석이 더 필요할 때에는 같은 희석액으로 조제한다.

ⅱ) 물에 녹지 않는 비지질제제  검체를 pH 7.0 펩톤염화나트륨완충액, pH 7.2 인산완충액 또는 대두카제인소화액체배지에 현탁한다 (보통 10 배 희석액을 조제한다). 분산하기 쉽게 하기 위하여 예를 들면 폴리소르베이트 80(농도 : 1 g/L)과 같은 계면활성제를 넣을 수 있다. 필요하면 pH 6  ～ 8로 조정한다. 희석이 더 필요할 때에는 같은 희석액으로 조제한다.

ⅲ) 지질제제  검체를 여과멸균한 이소프로필미리스테이트에 녹이거나 필요하면 40 ℃ 이하 (예외적인 경우에는 45 ℃ 이하)에서 가온한 최소필요량의 멸균된 폴리소르베이트 80 또는 다른 저해성이 없는 계면활성제를 써서 혼합한다. 필요하면 수욕에서 그 온도를 유지하면서 주의깊게 섞는다. 선정한 희석액을 미리 가온하여 넣어 검체의 10 배 희석액을 조제한다. 유화에 필요한 가장 짧은 시간 동안 온도를 유지하면서 주의하여 섞는다. 적절한 농도의 멸균한 폴리소르베이트 80 또는 다른 저해성이 없는 계면활성제를 함유하는 같은 희석액으로 10 배 단계 희석계열을 조제해도 된다.

ⅳ) 에어로솔형의 액체 또는 고체  검체를 무균적으로 멤브레인필터장치에 넣거고 다시 검체를 채취하기 위하여 멸균용기로 옮긴다. 각 검체용기에서 전량을 쓰거나 정량분무한 일정량을 쓴다.

ⅴ) 경피흡수패취   경피흡수패취의 보호피복 (박리라이너)을 제거하고 점착면을 위로 향하게 하여 멸균유리 또는 멸균플라스틱트레이 (tray) 위에 놓는다. 패취끼리 부착하는 것을 막기 위하여 멸균한 다공성물질 (예를 들면 멸균거즈)로 점착면을 덮는다. 폴리소르베이트 80 및/또는 레시틴 등의 불활성화제를 함유하는 선정한 희석액 적당량에 패취를 넣고 적어도 30 분간 세게 흔들어 섞는다.

② 접종 및 희석  100 CFU 이하의 접종균을 얻는데 충분한 양의 시험균 현탁액을 ①항에 따라 조제한 검액 및 대조액 (검체 불포함)에 넣는다. 접종하는 시험균 현탁액의 양은 검액량의 1 %를 초과하지 않도록 한다. 제품에서 허용가능한 미생물 회수결과를 얻기 위하여 가장 낮은 희석배율의 검액을 가지고 시험한다. 항균활성 또는 낮은 용해도 때문에 가장 낮은 희석배율의 검액으로 시험할 수 없는 경우에는 다시 적절한 시험방법을 확립한다. 검체로 인한 증식저지를 피할 수 없는 경우에는 중화, 희석 또는 여과한 다음에 시험균 현탁액을 넣어도 된다.

③ 항균활성의 중화․제거  ② 및 ④항에 기재한 방법에 따라 시험하여 검액에서 회수한 균수와 대조액에서 회수한 균수를 비교한다. 증식이 저해되는 경우 (검액에서 회수한 균수가 대조액에서 회수한 균수의 1/2 미만인 경우)에는 결과의 유효성을 확보하기 위하여 생균수 측정법을 변경한다. 방법의 변경은 예를 들어 (1) 희석액 또는 배지의 증량, (2) 특이적 또는 일반적인 중화제를 희석액에 첨가, (3) 막여과 또는 (4) 위의 측정법의 조합 등이다.

중화제 항균제의 활성을 중화하기 위하여 중화제를 쓸 수 있다 (표 I-2). 중화제는 선정한 희석액 또는 배지에 멸균 전에 미리 첨가할 수 있다. 중화제를 쓴 경우에는 그 유효성과 미생물에 대한 독성이 없음을 증명하기 위해 검체를 함유하지 않고 중화제만을 넣어 공시험하여 확인한다.

표 I-2 저해물질에 대한 일반적인 중화제/중화법

저해물질	중화제/중화법
글루타르알데히드, 수은제	아황산수소나트륨
페놀류, 알코올류, 알데히드류, 소르빈산염	희석
알데히드류	글리신
4급 암모늄 화합물, 파라옥시벤조산류, 비스-비구아니드류	레시틴
4급 암모늄 화합물, 파라옥시벤조산류, 요오드	폴리소르베이트
수은제	티오글리콜산염
수은제, 할로겐류, 알데히드류	티오황산염
에틸렌디아민테트라아세트산염 (EDTA)	마그네슘 또는 칼슘이온

적절한 중화법을 확립할 수 없는 경우에는 그 검체가 가지는 살균활성 때문에 접종균을 분리할 수 없는 것으로 간주한다. 따라서 그 검체가 접종균과 같은 종의 균이나 근연종에 오염되었을 가능성은 낮은 것으로 생각한다. 그러나 그 검체가 이들 일부 미생물만을 저해할 뿐이고, 시험균주 이외의 균주는 저해하지 않을 가능성도 있으므로 미생물의 증식과 그 허용기준에 적합한 가장 낮은 농도로 시험한다.

