식품의약품안전처 공고 제2014-26호

「의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격」(식품의약품안전처 고시 제2013-64호, 2013.4.5)을 일부 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 수렴하고자 그 취지, 개정 이유 및 주요 내용을 「행정절차법」 제46조에 따라 다음과 같이 공고합니다.

2014년  1월 29일

식품의약품안전처장

의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격

일부개정고시(안) 행정예고

1. 제안이유

의료기기 국제규격(ISO 10993-4, 9, 10, 13, 16) 개정으로 국제적으로 통용 가능한 의료기기의 생물학적 안전에 관한 국제규격의 일부내용이 변경됨에 따라 국내 기준규격을 최신 국제규격에 부합하도록 선진화하여 국내 유통 의료기기의 안전 및 품질 수준을 제고하고자 함

2. 주요내용

가. 기준규격의 목적 및 적용범위 등에 대한 조문 신설

(1) 현행 의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격은 조문의 형식으로 되어있지 않아 기준규격의 목적 및 적용범위 등을 명확하게 규정하기가 어려움

(2) 의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격 본문에 조문의 형식으로 기준규격의 목적 및 적용범위 등을 신설하여 명확하게 규정함

(3) 기준규격의 목적 및 적용범위 등 본문의 내용을 체계적으로 정비하여 기준규격 관리의 효율성을 제고함

나. 생물학적 안전에 관한 공통기준 및 시험방법 개정(별표)

(1) 현행 의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격의 일부 시험방법이 국제조화 되지 않아 민원인 혼란 발생 및 환자에 대한 잠재적 위해 발생 가능성 증가가 우려됨

(2) 국제적으로 통용 가능한 최신의 의료기기 국제규격(ISO 10993-4, 9, 10, 13, 16)을 반영하여 의료기기의 생물학적 안전에 관한 일부 시험기준 및 방법 등을 다음과 같이 변경함

- 혈액과 접촉하는 의료기기 종류별 적절한 혈액적합성 평가시험법 예시 명확화(별표 제4장)

- 의료기기 원재료(고분자, 금속, 세라믹 등)별 생체 내 분해산물에 대한 체계적인 실험 설계가 가능하도록 흐름도 추가(별표 제8장)

- 피부 자극성 평가를 위한 동물시험 대체시험법 추가(별표 제9장)

※ ‘인체유래 인공피부’를 사용하는 피부 자극성 시험방법 및 도축된 소의 안구를 이용한 안자극 평가 시험방법 등

- 화학적 또는 생물학적 환경에 노출되어 생성되는 고분자 원자재(폴리우레탄 등)의 균열 현상 평가를 위한 시험방법 추가(별표 제12장)

- 생분해성 의료기기 등으로부터 방출 가능한 생체 내 활성 성분이 있는 경우 독성동태 시험을 고려하도록 명확화(별표 제15장)

(3) 의료기기의 생물학적 안전에 관한 기준의 국제조화를 도모하여 국내 유통 의료기기의 안전 및 품질 수준을 향상시키고 의료기기 사용에 따른 대국민 안전이 강화될 것으로 기대됨

3. 의견제출

「의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격」 일부개정고시안(붙임)에 대하여 의견이 있는 단체 또는 개인은 2014년 3월 31일까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전처장(우편번호 : 363-700, 주소 : 충청북도 청원군 오송읍 오송생명5로 303 국도 푸르미르 빌딩 4층 식품의약품안전처(별관) 참조 : 의료기기정책과, 전화 043-230-0425, 팩스 043-230-0400, 전자우편 : bgkim81@korea.kr)에게 제출하여 주시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 의견(찬·반 여부와 그 사유)

나. 성명(단체인 경우 단체명과 그 대표자 성명), 주소 및 전화번호

다. 기타 참고사항

식품의약품안전처 고시 제2014-   호

「의료기기법」 제19조에 따른「의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격」(식품의약품안전처 고시 제2013-65호, 2013.4.5.)을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2014년   월   일

식품의약품안전처장

의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격 일부개정안

의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

“의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격(별표1)”을 삭제하고, 제1조부터 제4조까지를 각각 다음과 같이 신설한다.

제1조(목적) 이 고시는 「의료기기법」제19조 규정에 따라 품질에 대한 기준이 필요하다고 인정하는 의료기기에 대하여 그 적용범위, 시험규격 등을 기준규격으로 정하여 의료기기의 품질관리에 적정을 기하는 것을 그 목적으로 한다.

제2조(적용범위) 이 기준은 「의료기기법」(이하 “법”이라 한다) 제2조에 따라 정의된 의료기기 중 인체에 직·간접적으로 접촉하여 생물학적 안전에 대한 확인이 필요한 의료기기에 대하여 적용한다.

제3조(생물학적 안전에 관한 공통 기준 및 시험방법 등) 법 제19조 규정에 따라 품질에 대한 기준이 필요하다고 인정하는 의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준 및 시험방법 등은 별표와 같다.

제4조(재검토기한) 「훈령․예규 등의 발령 및 관리에 관한 규정」(대통령훈령 제248호)에 따라 이 고시 발령 후의 법령이나 현실여건의 변화 등을 검토하여 이 고시의 폐지, 개정 등의 조치를 하여야 하는 기한은 2016년 12월 31일까지로 한다.

별표 1을 별표로 한다.

별표 중 “의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격”을 “의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준 및 시험방법”으로 하고 “식품의약품안전처”를 삭제한다.

별표 중 <제목 차례>, <표 차례>, <그림 차례>, 제4장 혈액적합성시험, 제8장 잠재적 분해산물의 확인과 정량을 위한 체제, 제9장 자극성과 피부 감작성 시험, 제12장 고분자 소재 의료기기에서 얻어진 분해산물의 확인과 정량 및 제15장 분해산물과 용출물에 관한 독성동태시험을 각각 별지와 같이 한다.

부칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

제2조(적용례) ① 이 고시는 이 고시 시행 이후 최초로 제조하거나 수입(선적일 기준)하는 의료기기부터 적용한다.

② 이 고시 시행 당시 종전의 규정에 따라 의료기기 제조(수입)허가신청서, 의료기기 허가사항 변경허가신청서, 의료기기 기술문서 등 심사의뢰서를 접수한 경우에는 종전의 규정을 따른다.

의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준 및 시험방법(제3조 관련)