④ 검체에서의 미생물 회수  표 I-1 에 기재된 미생물마다 따로 시험한다. 첨가한 미생물만을 대상으로 측정한다.

i) 멤브레인필터법  공경 0.45 μm 이하의 멤브레인필터를 쓴다. 필터의 재질은 검체의 성분에 의하여 세균포집능력이 영향을 받지 않도록 주의하여 선택한다. 표 I-1의 각 미생물마다 1 개의 멤브레인필터를 쓴다. ① ～ ③항에 따라 조제한 검체의 적당량 (가능하면 검체의 1 g 해당량 또는 다수의 집략형성이 예측되는 경우에는 그 이하)을 멤브레인필터에 넣어 바로 여과하고 적당량의 희석액으로 멤프레인필터를 씻는다. 멤브레인필터를 총호기성미생물수 (total aerobic microbial count ; TAMC) 측정용으로는 대두카제인소화한천배지의 표면으로, 총진균수 (total combined yeasts/mould count : TYMC) 측정용으로는 사부로포도당한천배지의 표면으로 옮긴다. 표 I-1 에 기재한 조건으로 이들 평판을 배양한 다음 집락수를 측정한다.

ii) 한천평판법  한천평판법은 각 배지에 대하여 적어도 2 개의 평판을 써서 시험하며 결과는 각 평판의 측정균수의 평균값을 사용한다.

가. 한천평판혼합법  지름 9 cm의 페트리접시를 쓸 때는 페트리접시에 ① ～ ③항에 따라 조제한 검체 1 mL 및 미리 45 ℃ 이하로 보온한 15 ～ 20 mL의 대두카제인소화한천배지 또는 사브로포도당한천배지를 넣는다. 보다 큰 페트리접시를 쓸 때에는 크기에 맞게 한천배지량을 증가한다. 표 I-1에 제시한 미생물마다 적어도 2 개의 페트리접시를 쓴다. 표 I-1에 기재한 조건으로 평판배지를 배양한다. 배지마다 균주의 산술평균을 가지고 집락수를 계산한다.

나. 한천평판도말법  지름 9 cm의 페트리접시를 쓸 때는 15 ～ 20 mL의 대두카제인소화한천배지 또는 사부로포도당한천배지를 약 45 ℃일 때 넣어 굳힌 다음 층류식 캐비넷이나 항온기 중에서 평판배지를 건조한다. 보다 큰 페트리접시를 쓸 때에는 크기에 맞게 한천배지량을 증가한다. 표 I-1에 기재한 미생물마다 적어도 2 개의 페트리접시를 쓴다. ① ～ ③항에 따라 조제한 검체 0.1 mL 이상을 정확하게 취하여 배지표면전체에 편다. ii) 가.에 기재한 것과 같이 배양하여 측정한다.

iii) 최확수법  최확수법의 정밀도 및 정확도는 멤브레인필터법 또는 한천평판법 보다 낮다. 특히 곰팡이를 측정할 때는 신뢰성이 낮다. 이러한 이유로 최확수법은 다른 방법의 이용이 불가능할 때의 총호기성미생물수의 측정에 이용한다. 이 법을 적용할 때에는 다음과 같이 한다. ① ～ ③항에 따라 검체의 적어도 각각 3 개씩의  10 배 단계 희석계열을 조제한다. 각 희석단계로부터 각각 1 g 또는 1 mL 씩을 취하고 대두카제인소화액체배지가 9 ～ 10 mL 들어있는 3 개의 시험관에 각각 접종한다. 필요하면 폴리소르베이트 80과 같은 계면활성제 또는 항균제의 불활성화제를 배지에 첨가할 수 있다. 따라서 3 단계의 희석계열을 조제한 경우에는 9 개의 시험관에 접종하는 것이 된다. 모든 시험관을 30 ～ 35 ℃에서 3 일을 넘지 않는 기간 동안 배양한다. 검체의 성질로 인해 결과의 판정이 곤란하거나 불확실한 경우에는 같은 배지 또는 대두카제인소화한천배지에 이식한 다음 같은 온도에서 1 ～ 2 일간 배양하고 이 결과를 쓴다. 표 I-3 으로부터 검체 1 g 또는 1 mL 당 미생물의 최확수를 구한다.

표 I-3 미생물의 최확수

각 세트에서의 미생물 증식을 나타내는 시험관 수의 조합			제품 1 g 또는 1 mL 당의 최확수	95 % 신뢰한계
시험관 당 제품의 g 또는 mL 수
0.1	0.01	0.001
0	0	0	＜ 3	0 ～ 9.4
0	0	1	3	0.1 ～ 9.5
0	1	0	3	0.1 ～ 10
0	1	1	6.1	1.2 ～ 17
0	2	0	6.2	1.2 ～ 17
0	3	0	9.4	3.5 ～ 35
1	0	0	3.6	0.2 ～ 17
1	0	1	7.2	1.2 ～ 17
1	0	2	11	4 ～ 35
1	1	0	7.4	1.3 ～ 20
1	1	1	11	4 ～ 35
1	2	0	11	4 ～ 35
1	2	1	15	5 ～ 38
1	3	0	16	5 ～ 38
2	0	0	9.2	1.5 ～ 35
2	0	1	14	4 ～ 35
2	0	2	20	5 ～ 38
2	1	0	15	4 ～ 38
2	1	1	20	5 ～ 38
2	1	2	27	9 ～ 94
2	2	0	21	5 ～ 40
2	2	1	28	9 ～ 94
2	2	2	35	9 ～ 94
2	3	0	29	9 ～ 94
2	3	1	36	9 ～ 94
3	0	0	23	5 ～ 94
3	0	1	38	9 ～ 104
3	0	2	64	16 ～ 181
3	1	0	43	9 ～ 181
3	1	1	75	17 ～ 199
3	1	2	120	30 ～ 360
3	1	3	160	30 ～ 380
3	2	0	93	18 ～ 360
3	2	1	150	30 ～ 380
3	2	2	210	30 ～ 400
3	2	3	290	90 ～ 990
3	3	0	240	40 ～ 990
3	3	1	460	90 ～ 1980
3	3	2	1100	200 ～ 4000
3	3	3	> 1100

⑥ 결과 및 판정  멤브레인필터법 또는 한천평판법의 적합성을 확인할 때 모든 시험균의 평균측정값이 ②항에서 정의한 대조액 (검체 불포함)의 측정값의 2배 이내이어야 한다. 최확수법의 적합성을 확인할 때에는 측정값은 대조에서 얻은 결과의 95 % 신뢰한계 범위 이내이어야 한다. 기술한 어떠한 방법에서도 시험균 하나 또는 그 이상의 균종에서 위의 기준을 충족시키지 못하는 경우에는 기준에 가장 근접한 방법과 시험조건으로 검체를 시험한다.

5) 검체의 시험  가) 시험량  따로 규정이 없는 한 위에 기술한 대로 주의하여 채취한 검체 10 g 또는 10 mL를 쓴다. 에어로솔형의 액체 또는 고체는 검체 10 용기를 취한다. 경피흡수패취는 검체 10 패취를 취한다. 투여단위 (예를 들면 정제, 캡슐제, 주사제) 당의 주성분량이 1 mg 이하이거나 또는 1 g 또는 1 mL (투여단위가 표시되지 않은 제제) 당의 활성성분량이 1 mg 미만인 경우는 시험량을 줄일 수 있다. 이 경우 피험검체의 채취량은 제품의 10 투여단위 혹은 10g 또는 10 mL에 들어있는 양보다도 적지 않도록 한다. 주성분으로 사용되는 물질은 검체의 양에 제한이 있거나 로트 크기가 매우 작은 (예를 들면 1000 mL 또는 1000 g 미만) 경우에는 보다 적은 양이 규정되어 있거나 또는 정당한 이유가 없는 한 시험량은 로트의 1 %로 한다. 로트크기가 200 미만 (예를 들면 임상시험용 검체)인 검체에서는 시험량은 2 단위로, 또는 로트크기가 100 미만의 경우에는 1 단위로 줄일 수 있다. 원료 또는 제제의 용기로부터 무작위로 검체를 채취한다. 필요한 양의 검체를 얻기 위하여 충분한 수의 용기의 내용물을 혼합한다.

나) 검체 시험  ① 멤브레인필터법  필터를 배지에 넣을 수 있도록 설계된 여과장치를 쓴다. 4)에 따라 적합성이 확인된 방법으로 검체를 조제하고 적당량을 2 개의 멤브레인필터에 각각 넣고 바로 여과한다. 적합성이 확인된 방법에 따라 각 필터를 씻는다. 1 개의 멤브레인필터는 총호기성미생물수 측정을 위하여 대두카제인소화한천배지의 표면에, 다른 한 개의 멤브레인필터는 총진균수 측정을 위하여 사부로포도당한천배지의 표면에 놓는다. 대두카제인소화한천배지를 30 ～ 35 ℃에서 3 ～ 5일간, 사부로포도당배지를 20 ～ 25 ℃에서 5 ～ 7일간 배양한다. 검체 1 g 또는 1 mL 당의 집락수를 계산한다. 경피흡수패취를 시험할 때에는 4) 마)①항에 기재되어있는 조제액의 10 %량 씩을 2 개의 멸균멤브레인필터로 따로 여과한다. 1 개의 멤브레인필터는  총호기성미생물수 측정을 위하여 대두카제인소화한천배지에 넣고 다른 한 개의 멤브레인필터는 총진균수 측정을 위하여 사부로포도당한천배지에 넣는다.

② 한천평판법  ⅰ) 한천평판혼합법  4)항에 따라 적합성이 확인된 방법으로 검액을 조제한다. 각 배지에 대하여 희석단계마다 적어도 2 개의 페트리접시를 준비한다. 대두카제인소화한천배지는 30 ～ 35 ℃에서 3 ～ 5일간 배양하고 사부로포도당한천배지는 20 ～ 25 ℃에서 5 ～ 7 일간 배양한다. 집락수가 총호기성미생물수 측정에서는 250 미만, 총진균수 측정에서는 50 미만이면서 가장 많은 집락수를 나타내는 희석도의 한천배지를 선택하여 균수를 구한다. 배지마다 균수의 산술평균을 구하여 검체 1 g 또는 1 mL 당의 집락수를 계산한다.