< 제 목 차 례 >

제 1장 평가와 시험	1

1. 적용범위	1

2. 목적	1

3. 정의	1

4. 의료기기의 생물학적 평가에 적용되는 일반원리	1

5. 의료기기의 분류	3

6. 시험	5

7. 생물학적 평가시험항목 선정 지침	9

8. 시험방법의 보증	10

제2장 : 실험동물관리	14

1. 적용범위	14

2. 정의	14

3. 요구 기준	16

부록 A 실험동물관리(기준규격)의 개발배경	23

부록 B 동물실험 대체, 감소, 개선 관련 추가사항	27

제3장 : 유전·발암·생식독성시험	30

1. 적용범위	30

2. 정의	30

3. 유전독성시험	31

4. 발암성시험	33

5. 생식독성시험/발생독성시험	34

6. 시험보고서	36

부록 A 세포 형질변환 시험시스템	37

부록 B 시험시스템에 관한 이론적 근거	38

부록 C 이식 발암성시험의 역할	40

제4장 : 혈액적합성시험	47

1. 적용범위	47

2. 정의	47

3. 약어	48

4. 혈액과 접촉하는 의료기기	50

5. 시험방법	51

부록 A 심장 혈관계 의료기기와 보형물에 대한 전임상 평가 방법	61

부록 B 실험실 시험 - 원리, 과학적 근거 및 해석	65

부록 C 의료기기와 의료기기 부분품의 용혈성에 대한 평가	72

제5장 : 세포독성시험	87

1. 적용범위	87

2. 정의	87

3. 검체 및 대조군 준비	88

4. 세포주	91

5. 배양액	92

6. 저장 세포주의 배양준비	92

7. 시험방법	92

8. 시험보고서	98

9. 결과의 평가	99

부록 A 뉴트럴 레드 세포독성 시험	100

부록 B 콜로니형성 세포독성 시험	109

부록 C MTT 세포독성 시험	115

부록 D XTT 세포독성 시험	121

제6장 : 이식시험	128

1. 적용범위	128

2. 정의	129

3. 이식시험에 대한 공통사항	129

4. 시험방법 및 일반사항	130

5. 시험보고서	136

부록 A 분해성 및 흡수성 물질의 이식기간과 조직반응에 대한 일반사항	138

부록 B 피하조직내 이식시험방법	139

부록 C 근육내 이식시험방법	141

부록 D 골조직내 이식시험방법	143

부록 E 이식 후 나타나는 국소적인 생물학적 영향 평가의 예	146

제7장 : 에틸렌옥사이드 잔류량 시험	151

1. 적용범위	151

2. 정의	151

3. 필요조건	152

4. 제품출고	161

부록 A 기체크로마토그래프법의 평가	164

부록 B 에틸렌옥사이드와 에텔렌클로로히드린에 대한 기체 크로마토그래피 분석	167

부록 C 의료기기 내에 함유된 에틸렌옥사이드 및 에틸렌클로로히드린 잔류물 분석에 본장을  적용하는 가이드라인과 흐름도	171

부록 E  잔류 에틸렌옥사이드 분석을 위한 용출 조건	181

부록 F 이 규격에서 제시된 기준의 배경	182

부록 G  에틸렌옥사이드 허용한도 기준 설정	187

부록 H 에틸렌클로로히드린 허용한도 기준 설정	208

부록 I 에틸렌글리콜 허용 한도 기준 설정	218

부록 J 에틸렌옥사이드 및 에틸렌클로로히드린 표준액 조제	223

부록 K 에틸렌옥사이드 잔류물 측정 방법	227

제8장 : 잠재적 분해산물의 확인과 정량을 위한 체제	252

1. 적용범위	252

2. 정의	252

3. 분해 시험의 설계에 관한 원리	253

4. 시험보고서	255

부록 A 분해시험의 필요성에 관련한 고려 사항	256

부록 B 생분해 시험에 관한 고려 사항	258

제9장 : 자극성과 피부 감작성 시험	261

1. 적용범위	261

2. 정의	261

3. 일반원리	263

4. 예비시험 시의 고려사항	264

5. 자극성 시험	266

6. 피부 감작성 시험	276

7. 시험결과의 해석에 있어 핵심적인 요소들	288

부록 A 자극성/감작성 시험을 위한 원자재의 준비	290

부록 B 추가 자극성 시험방법	292

부록 C 사람 피부 자극성 시험	308

부록 D 피부 자극에 대한 체외시험	312

부록 E 고분자 시험물질로부터 용출액 준비 방법	319

부록 F (참조) 배경 정보	322

제10장 : 전신독성시험	334

1. 적용범위	334

2. 정의	334

3. 일반적인 고려사항	335

4. 급성전신독성	341

5. 반복노출 전신독성 (아급성, 아만성 및 만성전신독성)	345

부록 A 투여 경로	350

부록 B 투여량	352

부록 C 일반적인 임상증상 및 관찰	353

부록 D 혈액학적, 임상화학적 및 요분석 측정	354

부록 E 조직병리학적 평가를 위한 기관 목록	356

부록 F 물질 매개성 발열원에 대한 정보	358

제11장 : 검체 준비와 표준물질	361

1. 적용범위	361

2. 정의	361

3. 일반사항	363

4. 표준물질	364

5. 표준물질의 실험대조군으로의 사용	364

6. 시험검체 선정	365

7. 시험검체 및 표준물질 준비	365

8. 의료기기의 대표 부분 선정	366

9. 검체의 용출물 준비	366

10. 기록	370

부록 A 실험 대조군	371

부록 B  검체 선정과 준비에 관한 일반원리 및 지침	372

부록 C 시험검체의 용출원리	374

제12장 : 고분자 소재 의료기기에서 얻어진 분해산물의 확인과 정량	378

1. 적용범위	378

2. 정의	378

3. 분해 시험방법	379

4. 시험과정	384

5. 시험보고서	388

부록 A 분석 방법	389

제13장 : 세라믹 소재 의료기기에서 얻어진 분해산물의 확인과 정량을 위한 체제	392

1. 적용범위	392

2. 정의	392

3. 시험과정	392

4. 여과액의 분석	401

5. 시험보고서	401

제14장 : 금속과 합금 소재 의료기기에서 얻어진 분해산물의 확인과 정량	404

1. 적용범위	404

2. 정의	404

3. 분해 시험방법	405

4. 시료 및 검체 준비	405

5. 전기화학적 시험	406

6. 침지 시험	408

7. 분석	409

8. 시험보고서	410

부록 A 전기화학적 측정 회로의 골격도	411

부록 B 전해 전지 모형도	412

부록 C 전기화학 시험에 대신 사용하는 전해질의 사례	413

제15장 : 분해산물과 용해물에 관한 독성동태시험	415

1. 적용범위	415

2. 정의	415

3. 독성동태 시험의 설계 원리	416

4. 시험방법에 관한 지침	417

부록 A 독성동태 시험 시 고려하여야 하는 환경	422

제16장 : 용해물에 관한 허용한도 기준	425

1. 적용범위	425

2. 정의	425

3. 허용 한도의 확립에 관한 일반 원리	428

4. 특정한 용해물의 허용 흡입량 확립	429

5. 허용 노출량의 계산	438

6. 실행 가능성 평가	442

7. 유익성 평가	442

8. 허용 한도	443

9. 보고서 요건	443

부록 A 생물학적 매개변수에 관한 일부 전형적인 가설	444

부록 B 용해물의 혼합물에 대한 위해 평가	446

부록 C 의료기기로부터 환자에게 투여되는 최대 투여량의 허용 한도 변환	447

부록 D 위험 분석 보고서	449

제17장 : 원자재의 화학적 특성	453

1. 적용범위	453

2. 정의	453

3. 약어	454

4. 일반원리	455

5. 원자재의 특성규명 절차	456

6. 화학적 특성규명 파라미터 및 방법	458

7. 자료의 보고	461

부록 A 독성학적 위험평가에 사용되는 화합물의 특성규명 자료 생성과정을 요약한 순서도	462

부록 B 화학적 특성규명과 관련한 정보 출처	464

부록 C 독성관련 동등성 판단에 관한 원리	468

< 표 차 례 >

표 1. 접촉부위 및 시간에 따른 초기 평가시험	11

표 2. 추가적 생물학적 평가시험	12

표 3. 약어 목록	49

표 4. 의료기기 및 의료기기 구성품과 접촉하는 순환 혈액 및 적합한 시험의 범주

- 체내·외 연결형 의료기기	57

표 5. 의료기기 및 의료기기 구성품과 접촉하는 순환 혈액 및 적합한 시험의 범주

- 이식형 의료기기	58

표 6. 체내·외 연결형 의료기기의 시험방법	59

표 7. 체내이식형 의료기기의 시험방법	60

표 8. 용출물 세포독성의 정성적 형태학적 등급	97

표 9. 한청 및 필터 확산 시험, 직접 접촉시험에 대한 반응 등급	97

표 A.1 3T3 NRU 세포독성 시험 흐름도(제5장 부록A)	107

표 C.1 MTT 세포독성 시험의 순서도(제5장 부록C)	119

표 D.1 XTT 세포독성 시험의 순서도(제5장 부록D)	126

표 10. 장기간 이식을 위한 시험기간	133

표 E.1 조직학적 평가 방식의 예-세포 유형/반응(제6장 부록E)	146

표 E.2 조직학적 평가 방식의 예-반응(제6장 부록E)	146

표 E.3 반정량적 평가 방식의 예(제6장 부록E)	147

표 A.1 기호(제7장 부록A)	164

표 C.1 에틸렌옥사이드 및 에틸렌클로로히드린 허용 한도 기준 요약(제7장 부록C)	172

표 E.1 권장 용출 조건(제7장 부록E)	181

표 G.1 공기 중 다양한 농도의 에틸렌옥사이드에 노출된 랫드의 에틸렌옥사이드 흡수 용량

(제7장 부록G)	188

표 G.2 에틸렌옥사이드의 제한/지속 노출 카테고리 허용 흡입량을 도출하는데 활용한 연구 자료

(제7장 부록G)	190

표 G.3 허용 흡입량 도출 시의 불확정 인자(제7장 부록G)	191

표 G.4 접합 집단과 비접합 집단에서 GSTT1 다양성이 헤모글로빈 부가체 수준에 미치는 영향

(제7장 부록G)	192

표 G.5 에틸렌옥사이드 흡입 이후 내부 용량 추정치(제7장 부록G)	196

표 G.6 에틸렌옥사이드 내부 용량의 종간 비교(제7장 부록G)	197

표 G.7 비발암성 허용 흡입량 값 도출(제7장 부록G)	198

표 G.8 참고문헌 [166]에서 도출한 단위 위험 값 기반 10-4 위험과 관련한 등가선량

(제7장 부록G)	200

표 G.9 에틸렌옥사이드의 발암성 기반 허용 흡입량 값 비교(제7장 부록G)	200

표 G.10 에틸렌옥사이드의 비발암성 및 발암성 허용 흡입량 값 비교(제7장 부록G)	201

표 G.11 에틸렌옥사이드의 자극 영향 연구 자료 비료(제7장 부록G)	204

표 G.12 에틸렌옥사이드의 자극 연구를 위해 도출한 불확정 인자와 변경 인자, 그리고 이 데이터

로 도출한 허용접촉한계(제7장 부록G)	205

표 H.1 에틸렌클로로히드린의 제한 노출 허용 한도 값을 위한 LD50(제7장 부록G)	210

표 H.2 에틸렌클로로히드린의 장기 노출 한계 기준 설정에 사용한 데이터(제7장 부록G)	212

표 H.3 에틸렌클로로히드린의 영구 노출 한계 기준 설정에 사용된 데이터(제7장 부록G)	213

표 H.4 허용 흡입량 값 도출을 위한 불확정 인자(제7장 부록G)	215

표 K.1 실험실간 변동계수와 실험실내 변동계수 비교(제7장 부록K)	227

표 11 .피부반응 점수체계	267

표 12. 토끼의 1차 또는 누적 자극 지수 범주	271