ⅱ) 한천평판도말법  4)항에 따라 적합성이 확인된 방법으로 검액을 조제한다. 각 배지에 대하여 희석단계마다 적어도 2 개의 페트리접시를 준비한다. 배지 및 집락수의 계산은 한천평판혼합법에 기재된 대로 한다.

③ 최확수법  4)항에 따라 적합성이 확인된 방법으로 검액을 조제하여 희석한다. 모든 시험관을 30 ～ 35 ℃에서 3 ～ 5일간 배양한다. 필요하면 적합성이 확인된 방법으로 이식배양한다. 희석단계마다 미생물의 증식이 인정되는 시험관수를 기록한다. 표 I-3으로부터 검체 1 g 또는 1 mL 당 미생물의 최확수를 구한다.

다) 결과의 판정  대두카제인소화한천배지를 써서 측정된 집락수를 총호기성미생물수 (TAMC)로 한다. 이 배지 위에 진균의 집락이 검출되어도 TAMC로 계산한다. 사부로포도당한천배지를 써서 측정하는 집락수를 총진균수 (TYMC)로 한다. 이 배지위에 세균의 집락이 검출되어도 TYMC로서 계산한다. 세균의 증식 때문에 TYMC가 허용기준을 넘을 것으로 예측될 때에는 항생물질을 함유하는 사부로포도당한천배지를 써도 된다. 최확수법으로 측정하는 경우에는 계산값은 TAMC로 한다. 미생물학적품질의 허용기준이 규정되어 있을 때에는 아래와 같이 판정한다.

- 101 CFU : 최대허용 수 = 20

- 102 CFU : 최대허용 수 = 200

- 103 CFU : 최대허용 수 = 2000,  이하 동일

권장 용액 및 배지는 ｢특정미생물시험｣에 기재되어 있다.

비무균제품의 미생물학적시험 : 특정미생물시험

1) 서문  이 시험은 규정된 조건에서 검출할 수 있는 특정미생물이 존재하지 않거나 그 존재가 한정적인지를 판정하는 방법이다. 이 시험은 원료나 제제가 이미 정해진 미생물학적품질규격에 적합한지의 여부를 판정하는 것을 주 목적으로 한다. 채취검체수를 포함하여 지시된 방법에 따라 시험하여 결과를 판정한다. 약전시험법과의 동등성이 인정되는 경우에는 자동화법을 포함한 다른 미생물학적 방법을 적용할 수 있다.

2) 기본조작  검체의 조제는 ｢생균수시험｣에 따른다. 검체가 항균활성이 있을 때에는 ｢생균수시험｣에서와 같이 이 항균활성을 제거 또는 중화한다. 검체의 조제에 계면활성제를 쓸 때에는 ｢생균수시험｣에서와 같이 미생물에 대한 독성이 없고 사용하는 불활성화제와 상호작용이 없는 것을 확인한다.

3) 배지의 성능, 시험법의 적합성 및 음성대조  검체 존재 하에서도 미생물을 검출할 능력이 있음을 확인한다. 시험결과에 영향을 주는 시험법의 변경이나 검체의 처방변경이 있는 경우에는 다시 적합성을 확인한다.

가) 시험균의 조제  시험균은 표준화된 안정한 현탁액을 쓰거나 다음과 같은 방법으로 조제한다. 시험에 쓰는 미생물은 최초의 마스터시드로트 (master seed lot)로부터의 계대수가 5 회를 초과하지 않게 시드 로트 배양관리수법 (seed lot system)으로 관리한다.

① 호기성미생물   각 세균시험용 균주를 대두카제인소화액체배지 또는 대두카제인소화한천배지에서 각각 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 24 시간 배양한다. 칸디다알비칸스용의 시험균주는 사부로포도당한천배지 또는 사부로 포도당액체배지에서 각각 20 ～ 25 ℃에서 2 ～ 3 일간 배양한다.

Staphylococcus aureus  (황색포도구균) : 예를 들면 ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276 또는 KCTC 1927

Pseudomonas aeruginosa (녹농균) : 예를 들면 ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275 또는 KCTC 2513

Escherichia coli (대장균) : 예를 들면 ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, NBRC 3972 또는 KCTC 2571

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 또는 이와 동등한 것 (살모넬라) : 예를 들면 ATCC 14028

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony (살모넬라) : 예를 들면 NBRC 100797, NCTC 6017 또는 CIP 80.39

Candida albicans (칸디다알비칸스) : 예를 들면 ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 또는 NBRC 1594, KCTC 7965

시험균 현탁액의 조제는 pH 7.0 펩톤염화나트륨완충액 또는 pH 7.2 인산완충액을 쓴다. 현탁액은 2 시간 이내에 쓰며, 2 ～ 8 ℃에서 보존하는 경우에는 24 시간 이내에 쓴다.