표 13. 피내(진피 내) 반응에 관한 등급 체계	273

표 14. 매그누슨과 클리그만 등급표	283

표 B.1 안구병변 체계(제9장 부록B)	295

표 B.2 구강 및 음경 반응에 대한 등급 체계(제9장 부록B)	298

표 B.3 구강, 음경, 직장, 질의 조직 반응에 대한 현미경 검사 등급 체계(제9장 부록B)	309

표 B.4 자극 지수(제9장 부록B)	300

표 C.1 사람의 피부 자극성 시험, 등급표(제9장 부록C)	302

표 D.1 품질관리 배치 출하 기준의 예(제9장 부록D)	314

표 D.2 양성대조군에 대한 모델 반응의 범위의 예(제9장 부록D)	315

표 F.3 지연성 접촉 감작 시험의 대안적 방법들(제9장 부록F)	324

표 15. 권장되는 최소 시험군 크기	337

표 16. 관찰 사항의 요약	341

표 B.1 시험검체의 최대 투여량(제10장 부록B)	352

표 C.1 일반적인 임상증상 및 관찰(제10장 부록C)	353

표 17. 표준 표면적과 용출액 부피	368

표 A.1 표준물질 및 대조군의 예시(제11장 부록A)	371

표 18. 준수하여야 하는 단계	386

표 19. 시험방법 약어	454

표 20. 고분자의 분석 파라미터 및 분석방법	458

표 21. 금속과 합금의 분석 파라미터 및 분석방법	459

표 22. 세라믹의 분석 파라미터 및 분석방법	460

표 23. 천연 고분자의 분석 파라미터 및 분석방법	460

< 그 림 차 례 >

그림 1. 혈액과 상호작용 시험이 필요한지 여부를 결정하는 의사결정 순서도	54

그림 A.1 2개 물질의 크로마토그래피 분리(제7장 부록A)	166

그림 A.2 비대칭적 크로마토그래피 피크(제7장 부록A)	166

그림 C.1 본장의 적용 단계를 이해하는데 도움이 되는 흐름도(제7장 부록C)	176

그림 C.2 본장의 적용 단계를 이해하는데 도움이 되는 흐름도(제7장 부록C)	177

그림 C.3 본장의 적용 단계를 이해하는데 도움이 되는 흐름도(제7장 부록C)	178

그림 J.1 에틸렌옥사이드 표준액 조제 장치(제7장 부록J)	224

그림 K.1 특수 헤드스페이스 병(제7장 부록K)	232

그림 2. 피부 적용부위의 위치	268

그림 3. 주사 위치의 배치	273

그림 B.1 피내 주사 부위의 배치(제9장 부록B)	284

그림 4. 선택 과정에 관한 흐름도	393

그림 5. Ea에서의 부식 전류 시작과 파괴전위 Ep를 나타내는 전류 밀도 대 전위의 도면	409

그림 A.1 전기화학적 측정 회로의 골격도(제14장 부록A)	411

그림 B.1 전해 전지 모형도(제14장 부록B)	412

그림 A.1 순서도(제17장 부록A)	463

제4장 혈액적합성시험

(관련규격: ISO 10993-4:2002, 2006(Amd.))

1 적용범위

본 장에서는 다음의 내용을 기술한다.

1) 제1장(ISO 10993-1)에서 정의한 혈액과 접촉하는 의료기기 및 치과재료

2) 혈액과 접촉하는 의료기기의 평가에 대한 기본적 원리

3) 시험의 선정에 대한 이론적 근거와 시험의 원리 및 시험에 대한 과학적 근거

의료기기와 혈액의 상호작용에 대한 시험의 정확성과 지식의 한계로 혈액적합성 시험의 상세한 요구기준은 명시될 수 없다. 또한 본 장에서는 일반적인 측면에서의 생물학적 평가를 기술하므로, 특정 의료기기를 위한 시험 방법에 대해 충분한 지침을 제공하지 못할 수도 있다. 시험 방법의 선정과 설계 시에는 의료기기의 설계, 원자재, 임상적 유용성, 사용 환경 및 위험 편익이 고려되어야 한다. 이러한 구체적인 사항은 품목별 기준규격(vertical standards)에서 다룰 수 있다.

2 정의

2.1 혈액과 의료기기의 상호작용(blood/device interaction)

혈액(또는 혈액구성성분)과 의료기기(혈액, 기관, 조직, 의료기기에 영향을 줄 수 있는 의료기기) 사이의 상호작용

주) 이러한 영향은 임상적으로 유의하거나 바람직하지 않은 결과로 나타날 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 자세한 사항은 부록 A를 참조한다.

2.2 혈액응고(coagulation)

혈액응고 인자의 연쇄적 반응(clotting factor cascade)이 활성화되어 일어나는 현상

주) 연쇄적 응고반응(coagulation cascade)과 피브린용해 시스템(fibrinolytic systems)의 인자들은 의료기기를 체내, 체외에 노출한 후 측정할 수 있다.

2.3 보체계(complement system)

선천적 면역 체계의 일부로 효소와 세포 수용체를 포함하여 여러 가지 혈장 단백질로 구성되어있음

주) 보체계 구성성분으로부터 생성된 작용 분자(effector molecules)는 염증반응, 대식작용, 세포용해와 관련있다.

2.4 색전술(embolization)

응혈이나 이물질을 혈류 속으로 운반하여 혈관의 폐색을 유발하는 과정으로, 이때 색전은 말단에 머무르거나 폐색을 유발 할 수 있음

2.5 체내‧외 순환 시험 시스템(ex vivo test system)

사람 또는 시험동물로부터 혈액을 체외에 있는 챔버로 순환시키는 시험 시스템에 적용하는 용어

주) 시험동물을 사용하는 경우 혈액을 시험동물의 체내로 재순환시킬 수도 있고, 분석을 위하여 시험관에 채집할 수도 있다. 어느 경우에든 시험 챔버는 체외에 위치시킨다.

2.6 혈액학(haematology)

혈액을 연구하는 것으로 혈액의 세포 구성성분 또는 혈장 구성성분의 정량을 포함함

2.7 혈소판(platelet)

순환계에 존재하는 무핵 세포체로 출혈을 최소화하기 위해 표면에 부착되고 응집되어 지혈마개(hemostatic plug)를 생성함

주) 혈소판 시험은 혈소판의 정량 뿐 아니라 구조 및 기능의 분석도 포함한다. 시험은 혈소판 표면의 혈소판 인자분석 시험 및 혈소판에서 방출되었거나 의료기기 표면에 부착되어 있는 혈소판 표면의 구성성분을 분석하는 시험을 포함한다.

2.8 혈전증(thrombosis)

혈전 생성으로 유발된 혈액응고시스템 및 혈소판의 활성화와 관련되어 순환 중인 전혈에서 유발되는 체내(in vivo) 또는 체내․외(ex vivo) 현상

2.9 혈전(thrombus)

적혈구, 응집된 혈소판, 피브린과 기타 세포 구성요소가 응고된 혼합물

2.10 혈전 색전화(thromboembolization)

혈전을 혈관 말단으로 흘려 혈관의 폐쇄 또는 패색을 유발하는 과정

3 약어

표 3은 이 규격에 사용되는 약어에 대한 목록이다.

약 어	의 미
Bd	보체활성화 대체경로의 생성물
β---TG	베타 트롬보글로블린(Beta-thromboglobulin)
C4d	보체활성화 고전경로의 생성물
C3a, C5a	C3와 C5의 (활성화된)보체단편생성물
CD62L	L-selectin
CH-50	50% total haemolytic complement (50% 전 용혈성 보체)
CT	컴퓨터 단층촬영 (computerized tomography)
D-Dimer	특정 피브린 분해산물(F XIII 교차 연결된 피브린)
ECMO	체외 순환용 막(membrane)산소발생기
ELISA	enzyme/linked immunosorbent assay
E.M	전자현미경
FDP	피브린/피브리노겐 분해산물
FPA	피브리노펩타이드 A(Fibrinopeptide A)
F1+2	프로트롬빈 활성프래그먼트(activation fragment) 1 + 2
iC3b	중앙 C 보체 활성화 생성물
IVC	하대 정맥(Inferior vena cava)
MRI	자기공명사진
PAC-1	혈소판 표면의 당단백질IIb/IIIa의 활성된 형태를 인식하는 단일항체
PET	양성자 방출 단층 촬영(Positron Emission Tomography)
PF-4	혈소판 인자 4
PRP	혈소판 풍부 혈장 (platelet-rich plasma)
PT	프로트롬빈 시간(Prothrombin time)
PTT	부분 트롬보플라스틴 시간(Partial thromboplastin time)
P-selectin	혈소판 또는 내피세포 방출반응 동안 노출되는 수용체 (receptor exposed during either platelet or endothelial cell release reaction)
RIA	방사면역측정법(Radioimmunoassay)
S-12	혈소판방출반응에 발현되는 알파입자 GMP140을 인식하는 단클론항체
SC5b-9	보체활성화의 종료경로의 생성물
TAT	트롬빈-항트롬빈 복합체(Thrombin-antithrombin complex)
TCC	Terminal Complement Complex
TT	트롬빈시간(Thrombin time)
VWF	폰 빌레브랜드 인자(von Willebrand factor)

표 3 약어 목록

4 혈액과 접촉하는 의료기기

혈액과 접촉하는 의료기기는 제1장(ISO 10993-1) 제5항에 분류되어 있다.

4.1 비접촉형 의료기기

체외시험법(in vitro)에서 사용되는 진단용 의료기기가 이에 포함될 수 있다.

4.2 체내‧외 연결형 의료기기(external communicating devices)

순환혈액과 접촉하며 혈관계의 도관역할을 하는 의료기기

1) 간접적인 혈액 경로 역할을 하는 체내‧외 연결형 의료기기에는 다음과 같은 것이 포함되나 이것으로 한정되지 않는다.

- 캐뉼라(cannulae)

- 연장 장치(연장튜브 등)

- 채혈 기기

- 혈액 및 혈액제제 보관 및 투여를 위한 기기(예들 들어, 튜브, 바늘, 주머니)

- 자가 수혈기(cell saver)

2) 순환하고 있는 혈액과 접촉하는 체내‧외 연결형 의료기기(체내‧외 연결형 의료기기)에는 다음과 같은 것이 포함되나 이것으로 한정되지 않는다.

- 죽종 제거 장치(atherectomy devices)

- 혈액 모니터(blood monitors)

- 카테터(catheters)

- 가이드와이어(guidewires)

- 혈관 내시경(intravascular endoscopes)

- 혈관 내 초음파 (intravascular ultrasound)

- 혈관내 레이저 시스템 (intravascular laser systems)

- 역행성 관상동맥 관류 카테터 (retrograde coronary perfusion catheters)

- 심폐 우회 회로(cardiopulmonary bypass circuitry)

- 체외 막형 산소 공급기 (extracorporeal membrane oxygenators)

- 혈액 투석기와 혈액 여과기

- 공혈자 혈액분리장치와 치료적 혈액분리장치(donor and therapeutic apheresis equipment)

- 혈액에서 특정 물질을 흡수하는 장치

- 심혈관 중재기와 혈관 기기

- 경피성 순환 유지기

4.3 체내이식형 의료기기

체내이식형 의료기기의 대부분 또는 전 부분이 혈관계에 이식되는 기기를 말한다. 다음과 같은 예가 포함되나 이것으로 한정되지 않는다.