② 클로스트리디아  예를 들면 ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) 또는 ATCC 17404 (NCTC 532 또는 CIP 79.3)와 같은 Clostridium sporogenes를 쓴다. 클로스트리디아 시험균주를 강화 클로스트리디아배지 중에 접종하고 30 ～ 35 ℃에서 24 ～ 48시간 혐기적 조건에서 배양한다. Cl. Sporogenes의 영양형 세포의 신선현탁액을 조제하여 희석하는 대신에 아포현탁액을 접종균액으로 사용할 수 있다. 아포현탁액은 보증된 기간 내에서는 2 ～ 8 ℃에서 보존할 수 있다.

나) 음성대조  시험조건을 확인하기 위하여 검액 대신 사용한 희석액을 써서 음성대조시험을 한다. 미생물이 증식해서는 안된다. 음성대조는 5)항에 따른 검체시험 시에도 측정한다. 시험에 실패한 음성대조는 고찰한다.

다) 배지의 성능시험  시판배지는 배치마다 시험한다. 건조배지 또는 각 성분을 가지고 조제한 배지는 조제배치마다 시험한다. 표 II-1의 내용과 같이 관련 배지에 대하여 적절한 특성을 확인한다.

표 II-1 배지의 증식촉진, 증식억제 및 감별특성

배지	특성	시험균주
담즙산저항성그람음성균시험
모젤장내세균증식균액체배지	증식촉진	E. coli P. aeruginosa
	증식억제	S. aureus
바이올렛·레드·담즙산·포도당한천배지	증식촉진 및 감별	E. coli P. aeruginosa
대장균시험
맥콘키액체배지	증식촉진	E. coli
	증식억제	S. aureus
맥콘키한천배지	증식촉진 및 감별	E. coli
살모넬라시험
라파포드바시리아디스살모넬라증균액체배지	증식촉진	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 또는 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony
	증식억제	S. aureus
엑스엘디한천배지(XLD agar)	증식촉진 및 감별	Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 또는 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abony
녹농균시험
세트리미드한천배지	증식촉진	P. aeruginosa
	증식억제	E. coli
황색포도상구균시험
만니톨염화나트륨한천배지	증식촉진 및 감별	S. aureus
	증식억제	E. coli
클로스트리디아시험
강화클로스트리디아배지	증식촉진	Cl. sporogenes
콜롬비아한천배지	증식촉진	Cl. sporogenes
칸디다알비칸스시험
사부로포도당액체배지	증식촉진	C. albicans
사부로포도당한천배지	증식촉진 및 감별	C. albicans

증식촉진특성시험, 액체배지  적당한 배지의 일부에 적절한 미생물을 소량 (100 CFU 이하) 접종한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에서 규정되어 있는 배양기간 중 최단시간 이내로 한다. 유효성이 확인된 배지 배치에서 이전에 시험하여 얻은 증식과 동등한 증식을 확인한다.

증식촉진특성시험, 고체배지  각 평판배지에 적당한 미생물을 소량 (100 CFU 이하) 접종하고 한천평판도말법으로 시험한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에 규정되어 있는 배양기간 중 최단시간 이내로 한다. 유효성이 확인된 배지 배치에서 이전에 시험하여 얻은 증식과 동등한 증식을 확인한다.

증식억제특성시험, 액체 또는 고체배지  적당한 배지에 적절한 미생물을 적어도 100 CFU 접종한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에 규정되어 있는 배양기간 중 최장시간 이상으로 한다. 시험균의 증식이 확인되지 않는다.

감별특성시험 각 평판배지에 적당한 미생물을 소량 (100 CFU 이하) 접종하고 한천평판도말법으로 시험한다. 규정된 온도에서 배양하고 배양시간은 시험법에 규정되어 있는 배양기간의 범위 내로 한다. 집락의 형상과 감별반응은 유효성이 확인된 배지 배치에서 이전에 시험하여 얻은 것과 동등하다.

라) 시험법의 적합성  검체마다 4)항의 관련 항목에 기재되어 있는 대로 검액를 조제한다. 규정된 증균배지에 혼합할 때 각 시험균을 넣는다. 시험균은 개별적으로 접종한다. 접종한 시험액 중 100 CFU 이하에 해당하는 균수의 미생물을 쓴다. 4)항의 관련항목에 따라 시험한다. 다만 규정된 배양기간 중 최단시간으로 한다. 특정미생물은 4)항에 기재된 감별반응으로 검출되어야 한다. 검체의 항균활성이 인정되는 경우에는 시험방법의 변경이 필요하다 (｢생균수시험｣의 3) 마)③항 항균활성의 중화․제거 항 참조). 어떠한 특정검체에서 규정된 시험법으로 미생물에 대한 항균활성을 중화할 수 없는 경우에는 억제된 미생물이 그 검체 중에 존재하지 않는다고 간주해도 된다.

4) 검체의 시험

가) 담즙산저항성 그람음성균

① 검액 조제 및 전(前)배양  검체 1 g 이상을 달아 그 10 배 희석액을 ｢생균수시험｣에 따라 조제하며, 이 때 희석액으로는 대두카제인소화액체배지를 써서 섞은 다음 균을 소생시키기에 충분하나 증균을 촉진시키지 않는 적절한 시간 (보통 2 시간이며 5 시간 이내) 동안 20 ～ 25 ℃에서 배양한다.