- 윤상 성형용 고리

- 기계적 또는 조직 심장 판막

- 보형물 또는 조직 혈관 이식재

- 순환 유지기 (심실 보조 장치, 인공 심장, 대동맥 내 풍선 펌프)

- 하대정맥 필터

- 색전술 기기

- 혈관내막 이식재

- 이식형 심장충격기

- 스텐트

- 동정맥 션트

- 혈액 모니터

- 체내 약품 전달 카데터

- 인공 심장 박동기 전극선

- 혈관 내 막형 산소 공급기 (인공폐)

- 백혈구 제거 필터

5 시험방법

5.1 일반사항

5.1.1 혈액과의 상호작용에 대한 시험이 필요한가의 여부를 결정하는데 그림 1을 참조한다. 혈액 상호작용은 주요 측정 과정 또는 시스템을 근거로 하여 5개의 범주로 분류할 수 있다. 순환 혈액에 접촉하는 의료기기와 이에 적합한 시험방법에 대한 예시는 표 4와 5에 나타나있다.

주) 시험의 선정에 대한 이론적 근거를 제시하여야 한다. 혈전증 시험은 의료기기의 특성을 규명하기 위한 방법으로 자주 이용된다. 많은 경우 혈전증 시험 대신 혈액학 및 보체 시스템시험, 혈소판시험, 응고시험을 조합한 시험을 실시한다. 이러한 경우 이론적 근거를 제시하여야 한다.

개별규격이 존재하는 의료기기의 경우에는 개별규격에서 정하고 있는 생물학적 평가 요건 및 시험방법이 이 규격에서 제시하는 일반적 요건보다 우선시된다.

5.1.2 시험조건은 접촉시간, 온도, 멸균상태, 유동상태 등을 포함한 실제 임상적 적용에서의 혈액과 의료기기의 접촉조건을 최대한 재현할 수 있는 모델과 시스템을 사용하여야 한다. 기하학적 형태가 정해진 의료기기의 경우, 시험 매개변수(단위부피당 농도)와 노출되는 표면적(㎠)의 비율을 평가하여야 한다.

혈액과 접촉되는 부분만을 시험하여야 한다.  선택된 시험방법과 매개변수는 당시의 최신기술에 따라야 한다.

5.1.3 대조군을 사용하여야 한다. 대조군이 생략되는 경우에는 이론적 근거를 제시하여야 한다. 대조군은 가급적 이미 임상적으로 사용되어지는 의료기기 또는 특성이 알려진 참고물질을 사용한다.

사용하는 참고물질은 음성 및 양성대조를 포함하여야 한다. 시험대상 의료기기 및 원자재는 제조자 및 시험기관의 품질관리 및 품질보증에 부합하여야 하고 출처, 제조자, 등급 및 형태를 밝혀야 한다.

5.1.4 의료기기의 구성성분 원자재에 대한 시험은 사전 선별시험의 목적으로 수행될 수 있다. 그러나 이러한 예비시험이 완제품 의료기기나 의료기기 부분품의 모의사용조건에서의 시험 또는 과장임상사용조건에서의 시험을 대신할 수는 없다.

5.1.5 의료기기의 실제 임상조건을 재현할 수 없는 시험은 임상에서 사용하는 동안에 일어날 수 있는 혈액과 의료기기의 상호작용을 정확하게 예측할 수 없다. 예를 들어 단기 체외 혹은 체내‧외 순환시험으로 장기간의 혈액과 의료기기의 체내 상호작용을 예측하기 어렵다.

5.1.6 사용목적이 체내‧외 순환인 의료기기는 체내‧외 순환조건을 통하여 시험하고, 사용목적이 체내이식형인 의료기기는 임상사용조건이 최대한 재현된 상태에서 시험동물을 이용한 체내시험으로 한다.

5.1.7 제4항, 그림 1, 표 5와 함께 5.1.5항과 5.1.6항의 권장사항은 5.2.1항에 나열되어 있는 시험 선정의 지침이 된다. 전 임상 평가에 대한 지침은 부록 A에 나와 있다. 다음의 절차가 수행되어야 한다. :

1) 5개의 잠재적 혈액 상호작용 범주가 해당 의료기기에 적합한지 결정

2) 이러한 범주 내에서 반응에 대한 기존의 정보 평가

3) 표 6 또는 표 7에서 적합한 시험 선정

5.1.8 혈액의 수집 및 혈액에 대한 체외시험에 사용되는 1회용 시험기구는 시험결과와 간섭현상이 없음을 확인하여야 한다.

5.1.9 앞에 기술된 방법으로 선정되고 임상적 적용을 모방하는 조건하에서 실시된 시험의 결과는 의료기기의 임상적 성능을 예견하는데 있어서 적중 확률이 높다. 그러나 종(species)간의 차이 및 다른 요소들은 이러한 확률에 대한 제한요인으로 작용할 수 있다.

5.1.10 혈액과의 반응에 있어서 종 간의 차이가 있으므로 가능하다면 사람의 혈액을 사용한다. 지속노출 또는 반복노출 및 영구접촉 등에 대한 의료기기의 평가를 위하여 시험동물모델을 사용한다면 종간의 혈액접촉에 대한 차이점을 고려하여야 한다.

사람과 영장류 동물사이의 혈액성질과 반응성은 매우 비슷한 것으로 보고되어 있다. 영장류이외에 돼지, 송아지, 양과 같은 시험동물을 사용했을 때에도 유용한 결과를 얻을 수 있다. 종간의 차이가 유의하기 때문에(예를 들면 혈소판 부착, 혈전증 및 용혈반응은 개 과에서 쉽게 일어나는 경향이 있다.) 모든 동물시험의 결과는 주의 깊게 해석하여야 한다.

사용된 종 및 종의 수는 타당하여야 한다.

주) 체내 혈액적합성시험 및 의료기기 시험에 영장류를 사용하는 것은 EU법 및 몇몇 국가법에 의해 금지되었다.

5.1.11 의료기기가 항응고제를 사용하지 않는 경우라면 시험과정에서 항응고제를 사용하지 않는다. 사용되는 항응고제의 농도와 종류는 혈액과 의료기기의 상호작용에 영향을 주므로 그 선택은 타당하여야 한다. 항응고제와 같이 사용되는 의료기기는 임상적으로 사용되는 농도범위의 항응고제와 함께 평가되어야 한다.

5.1.12 임상적으로 허용된 의료기기의 변경은 혈액과 의료기기의 상호작용 및 임상적 성능에의 영향을 고려하여야 한다. 설계와 형태의 변화, 의료기기 표면부분의 화학조성 변화 또는 의료기기 전체 화학조성의 변화, 조직결의 변화, 표면의 다공성, 기타 특성의 변화 등이 고려되어야 한다.

5.1.13 시험결과의 통계적 평가를 위해서 충분한 횟수의 시험을 한다. 몇몇 시험방법의 경우 시험과정 중 변이요인이 존재하므로 충분한 횟수의 시험을 반복하여 유의성을 결정하여야 한다. 또한 혈액과 의료기기의 연장된 접촉기간에 걸친 반복시험을 통하여 접촉시간에 따른 시험정보를 얻을 수 있다.

5.2  시험방법

5.2.1 의료기기 및 의료용 원자제와 혈액과의 상호작용평가 시험방법

권장되는 시험들은 의료기기의 형태에 기초하여 표 6과 표 7에 따라 구성한다.

시험은 측정되는 주요과정 또는 시스템에 따라서 다섯 가지로 분류된다.

1) 혈전증

2) 혈액응고

3) 혈소판

4) 혈액학

5) 보체계

이 시험들에 대한 원리 및 과학적 근거는 부록 B에 있다.

그림 1. 혈액과 상호작용 시험이 필요한지 여부를 결정하는 의사결정 순서도

5.2.2 비접촉형 의료기기

일반적으로 혈액과 의료기기와의 상호반응시험을 요구하지 않는다. 1회용 시험키트는 정확성을 저해할 수 있는 원자재의 영향을 검증하여야 한다.

5.2.3 체내‧외 연결형 의료기기(external communicating devices)

표 4와 표 5를 이용하여 특정 의료기기 유형에 대해  관련된 혈액 상호작용 범주를 결정한 후, 표 6에 의해 체내‧외 연결형 의료기기의 혈액 상호작용 평가에 적절한 시험방법을 선택한다(5.1.6 참고). 시험 평가되는 개별 의료기기에 따라 선정기준은 달라진다.

5.2.4 체내이식형 의료기기(implant devices)

표 4와 표 5를 이용하여 특정 의료기기 유형에 대해 관련된 혈액 상호작용 범주를 결정한 후, 표 7에 의해 체내이식형 의료기기의 혈액 상호작용 평가에 적절한 시험방법을 선택한다(5.1.6 참고). 시험 평가되는 개별 의료기기에 따라 선정기준은 달라진다.

5.2.5 시험분석의 반응지표와 한계(Indication and limitations)

면역측정법(Immunoassay)은 사람 혈액시험에는 적절하지만 일반적으로 다른 종의 시험에는 적절하지 않다. 사람혈액용 시험 키트는 보통 몇몇 영장류를 제외하고 다른 종과 교차 반응 하지 않는다. 인위적 요소가 아닌 시험검체에 의한 시험시스템의 활성(activation)을 측정하는 것임을 확인하기 위해 시험시스템 설계에 주의를 기울여야 한다. 면역측정법의 유효 범위 내에서 측정하기 위해 사람 혈액의 체외 모의사용 및 체내․외순환 모의사용의 경우 시험조건에 따라 반응물의 혈장수준을 저․중․고 수준의 희석물로 만들 필요가 있다. 시험되는 검체의 희석범위가 측정됨을 확인하는 데에도 주의를 기울여야 한다.