②부정시험  따로 규정되어 있지 않으면 ①항에서 조제한 검체 1 g에 해당하는 검액을 모젤장내세균증균액체배지에 접종한다. 30 ～ 35 ℃에서 24 ～ 48 시간 배양한 다음 바이올렛·레드·담즙산·포도당한천배지에 이식하고 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 24 시간 배양한다. 집락의 발육이 없으면 검체는 이 시험에 적합하다.

③ 정량시험

i) 선택배양  ①항에 기재되어 있는 조제액 및/또는 그 희석액으로 각각 검체의 0.1 g, 0.01 g, 0.001 g (또는 0.1 mL, 001 mL, 0.001 mL) 해당량을 적당량의 모젤장내세균증균액체배지에 접종한다. 30 ～ 35 ℃에서 24 ～ 48 시간 배양 한 다음 바이오렛·레드·담즙산·포도당 한천배지에 각 배양액을 이식하고 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 24 시간 배양한다.

ii) 판정  집락의 발육이 인정된 경우에는 양성으로 판정한다. 양성결과로 나타난 검체의 최소량과 음성결과로 나타난 최대량을 기재하고 표 II-2로부터 세균의 추정값을 구한다.

표 II-2 결과의 판정

제품의 각 양에 대한 결과			제품 1 g 또는 1 mL당 세균의 추정수
0.1 g 또는 0.1 mL	0.01 g 또는 0.01 mL	0.001 g 또는 0.001 mL
+	+	+	103 보다 크다
+	+	-	103 보다 작고 102 보다 크다
+	-	-	102 보다 작고 10 보다 크다
-	-	-	10 보다 작다

나)  대장균

① 검액의 조제 및 전배양  검체 1 g 이상을 취하여 ｢생균수시험｣에 따라 조제한 10 배 희석액 10 mL 혹은 검체 1 g 또는 1 mL에 해당하는 양을 적당량 (3) 라) 시험법의 적합성에서 결정)의 대두카제인소화액체배지에 접종하고 섞은 다음 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 24 시간 배양한다.

② 선택배양  용기를 흔들며 대두카제인소화액체배지의 1 mL를 맥콘키액체배지 100 mL에 넣는다. 42 ～ 44 ℃에서 24 ～ 48 시간 배양한 다음 맥콘키한천배지에 이식하고 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 72 시간 배양한다.

③ 판정  집락의 발육이 인정될 때에는 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한다. 집락이 없거나 또는 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.

다) 살모넬라

① 검액 조제 및 전배양  검체 10 g 또는 10 mL를 취하여 적당량 (3) 라) 시험법의 적합성에서 결정)의 대두카제인소화액체배지에 접종하고 섞은 다음 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 24 시간 배양한다.

② 선택배양  대두카제인소화액체배지 0.1 mL를 라파포트바시리아디스살모넬라 증균액체배지에 접종한다. 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 24 시간 배양한 다음 XLD 한천배지에 이식하고 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 48 시간 배양한다.

③ 판정  충분히 발육한 적색집락이 인정될 때에는 중심부에 흑점의 유무에 관계없이 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한다. 기재되어 있는 종류의 집락이 없거나 또는 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.

라) 녹농균

① 검액조제 및 전배양  검체 1 g 이상을 취하고 ｢생균수시험｣에 따라 조제한 10 배 희석액 10 mL 혹은 검체 1 g 또는 1 mL에 해당하는 양을 적당량 (3) 라) 시험법의 적합성에서 결정)의 대두카제인소화액체배지에 접종하여 섞은 다음 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 24 시간 배양한다. 경피흡수패취를 시험할 때는 ｢생균수시험｣의 4) 마)①항에 기재한대로 조제하고 1 패취 해당량을 멸균멤브레인필터로 여과하고 이 멤브레인필터를 100 mL의 대두카제인소화액체배지 중에 넣는다.

② 선택배양  세트리미드한천배지에 이식하고 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 72 시간 배양한다.

③ 판정  집락의 발육이 인정될 때에는 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한다. 집락이 없거나 또는 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.

마) 황색포도상구균

① 검액조제 및 전배양  검체 1 g 이상을 취하여 ｢생균수시험｣에 따라 조제한 10 배 희석액의 10 mL 혹은 1 g 또는 1 mL에 해당하는 양을 적당량 (3) 라) 시험법의 적합성에서 결정)의 대두카제인소화액체배지에 접종하여 섞은 다음 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 24 시간 배양한다. 경피흡수패취를 시험할 때는 ｢생균수시험｣의 4) 마)①항에 따라 조제한 1 패취 해당량을 멸균멤브레인필터로 여과하고 이 멤브레인필터를 100 mL의 대두카제인소화액체배지 중에 넣는다.

② 선택배양  만니톨염화나트륨한천배지에 이식하고 30 ～ 35 ℃에서 18 ～ 72 시간 배양한다.

③ 판정  황색의 띠로 둘러싼 황색 또는 백색집락의 발육이 인정될 때 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한다. 위와 같은 종류의 집락이 없거나 또는 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.

바) 클로스트리디아

① 검액 조제 및 가열처리  검체 2 g 또는 2 mL 이상을 취하여 ｢생균수시험｣에 따라 10 배 희석액 (최소 20 mL 이상)을 조제한다. 조제한 검액을 최소 10 mL씩 2 개로 나눈다. 그 중 1 개는 80 ℃에서 10 분간 가열한 다음 빨리 식히고 다른 1 개는 가열하지 않는다.

② 선택배양  각각에서 10 mL 또는 검체 1 g 또는 1 mL에 해당하는 양을 적당량 (3) 라) 시험법의 적합성에서 결정)의 강화클로스트리디아배지에 접종하여 섞은 다음 혐기적 조건으로 30 ～ 35 ℃에서 48 시간 배양한다. 배양 후 각 용기로부터 콜롬비아한천배지로 이식하고 혐기적 조건으로 30 ～ 35 ℃에서 48 시간 배양한다.

③ 판정  카타라제반응양성의 간균(아포가 있거나 또는 없는)의 혐기적 발육이 인정되는 경우 양성을 나타내며 동정시험으로 확인한다. 위와 같은 종류의 집락이 없거나 또는 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.

사) 칸디다알비칸스

① 검체 조제 및 전배양  검체를 ｢생균수시험｣에 따라 조제한다. 그 10 mL 혹은 검체 1 g 또는 1 mL 이상에 해당하는 양을 100 mL의 사부로포도당액체배지에 접종하여 섞어 30 ～ 35 ℃에서 3 ～ 5 일간 배양한다.

② 선택배양  사부로포도당한천배지에 이식하고 30 ～ 35 ℃에서 24 ～ 48 시간 배양한다.

③ 판정  백색집락의 발육이 인정될 때에는 양성으로 의심하고 동정시험으로 확인한다. 백색집락이 없거나 또는 동정시험에서 음성으로 판정될 때 검체는 이 시험에 적합하다.

아래 항은 정보제공을 목적으로 기재한 것이다.

5) 권장 용액 및 배지  아래의 용액 및 배지는 약전의 미생물시험에 규정되어 있는 목적에 적합한 것이다. 적합성이 확인되면 다른 배지를 써도 된다.

보존완충액  인산이수소칼륨 34 g을 물 500 mL에 녹이고 수산화나트륨시액으로 pH 7.0 ～ 7.4로 조정한 다음 물을 넣어 1000 mL로 하여 섞는다. 용기에 분주하여 멸균한다. 2 ～ 8 ℃에서 보존한다.

인산완충액, pH 7.2  물과 보존완충액을 혼합 (800 : 1)하여 조제하고 멸균한다.

펩톤염화나트륨완충액, pH 7.0 (Buffered Sodium Chloride-Pepton Solution pH 7.0)

인산이수소칼륨	3.6  g

인산수소이나트륨이수화물	7.2  g (인산염 0.067 mol/L에 상당한다)

염화나트륨	4.3  g

펩톤(육제 또는 카제인제)	1.0  g

물	1000 mL

검증된 주기로 고압증기멸균한다.

대두카제인소화액체배지 (Soybean-Casein Digest Broth)

카제인제 펩톤	17.0  g

대두제 펩톤	3.0  g

염화나트륨	5.0  g

인산수소이칼륨	2.5  g

포도당 일수화물	2.5  g

물	1000 mL

멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.1 ～ 7.5가 되도록 pH를 조정한다. 검증된 주기로 고압증기멸균한다.

대두카제인소화한천배지 (Soybean-Casein Digest Agar)

카제인제 펩톤	15.0  g

대두제 펩톤	5.0  g

염화나트륨	5.0  g

한천	15.0  g

물	1000 mL

멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.1 ～ 7.5가 되도록 pH를 조절한다. 검증 된 주기로 고압에 증기멸균한다.

사부로포도당한천배지 (Sabouraud Dextrose Agar)

포도당	40.0  g

펩톤 (육제 및 카제인제 1 : 1)	10.0  g

한천	15.0  g

물	1000 mL

멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 5.4 ～ 5.8이 되도록 pH를 조절한다. 검증된 주기로 고압증기멸균한다.

감자덱스트로스한천배지 (Potato Dextrose Agar)

감자침출액	200   g

포도당	20.0  g

한천	15.0  g

물	1000 mL

멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 5.4 ～ 5.8이 되도록 pH를 조절한다. 검증된 주기로 고압증기멸균한다.

사부로포도당액체배지 (Sabouraud Dextrose Broth)

포도당	20.0  g

펩톤 (육제 및 카제인제 1 : 1)	10.0  g

물	1000 mL

멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 5.4 ～ 5.8이 되도록 pH를 조절한다. 검증된 주기로 고압증기멸균한다.

모젤장내세균증균액체배지 (Enterobacteria Enrichment Broth Mossel)

젤라틴제 펩톤	10.0  g

포도당일수화물	5.0  g

건조소담즙	20.0  g

인산이수소칼륨	2.0  g

인산수소이나트륨이수화물	8.0  g

브릴리안트그린	15   mg

물	1000 mL

멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.0 ～ 7.4가 되도록 pH를 조절한다. 100 ℃에서 30 분간 가열하고 바로 식힌다.