부적절한 원자재 특성규명 또는 시험 전 검체에 대한 부주의한 취급 때문에 혈액과 의료기기의 상호작용 평가에 오차가 생길 수 있다. 예를 들면 한 종류의 시험에만 의존하거나 시험 중인 원자재 또는 의료기기와 관련 없는 외래 물질이 들어간 경우 그러하다. 유속이 느린 환경(정맥)에서 사용되는 원자재는 유속이 빠른 환경(동맥)에서 사용하는 경우 혈액과의 상호작용이 약간 다르게 나타날 수 있다. 설계나 유속 조건이 바뀌면 원자재의 체내 혈액적합성도 바뀔 수 있다.

5.3 시험유형

5.3.1 체외시험(In vitro tests)

체외시험을 시행할 때는 적혈구용적(haematocrit), 항응고제, 검체 채집, 검체의 오래된 정도, 검체 저장, 공기의 순환 및 pH, 온도, 시험군 대 대조군의 시험결과, 표면과 부피의 비율, 유체역학상태(특히 벽면 전단율)등의 변수를 고려하여야 한다. 수집 후 혈액의 일부 성질은 급속히 변하므로 시험은 최소한의 시간, 일반적으로 4시간 이내에 시행되어야 한다.

5.3.2 체내‧외 순환시험(Ex vivo tests)

사용목적이 체내‧외 순환인 경우(예: 체내‧외 연결형 의료기기)는 체내‧외 순환시험을 시행하여야 한다. 체내‧외 순환시험은 의료기기의 사용목적이 체내인 경우(예: 체내이식형 의료기기의)에도 유용하다. 그러나 체내‧외 순환 시험이 이식시험을 대체할 수는 없다.

체내‧외 순환시험 시스템은 혈소판 침착, 색전 형성, 피브리노겐 침전, 혈전 응집, 백혈구 침착, 혈소판 소모, 혈소판 활성화 등의 관찰에 유용하다. 혈류속도는 도플러 또는 전자기혈류측정기를 이용하여 측정한다. 혈류의 변화는 혈전 및 색전의 생성 정도 및 경로를 나타낸다.

많은 체내‧외 순환시험은 혈액과 의료기기의 상호작용을 관찰하기 위하여 방사성동위원소를 혈액 구성성분에 표지시켜 분석하는 방법을 사용한다. 혈소판 및 피브리노겐은 가장 보편적으로 방사성동위원소를 표지하여 분석하는 혈액 구성요소이다. 방사선동위원소 표지방법으로 인한 혈소판의 반응성 변화는 기술적인 처리에 주의를 기울여 최소화하도록 한다.

체내‧외 순환시험을 체외시험과 비교하였을 때의 장점은 자연상태의 혈액을 사용할 수 있어서 생리학적 흐름의 상태를 제공하며, 챔버를 바꾸어 시험할 수 있어서 여러 원자재의 평가가 가능하고, 몇 가지 시험에 대하여 실시간 관찰이 가능하다는 점이다. 단점은 시험마다 혈액 흐름의 차이가 있고, 시험동물 사이의 혈액 반응성의 차이가 있으며, 평가될 수 있는 시간간격이 상대적으로 짧다. 본 시험에서는 동일한 시험동물을 이용한 양성 및 음성대조의 사용이 추천된다.

5.3.3 체내시험

체내시험은 의료용 원자재 또는 의료기기를 시험동물에 이식하여 시험한다.

혈관 패치, 혈관이식재, 보형물 고리, 심장 판막과 순환보조 의료기기 등은 체내시험을 하는 형태의 예이다.

도관의 개방성은 체내시험에 대한 성공 혹은 실패를 가늠하는 척도이다. 폐색율 및 혈전의 질량은 이식된 의료기기를 제거한 후 측정한다. 의료기기에 혈전이 형성되어 말단기관에 색전을 형성하는 현상은 이식된 의료기기 주변기관에 대한 현미경 검사 뿐 아니라 세심한 총체적 검사를 통해 측정하여야 한다. 그리고 주변 조직 및 기관에 대한 조직병리학적 평가가 유용할 수 있다.

특히 신장은 이식된 의료기기(심실보조장치, 인공심장, 대동맥 보철이식물 등)에서 생성된 혈전을 신동맥에서 수집하는 경향이 있다.

시험을 종료시키지 않고 평가하는 방법이 있다. 동맥조영법은 이식조직의 개방성 혹은 의료기기에 축적된 혈전 등을 측정하는데 사용된다. 방사선 영상처리기법은 다양한 시간에서의 체내 혈소판 침착을 관찰하는데 사용될 수 있다. 혈소판의 생존과 소모는 혈액과 의료기기의 상호작용 및 신생내막(neointima)형성 또는 단백질 흡착으로 인한 막형성(passivation)의 지표로 사용될 수 있다.

일부 체내시험시스템에서 원자재의 특성이 혈액과 의료기기의 상호작용을 결정하는 주요요소가 아닐 수도 있다. 흐름의 변수, 유연성, 다공성, 이식물의 디자인이 원자재 자체의 혈액적합성보다 중요할 수 있다. 동일한 원자재에 대해서 평가하는 경우라도 유속이 낮은 시스템에서와 유속이 높은 시스템에서의 결과는 상당히 다르게 나타날 수 있다. 이러한 경우에는 체내시험시스템 결과가 체외시험결과보다 중요하다.

표 4. 의료기기 및 의료기기 구성품과 접촉하는 순환 혈액 및 적합한 시험의 범주

- 체내‧외 연결형 의료기기(External communicating devices)

의료기기의 예	시험 범주
	혈전증	응고	혈소판	혈액학	보체계
24시간 미만 설치되는 카테터 (예, 죽종제거 장치, 가이드와이어)	×a			×b
혈액 모니터	×a			×b
혈액 보관 및 투여 장치, 채혈 기기, 확장 장치		×	×	×b	×c
24시간 이상 설치되는 카테터 (예, 혈관 내시경, 혈관 내 초음파, 레이저 기기, 역행성 관상동맥 관류 카데터)	×a			×b	x
자가 수혈기(Cell saver)		×	×	×b
혈액에서 특정 물질을 흡수하는 장치		×	×	×	×
공혈자 혈액분리장치와 치료적 혈액분리장치, 세포 분리 시스템		×	×	×	×
체외 막형 산소 발생기 시스템, 혈액 투석/혈액 여과 장치 경피적 순환 유지기	×a			×	×
백혈구 제거 필터		×	×	×b	x
a 2.8에 언급한 대로, 혈전증은 체내 또는 체내․외 현상이다. 혈액응고 및 혈소판 반응은 이 과정에 포함되는 것으로 알려져 있다. 따라서 제조업자는 혈액응고 및 혈소판 시험의 범주에 속하는 특정 시험이 해당 의료기기에 적합한지를 결정하여야 한다. b 용혈성 시험만 해당 c 혈액분리장치 및 관련 절차에만 해당

표 5. 의료기기 및 의료기기 구성품과 접촉하는 순환 혈액 및 적합한 시험의 범주

- 이식형 의료기기(Implant devices)

의료기기의 예	시험 범주
	혈전증	응고	혈소판	혈액학	보체계
윤상 성형용 고리(annuloplasty rings), 기계적 심장 판막	×a			×b
대동맥 내 풍선 펌프	×a			×
모든 인공 심장, 심실 보조 장치	×a			×	×
색전술 기기(Embolization devices)	×a			×b
혈관내막 이식재	×a			×b	×
이식형 심장충격기	×a			×b
심장 박동기 전극선	×a			×b
인공혈관 이식재와 첩포(patch), 동정맥 션트 포함	×a			×b	×
스텐트	×a			×b
조직 심장 판막	×a			×b
조직 혈관 이식재와 패취, 동정맥 션트 포함	×a			×b
대정맥 필터	×a			×b
a 2.8에 언급한 대로, 혈전증은 체내 또는 체내․외 현상이다. 혈액응고 및 혈소판 반응은 이 과정에 포함되는 것으로 알려져 있다. 따라서 제조업자는 혈액응고 및 혈소판 시험의 범주에 속하는 특정 시험이 해당 의료기기에 적합한지를 결정하여야 한다. b 용혈성 시험만 해당

표 6. 체내‧외 연결형 의료기기(External communicating devices)의 시험방법

시험의 종류	시 험 방 법	비 고
혈전증	폐색율 (Percent occlusion)
	유속 감소
	중량분석(혈전 질량)
	광학현미경(부착된 혈소판, 백혈구, 응집, 적혈구, 피브린, 등)
	의료기기 통과 압력
	혈전 성분에 대한 표지항체
	주사 전자 현미경 (혈소판 점착과 응집 ; 혈소판과 백혈구 형태, 피브린)
혈액응고	PTT(비활성)
	혈전 생성: 특정 응고 요소 분석법 ; FPA, D-dimer, F1+2, TAT
혈소판	혈소판 수치 및 점착
	혈소판 응집
	템플레이트(template)출혈시간
	혈소판 기능 분석
	PF-4, β-TG; 트롬복세인B2
	혈소판 활성 표지자
	혈소판 미세 입자
	방사선 표지 혈소판의 감마 영상, 111In(인듐) 표지 혈소판 잔존물	지속 사용이나 반복 사용 (> 24시간에서 30일)과 영구 접촉 (> 30일)의 경우 111In(인듐) 표지가 권장됨
혈액학	미분화 백혈구/분화 백혈구 수치
	백혈구 활성화
	용혈
	망상 적혈구 수치 ; 말초 혈액 세포의 활성화-특정 방출 산물 (과립구)
보체계	C3a, C5a, TCC, Bb, iC3b, C4d, SC5b-9, CH50, C3 전환 효소, C5 전환 효소

표 7. 체내이식형 의료기기(Implant devices)의 시험방법

시험의 종류	시 험 방 법	비 고
혈전증	주사 전자 현미경 (혈소판 점착과 응집) ; 혈소판과 백혈구 형태, 피브린
	폐색율(percent occlusion)
	유속 감소
	혈전 성분에 대한 표지 항체
	의료기기의 검시 (육안 및 현미경) : 조직 병리학
	말초 기관의 검시 (육안 및 현미경) : 조직 병리학
혈액응고	특정 응고 인자 평가 ; FPA, D-dimer, F1+2, PAC-1, S-12, TAT
	PTT (비활성), PT, TT ; 혈장 피브리노겐 ; FDP
혈소판	PF-4, β-TG ; 트롬복세인 B2 (thrombozane B2)
	혈소판 활성 표지자
	혈소판 미세 입자
	방사선 표지 혈소판의 감마 영상, 111 In(인듐) 표지 혈소판 잔존물
	혈소판 기능 분석
	혈소판 수치/점착
	혈소판 응집
혈액학	미분화 백혈구/분화 백혈구 수치
	백혈구 활성화
	용혈
	망상 적혈구 수치 ; 말초 혈액 세포의 활성화-특정 방출 산물 (과립구)
보체계	C3a, C5a, TCC, Bb, iC3b, C4d, SC5b-9, CH50, C3 전환 효소, C5 전환 효소

부록 A

(참조)

심장 혈관계 의료기기와 보형물에 대한 전임상 평가방법

A.1 일반적인 고려 사항

A.1.1 배경

본 부록은 혈액과 심장 혈관계 의료기기의 상호작용을 평가하는 시험방법의 선정에 관련된 배경 정보를 제시하고 있다. 본 장의 5항에는 시험이 필요한 경우와 특정한 의료기기에 적합한 혈액 상호작용의 범주 그리고 비접촉형 의료기기, 체내․외 연결형 의료기기 그리고 체내이식형 의료기기의 혈액-의료기기 상호작용을 평가하는 방법들에 대한 지침이 수록되어 있다.

A.1.2 분류

아래의 분류는 혈액과 의료기기의 상호작용에 관한 배경 정보로 제공된 것이다.

1) 의료기기에 상당한 영향을 미치는 혈액과의 상호작용은 다음과 같다.(환자에게 바람직하지 못한 영향을 줄 수도 있고, 주지 않을 수도 있음)

a) 혈액의 혈장 단백질, 지방질, 칼슘 또는 기타 물질들이 의료기기 표면에 흡착되거나 의료기기 안으로 흡수됨

b) 혈소판, 백혈구 또는 적혈구가 의료기기의 표면에 점착되거나 의료기기 안으로 이들의 구성성분이 흡수됨

c) 의료기기의 표면에 조직피막(tissue capsule)이나 또는 가내막(pseudointima)을 형성

d) 의료기기의 기계적 특성과 기타 특성의 변경

2) 사람 또는 동물에게 바람직하지 못한 영향을 미칠 가능성이 있는 상호작용은 다음과 같다.

a) 혈소판, 백혈구 또는 기타 세포의 활성이나 응고, 피브린 분해성 또는 보체경로의 활성화

b) 의료기기 표면에 혈전 형성

c) 의료기기의 관 표면에서 나온 혈전성물질 또는 기타 물질이 색전화하여 순환계 내의 다른 곳으로 옮겨감.

d) 순환 혈액 세포가 손상되어 빈혈, 용혈, 백혈구 감소, 혈소판 감소 또는 혈액 세포 기능 변화가 일어남.

e) 의료기기 인접 조직 및 세포의 손상

f) 의료기기 표면과 접촉해 있거나 인접한 조직의 내막 비대 또는 증식이 일어나 혈류를 감소시키고 의료기기의 기능에 영향을 줌.

g) 의료기기 표면 및 인접부위에 세균(박테리아) 또는 전염성 병원균이 점착하여 생장

A.1.3 동물시험과 체외시험의 장점과 한계

동물 모델은 의료기기를 지속적으로 관찰하고, 중요한 변수가 있는 시험을 체계적으로 관리할 수 있도록 해준다. 그러나 동물 모델의 선정은 비용, 특정 종의 이용 가능성 그리고 크기 조건에 의한 제약이 있다. 조사자는 특히, 마취제, 항응고제, 혈전제 및 항혈소판 약품 그리고 항생제와 같은 의약품에 대한 반응과 응고, 혈소판 기능 및 섬유소 용해와 관련하여 사람과 선정된 종사이의 생리학적 차이 및 유사성을 염두에 두는 것이 중요하다. 반응에 대한 종 간의 차이, 반응에 대한 대상개체의 차이 그리고 서로 다른 의료기기에 대한 다양한 반응으로 인해 단일 종에서 얻은 자료는 신중하게 해석하여야 한다. 개코 원숭이와 같은 사람이외의 영장류는 혈액학 수치, 혈액 응고 기전 그리고 심혈관계가 사람과 상당히 유사하다. 사람이외의 영장류의 또 다른 장점은 사람을 위해 개발된 많은 혈전용 면역학적 탐침을 이들에게도 사용할 수 있다는 것이다. 이들 탐침에는 PF-4, b-TG, FPA, TAT, F1+2가 포함된다. 개는 보편적으로 사용되는 종이며, 유용한 정보를 제공해주고 있다. 그러나 개에게서는 의료기기와 관련된 혈전증이 사람에게서 보다 더 쉽게 발생하는 경향이 있으며, 차이는 이러한 합병증을 평가할 때 장점이 될 수도 있다. 일반적으로 돼지는 혈액학적 특성과 심혈관계가 사람과 유사하기 때문에 적합한 동물 모델로 간주된다. 외과적 이식 과정이 결과에 미치는 영향을 염두에 두고 적합한 대조군을 포함시켜야 한다.

종 간에는 지혈과 혈액학적 인자 및 활성의 차이가 있기 때문에 가능한 한 사람의 혈액으로 체외 시험을 실시하는 것이 바람직하다.

혈전 형성은 동적 과정이다. 따라서 혈전증이 발생하는 동적상태(예를 들어, 혈액과 의료기기 상호작용의 전단력)를 가능한 많이 모방하여 체외 시험을 실시하는 것이 바람직하다. 원자재와 의료기기의 상호 작용을 평가하는 일부의 경우에는 정적 시험이 유용할 수도 있다.

심혈관용 의료기기를 사용하는 환자들은 항혈전제나 항응고제를 투여 중일 수 있기 때문에 이러한 조건을 체외에서 모방하는 것이 중요하다.

A.1.4 동물 시험에 관한 시험 방법

혈전증, 혈전색전증, 출혈과 감염은 기능이 향상된 심혈관용 보형물의 개발과 사용을 진보시키는데 있어서 주요 방해 요인이다. 제한적으로(24시간 미만) 혈액에 노출되는 의료기기의 경우, 중요한 측정 지표는 혈액학적 변수,  성능의 변수, 전반적인 혈전의 형성과 색전이 급성으로 발생 할  정도와 관련이 있다. 지속노출, 반복노출, 영구접촉 (24시간 초과)의 경우에는 시간경과에 따라 혈전과 혈전색전증, 순환 혈액 성분의 소진, 내피세포의 비대와 감염의 발생에 관한 정보를 얻을 수 있는 연속적인 측정 기법이 중요하다. 앞에서 언급한 노출과 접촉의 범위는 용혈과 혈소판 기능을 평가하는데 중요하다. 예를 들어, 혈전 형성은 외과적 기법, 다양한 시간에 따른 혈전 용해 및 색전 현상, 겹쳐진 의료기기의 감염성, 노출된 표면의 변이 가능성(예를 들면 내막 비대와 내피화) 등에 의해 많은 영향을 받을 수 있다.

혈액과 인공 표면(artificial surface)의 상호작용 결과의 범위는 전반적인 혈전과 색전에서부터 지혈성분의 가속소모와 같은 미세한 영향까지를 포함한다 ; 지혈성분은 소모량이 상쇄되거나 고갈될 수 있다. (상쇄되는 경우는 의료기기에 의해 소모되는 총 혈소판수가 미미하여 총 혈소판수 계수에 영향이 없는 경우이고, 고갈되는 경우는 총혈소판수 계수에 영향을 줄 만큼 충분한 혈소판을 소모할 정도로 의료기기 표면적이 큰 경우이다.)

A.1.5 체외시험에 관한 시험 방법

체외 시험은 상대적으로 저렴한 비용과 동물을 희생시키지 않고도 통계적 평가를 위한 충분한 횟수의 시험을 가능하게 한다. 측정은 혈액학적 변수, 혈액역학적 변수와 성능 변수, 전반적인 혈전의 형성과 보체활성의 급성정도와 관련이 있다. 체외 접근법은 의료기기 또는 원자재를 혈액에 노출시키는 기간을 다양하게 함으로써 다양한 인자와 활성의 역학을 평가할 수 있도록 한다.

A.2 캐뉼러(Cannulae)

캐뉼러는 일반적으로 혈액 통로를 반복적으로 제공하기 위하여 하나 이상의 주요 혈관에 삽입된다. 캐뉼러는 심폐 우회술 및 기타 과정에도 사용된다. 캐뉼러는 급성 또는 만성으로 시험할 수 있으며, 일반적으로 동정맥 (AV) 션트와 같이 시험된다. 캐뉼러를 이용하는 경우에는 응고 또는 보체계의 인자나 순환 혈액 세포의 농도가 약간 변한다. 다른 간접 혈액 경로 의료기기(4.2의 1) 참조)와 같이 캐뉼러는 일반적으로 순환 혈액과 직접 접촉을 하는 의료기기만큼 시험할 필요는 없다.(4.2의 2), 4.3 참조).