바이올렛·레드·담즙산염·포도당한천배지 (Violet Red Bile Glucose Agar)

효모엑스	3.0  g

젤라틴제 펩톤	7.0  g

담즙산염	1.5  g

염화나트륨	5.0  g

포도당일수화물	10.0  g

한천	15.0  g

뉴트랄레드	30   mg

크리스탈바이올렛	2   mg

물	1000 mL

멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.2 ～ 7.6이 되도록 pH를 조절한다. 끓을 때까지 가열한다. 고압증기멸균기로 가열해서는 안 된다.

맥콘키액체배지 (MacConkey Broth)

젤라틴제 펩톤	20.0  g

유당일수화물	10.0  g

건조소담즙	5.0  g

브롬크레솔퍼플	10   mg

물	1000 mL

멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.1 ～ 7.5가 되도록 pH를 조정한다. 검증된 주기에서 고압증기멸균한다.

맥콘키한천배지 (MacConkey Agar)

젤라틴제 펩톤	17.0  g

펩톤 (육제 및 카제인제)	3.0  g

유당일수화물	10.0  g

염화나트륨	5.0  g

담즙산염	1.5  g

한천	13.5  g

뉴트랄레드	30   mg

크리스탈바이올렛	1   mg

물	1000 mL

멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 6.9 ～ 7.3이 되도록 pH를 조정한다. 끊임없이 저어 섞으면서 1 분간 끓이고 검증된 주기에서 고압증기멸균한다.

라파포트바시리아디스살모넬라증균액체배지 (Rappaport Vassilliadis Salmonella Enrichment Broth)

대두제 펩톤	4.5  g

염화마그네슘육수화물	29.0  g

염화나트륨	8.0  g

인산수소이칼륨	0.4  g

인산이수소칼륨	0.6  g

말라카이트그린	36   mg

물	1000 mL

약간 가온하면서 녹이고 115 ℃를 넘지 않는 온도에서 검증된 주기로 고압증기멸균한다. 가열 및 고압증기멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 5.0 ～ 5.4가 되도록 한다.

엑스엘디한천배지 (Xylose Lysine Deoxycholate Agar, XLD Agar)

자일로스	3.5  g

L-라이신	5.0  g

유당일수화물	7.5  g

백당	7.5  g

염화나트륨	5.0  g

효모엑스	3.0  g

페놀레드	80   mg

한천	13.5  g

데스옥시콜산나트륨	2.5  g

티오황산나트륨	6.8  g

시트르산암모늄철(II)	0.8  g

물	1000 mL

가열한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.2 ～ 7.6이 되도록 pH를 조정한다. 끓을 때까지 가열하고 50 ℃까지 식힌 다음 페트리접시에 붓는다. 고압증기멸균기로 가열해서는 안 된다.

세트리미드한천배지(Cetrimide Agar)

젤라틴제 펩톤	20.0  g

염화마그네슘	1.4  g

황산칼륨	10.0  g

세트리미드	0.3  g

한천	13.6  g

물	1000 mL

글리세린	10.0 mL

흔들어 섞으면서 가열하여 1 분간 끓인다. 멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.0 ～ 7.4가 되도록 pH를 조정한다. 검증된 주기로 고압증기멸균한다.

만니톨염화나트륨한천배지 (Mannitol Salt Agar)

카제인제 펩톤	5.0  g

육제 펩톤	5.0  g

육엑스	1.0  g

D-만니톨	10.0  g

염화나트륨	75.0  g

한천	15.0  g

페놀레드	25   mg

물	1000 mL

흔들어 섞으면서 가열하여 1 분간 끓인다. 멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.2 ～ 7.6이 되도록 pH를 조정한다. 검증된 주기로 고압증기멸균한다.

강화클로스트리디아배지 (Reinforced Medium for Clostridia)

육엑스	10.0  g

펩톤	10.0  g

효모엑스	3.0  g

용성전분	1.0  g

포도당일수화물	5.0  g

시스테인염산염	0.5  g

염화나트륨	5.0  g

아세트산나트륨	3.0  g

한천	0.5  g

물	1000 mL

한천을 물에 넣어 계속 저으면서 끓을 때까지 가열하여 녹인다. 필요하면 멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 약 6.6 ～ 7.0이 되도록 pH를 조정한다. 검증된 주기로 고압증기멸균한다.

콜롬비아한천배지 (Columbia Agar)

카제인제 펩톤	10.0  g

육침출물의 펩신소화물	5.0  g

심근침출물의 판크레아틴소화물	3.0  g

효모엑스	5.0  g

옥수수전분	1.0  g

염화나트륨	5.0  g

한천 (겔강도에 따라)	10.0 ～ 15.0 g

물	1000 mL

한천을 물에 넣어 계속 저으면서 끓을 때까지 가열하여 녹인다. 필요하면 멸균한 다음의 pH가 25 ℃에서 7.1 ～ 7.5가 되도록 pH를 조정한다. 검증된 주기로 고압증기멸균한다. 45 ～ 50 ℃로 식힌 다음 필요에 따라 겐타마이신염기 20 mg에 상당하는 양의 겐타마이신황산염을 넣어 페트리접시에 부어 넣는다.