A.3 카테터와 가이드와이어(Catheters and guidewires)

캐뉼러에서 고려되는 대부분의 시험은 카테터와 가이드와이어 시험과 관련이 있다. 정맥계나 동맥계에 있는 카테터의 배치와 위치는 혈액과 의료기기의 상호작용에 주요한 영향을 미칠 수 있다. 반대편의 동맥 또는 정맥을 이용하여 대조 시험을 동시에 실시할 것을 권장한다. 혈전이 떨어지지 않도록 주의하면서 카테터를 제거하여야 한다. in situ 평가는 혈전형성에 기여하는 내피 또는 입구 부위의 손상 정도를 평가할 수 있도록 해준다. 일반적으로 도플러 (Doppler) 혈액 유속 탐침이 혈관 조영기보다 유용한 정보를 제공해준다. 방사능 표지 혈액 성분에 대한 동적 시험은 만성 카테터(chronic catheters)의 경우에만 권장된다.

A.4 체외 산소발생기, 혈액 투석기, 치료용 혈장교환기, 혈액에서 특정한 물질을 흡수하는 기기 (Extracorporeal oxygenators, haemodialysers, therapeutic apheresis equipment, and devices for absorption of specific substances from blood)

심폐우회술에 대한 지혈반응은 급성이고 아주 클 수 있다. 노출 시간, 혈액과 공기와의 접촉, 저체온증, blood-pump priming fluid의 성분, 혈액 흡입과 같은 다양한 변수들이 시험 값에 영향을 미친다. 초음파 방사선 기법이나 비침습 기법을 이용하거나 체내․외(ex-vivo) 순환형혈액 여과기를 주기적으로 교체하여 유출선 내의 색전을 검출할 수 있다. 산소발생기 통과 압력의 감소 및 산소 전달율과 같은 성능 인자를 관찰함으로써 우회술을 진행하는 동안 혈전누적을 직접적으로 평가할 수 있다. 심폐 우회술을 받은 환자에게서 선택적 알파(alpha) 과립 방출과 관련이 있는 후천적이고 일시적인 혈소판 기능 장애가 관찰되어 왔다; 특히 일시적인 출혈 시간과 혈소판 기능 및 방출에 대한 다른 시험들이 유용하다.

보체 활성은 혈액 투석기와 심폐우회장치에 의해 발생할 수 있다. 임상적으로 유의적인 폐울혈(pulmonary leucostasis)과 기능 장애를 동반한 폐 손상이 나타날 수 있다. 이런 이유로 이런 의료기기의 경우 보체 활성을 측정하는 것이 유용하다.

치료용 혈액분리장치(Therapeutic aphoresis equipment)와 혈액에서 특정 물질을 흡수하는 의료기기는 표면적 대 부피 비율이 높기 때문에 잠재적으로 보체, 응고, 혈소판 및 백혈구 경로를 활성화시킬 가능성이 있다. 혈액과 의료기기의 상호작용에 대한 시험은 체외 산소 발생기와 혈액 투석기의 원리와 동일한 원리를 따라야 한다.

A.5 심실보조장치와 인공심장(Ventricular-assist devices and total artificial hearts)

이들 의료기기는 다양한 혈액 성분에 상당한 변화를 일으킬 수 있다. 이런 영향을 일으키는데 도움을 주는 인자들에는 혈액이 노출되는 넓은 표면적, 높은 유속, 교란된 흐름(분리된 흐름[separated flow]과 난류[turbulence flow]와 같은)이 포함된다. 이런 의료기기의 시험에는 용혈성, 피브리노겐 농도, 트롬빈 생성, 혈소판 잔류물과 활성, 보체 활성의 측정과 간․신장․폐․중추 신경계 기능에 대한 면밀한 관찰이 포함된다. 평가에 있어 외과적 회복 단계의 세부적인 병리학적 검사는 중요한 요소이다.

A.6 인공판막(Heart valve prostheses)

인공판막(prosthetic valves)을 평가하는데 있어서 침습적, 비침습적, 체외 유체역학적 시험이 중요하다.

청진(auscultation)은 인공판막 기능장애를 선별하는 가장 효과적인 수단 가운데 하나이다. 2D와 M 방식의 심장초음파검사는 초음파 방사선을 이용하여 심장의 영상을 조영한다. 서로 다른 음향 임피던스 (acoustic impedances)를 원자재에 반사시켜 영상을 조영한다. 인공판막의 구조를 평가할 수 있다. 기계적 보형물은 강력한 음향 신호를 방사하고, 일반적으로 폐색의 움직임을 선명하게 조영해줄 수 있다. 그러나 영상의 질은 시험되는 특정 판막에 따라 달라진다. 심장초음파검사는 조직유래 인공판막의 기능을 평가하는데 유용할 수 있다. 조직증식, 엉긴덩어리, 판막편이 두꺼워졌는지 등을 알 수 있다. 전통적 도플러 심장초음파검사와 칼라 도플러 심장초음파검사를 이용하여 역류를 규명하고 준정량하는 것이 가능하다.

혈소판 잔류물과 혈소판 응집 측정, 혈전증과 용혈 시험, 혈압과 혈류 측정, 판막과 주변 조직 검시가 권장된다.

A.7 혈관 이식재(Vascular grafts)

다공성 원자재와 비다공성 원자재는 모두 동맥계나 정맥계 내의 다양한 위치에 이식할 수 있다. 이식부위 선정은 대부분 보형물의 사용목적에 따른다. 이식재의 개방성은 직경이 클수록 그리고 길이가 짧을수록 향상된다. 일반적으로 내부 직경이 4mm 이하인 이식재의 경우에는 길이가 직경의 10배 이상(즉, 직경 4mm에 대해 길이 40mm)이 되어야 한다. 주기적인 혈관 조영과 일부 위치에 있는 말초부위 맥박의 촉진(觸診; palpation)을 통해 개방성을 측정할 수 있다. 초음파 방사선, MRI와 PET도 유용할 수 있다. 방사능 표지 혈소판에 대한 연속적 영상 관찰의 결과는 개코원숭이에 이식된 비내피화 이식재의 표면적과 상호관련이 있다. 방사능 표지 혈소판으로 혈관벽의 혈전 축적을 비침습적으로 조영할 수 있다. 혈소판 수치, 혈소판 방출 인자, 피브리노겐/피브린 분해산물, 응고가 활성화된 종(activated coagulation species)의 연속적인 측정도 권장된다. 이식재와 인접 혈관 분절에 대한 검시는 내피 보전성(endothelial integrity)과 증식 반응에 대한 형태계량학적 연구에 유용한 정보를 제공해 줄 수 있다. 의료기기의 안전성을 평가하는 동안 말초 부위 문합, 중앙 부위 문합 그리고 대표적인 중간형 이식재의 종단면과 횡단면에 대한 체계적인 평가가 필요하다.

A.8 하대정맥필터(IVC filters), 스텐트, 스텐트형 이식재

이들 의료기기는 혈관 조영술과 초음파 방사선으로 시험할 수 있다. 혈관 이식재 평가(A.7 참조)에 유용한 다른 기법들 또한 적합하다.

부록 B

(참조)

실험실 시험 - 원리, 과학적 근거 및 해석

B.1 일반사항

B.1.1 배경

이 부록에서는 5.2.1항의 시험의 원리와 과학적 근거를 설명한다. 세부적인 방법은 진단검사의학과 임상병리의 표준교재에 제시되어 있다.

B.1.2 체외 시험에 관한 원리

정적 시스템과 동적 시스템, 예를 들면 순환고리(circulatory loop)와 원심분리(centrifugation)시스템이 사용된다.

B.1.3 시험조건

혈액과 의료기기의 상호작용을 체외평가하기 위한 시험에서, 항응고 처리된 정상인 또는 시험동물의 혈액 및 혈장은 먼저 원자재 또는 의료기기에 표준화된 조건으로 노출시켜야 하고, 표준화된 조건에는 시간, 온도, 유속이 포함된다. 노출된 혈액이나 혈장의 분취량은 노출시킨 이후에 바로 시험하도록 한다. 노출조건은 의료기기의 사용목적을 근거로 하여야 한다.

시험을 준비함에 있어 시험 전에 혈액 성분의 방출이나 혈액의 활성화가 일어나지 않게 해야 한다. 그러나 적절한 조건은 시험하는 의료기기나 원자재 그리고 이들의 사용목적에 따라 결정된다.

B.1.4 분류

사용 중인 위치에서 체내․외 연결형(externally communicating) 의료기기와 체내이식형 의료기기를 평가하는 경우에는 항응고제 처리된 용기에 혈액을 채취하며, 사전 노출 단계를 거치지 않고 시험을 실행한다. 시험은 시험과정이나 시험 시스템에 따라 5.2.1항에 정의되어 있는 5가지 범주로 분류된다 : 혈전증, 혈액응고, 혈소판, 혈액학, 보체계.

B.2 혈전증(Thrombosis)

B.2.1 일반사항

혈전증의 특성에는 적합한 순환 모델, 동물 모델 또는 임상환경에 적합한 체외(in vitro), 체내․외(ex vivo) 및 체내(in vivo) 방법을 포함한다.

B.2.2 폐색율

폐색율은 의료기기를 사용하고 제거한 후에 시각적으로 측정한다. 이는 도관 내에서의 혈전 진행의 심각한 정도를 측정하는 것이다. 폐색율을 측정하기 전에 혈전은 색전이 되거나 또는 제거되기 때문에, 폐색이 없다는 것이 반드시 혈전 생성 과정이 없다는 것을 뜻하는 것은 아니다. 폐색은 혈전뿐 아니라, 내피 비대, 특히 혈관 이식재 주변문합 부위의 내피 비대에 의해서도 발생할 수 있다.; 폐색 진행의 특성을 규명하기 위하여 현미경 검사가 필요하다. 혈전이 덮여있는 표면적과 그렇지 않은 표면적 측정은 상대적인 개념으로 사용될 수 있는 준정량적인 시험이다.

B.2.3 혈류 감소

혈류(속도 또는 부피)는 사용 후에 측정한다. 사용 전․후 또는 사용하는 동안 혈류를 측정할 수도 있다. 이에 대한 이론적 근거와 해석은 B.2.2과 같다.

B.2.4 중량 분석(혈전 질량)

사용 중인 위치에서 의료기기를 제거한 후에 실시한다. 이에 대한 이론적 근거와 해석은 B.2.2과 같다.

B.2.5 광학 현미경

본 기법을 이용하여 원자재에 대한 세포 밀도, 세포 응집, 섬유소 점착에 관련된 정보뿐만 아니라 원자재나 의료기기에 나타나는 침전물의 배치 분포에 관련된 정보도 얻을 수 있다. 이 시험방법은 준정량적인 방법이다.

B.2.6 의료기기 통과 시 압력 강하

이 시험은 사용 전․후에 시행한다. 이에 대한 이론적 근거와 해석은 B.2.2과 같다.

B.2.7 주사 전자 현미경 (SEM): Scanning electron microscopy

이에 대한 이론적 근거와 해석은 B.2.5와 같다. 이 방법은 시험하는 성분의 미세 구조에 대해 보다 세부적인 정보들을 제공해 준다는 점에서 B.2.5의 방법보다 더 이점이 있다. 재현성의 정도를 확실하게 하기 위하여 충분한 반복을 통해 정량적 결정을 내려야 한다.

B.2.8 항체 결합

피브린과 원자재에 대한 혈소판 점착을 현미경으로 정성분석 한 후, 피브린(피브리노겐) 또는 혈소판 막 리셉터에 대한 표지된 항체를 측정하여 정량분석을 한다. 이러한 목적을 위하여 표지 항체 결합 전에 비점착 혈액 성분을 제거하기 위해 노출 후 원자재를 세척한다.

B.2.9 의료기기의 회수 및 검사

이 방법은 이식된 의료기기에 대한 생물학적 반응을 평가하는데 있어 대단히 중요하다. 신중하고 세부적인 시험방법을 통해 단백질성 침전물, 세포의 현미경적 특성, 세포의 크기 및 분포 상태를 측정한다. 제안된 과정들은 출판되어 있다.

B.2.10 말초 기관의 검시

이에 대한 이론적 근거는 이식된 의료기기가 말초 부위에 미치는 영향을 평가하는 것이다. 이 영향은 혈전색전증과 의료기기 구성 성분에 의한 색전이 포함된다.

B.2.11 조영 기법 - 혈관 조영술, 혈관내 초음파, 도플러 (Doppler) 초음파, CT, MRI

이 방법들 중에서 선정하여, 이식재나 기타 도관의 협착 정도나 개방성을 측정하고, 체내에서 작동하는 동안 의료기기에 대한 혈전 점착을 검출한다.

B.3 혈액응고

혈액응고 시험은 천연(신선하고 항응고처리되지 않은)전혈과 항응고처리된 전혈(일반적으로 구연산염화된), 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 결핍 혈장을 이용한다. 대부분의 표준 응고 평가 방법은 과다 출혈이나 응고 지연의 원인이 되는 임상적 응고 이상을 측정하기 위하여 설계되기 때문에, 생체재료(biomaterial)가 유도하는 가속 응고를 측정하기 위하여 혈액과 의료기기의 상호작용 평가 방법에 관한 방법을 적합하게 변형시켜야 한다. aPTT(activated partial thromboplastin time)에 근거한 시험에 쓰이는 시약에는 고령토(kaolin)나 규조토(celite),  엘라직 산(ellagic acid)과 같은 활성제가 포함된다. 그러한 활성제를 이용하는 시약은 원자재와 의료기기가 일으키는 응고의 가속화를 가리는 경향이 있으므로 피해야 한다. 시험하려는 원자재를 활성제로 이용한다.; (시험물질이 들어있지 않은)대조군이 포함되어야 한다.

관의 내표면이 시험원자재인 경우에는 평행 판 세포(parallel plate cell)와 같은 정적 챔버 또는 폐회로 시스템(closed-loop system)에서 혈액을 원자재에 노출시킨다. 시험 표면에 대한 접촉 시간을 미리 결정한 후에 표면과 혈액에 대한 시험을 할 수 있다.

B.3.1 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT; Partial thromboplastin time)

PTT는 재석회화된 구연산염 첨가 혈장에 부분 트롬보플라스틴(partial thromboplastin)을 넣어주었을 때 혈장이 응고하는데 걸리는 시간이다. 부분 트롬보플라스틴은 일반적으로 포유류의 뇌나 폐로부터 나오는 균질한 현탁액이거나, 조직 트롬보플라스틴에서 용출된 인지질 현탁액이다. 표준조건에서 원자재와 접촉했을 때 PTT가 단축되는 것은 접촉면의 혈액응고가 활성화되었음을 나타내는 것이다. PTT가 길어진 것은 혈장내 응고 인자 Ⅰ (섬유소원), Ⅱ (프로트롬빈), Ⅴ, Ⅷ, Ⅸ, Ⅹ, Ⅺ, Ⅻ의 결핍을 암시하지만, Ⅶ 또는 ⅩⅢ 의 결핍을 암시하는 것은 아니다. 헤파린과 기타 항응고제에 의해서도 PTT는 길어진다.

고령토나 규조토와 같이 다양한 활성제를 이용하는 부분 트롬보플라스틴 시약은 시판되는 상품을 이용할 수도 있다. 이들 시약을 이용하는 시험은 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT)이라고 부른다. APTT는 활성제가 의료기기나 또는 의료기기의 부분 원자재가 일으키는 활성을 가리기 때문에 혈액과 의료기기의 상호작용을 체외 평가하는데 유용하지 않다.

B.3.2 프로트롬빈 (Prothrombin)시간(PT)

이 시험은 프로트롬빈 인자와 부속 인자를 측정한다. 조직 트롬보플라스틴이 존재하는 경우, 응고 시간은 프로트롬빈과 인자Ⅴ, Ⅶ, Ⅹ (피브리노겐, 피브린용해성, 항응고제 활성이 정상이라고 가정함)에 의해 좌우된다. 프로트롬빈 시간(PT)이 길어졌다는 것은 일반적으로 프로트롬빈과 인자Ⅴ, Ⅶ, Ⅹ, 또는 피브리노겐의 결핍을 나타낸다. 시험 키트는 시판되는 상품을 이용할 수 있다.

B.3.3 트롬빈 (Thrombin) 시간(TT)

트롬빈 시간(TT)[38]은 트롬빈 용액을 첨가했을 때 혈장이 응고하는데 걸리는 시간이다.  피브리노겐의 결핍(100mg/dl 이하), 피브리노겐의 질적 이상, FDP 또는 헤파린의 수준이 높아진 경우에 트롬빈 시간(TT)은 길어진다. 이 시험은 체내이식형 의료기기를 평가하는 경우에만 유용하다.

B.3.4 혈전 생성

손상되지 않은 응고 시스템에 노출된 원자재는 인지질 존재시(B.3.1 참조) 혈전을 생성하는데 이는 발색성 기질의 전환(conversion of a chromogenic substrate)에 의해 측정할 수 있다. 이 시험방법은 전통적인 응고시험에 비해 변수가 훨씬 적다.

B.3.5 피브리노겐

이섬유소원혈증(dysfibrinogenaemia), 무섬유소원혈증(afibrinogenaemia), 저섬유소원혈증(hypofibrinogenaemia)은 프로트롬빈 시간(PT), 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT), 트롬빈 시간(TT)을 길게 한다.

B.3.6 피브리노겐과 피브린 분해산물(Fibrinogen and fibrin degradatin products; FDP)

정상적인 생리학적 섬유소 분해 과정에서 FDPs X, Y, C, D, E가 혈장농도 2mg/ml 이하로 생긴다. 분해반응 속도는 낮고, 순환계에서 FDPs를 제거하는 속도는 빠르기 때문에 FDP는 낮은 농도로 유지된다. 플라스미노겐(plasminogen)의 활성이 증가되면 피브린과 피브리노겐의 병적인 분해가 일어나 2mg/ml∼40mg/ml 또는 그 이상의 FDP를 만들어낸다. 이 시험은 체내이식형 의료기기를 평가하는 경우에만 유용하다. 시판되고 있는 제품을 사용할 것을 권장한다.

B.3.7 특정 응고인자 검사법

표준조건에서 원자재 또는 의료기기에 혈액을 노출시켰을 때, 응고 인자가 현저하게 감소하였다는 것은(예를 들어, 정상 또는 대조 수준의 50% 이하까지) 그 요소들이 흡착, 응고, 기타 기전에 의해 가속 소모되었음을 나타낸다.

B.3.8 FPA, D-dimer, F1+2, TAT

FPA, D-dimer, F1+2 수준의 상승은 응고 기전이 활성화되었음을 의미한다. FPA와 F1+2는 프로트롬빈이 트롬빈으로 활성화되었음을 나타낸다. TAT 복합체의 증가는 생성된 트롬빈과 순환하는 항트롬빈 사이의 복합체 형성과 혈액응고가 활성화되었음을 의미한다. D-dimer는 F XIII에 의해 가교된 피브린(F XIII cross-linked fibrin; F XIII는 피브린 안정화 인자)이 플라스민에 의해 분해되어 생기는 분해산물이다(응고와 피브린용해). ELISA와 RIA를 사용할 것을 권장한다.

B.4 혈소판과 혈소판 기능

혈소판 현탁액을 준비하는 과정에서는 활성화를 예방하는 것이 중요하다.

B.4.1 혈소판 수치

혈소판의 핵심적인 역할이 출혈을 예방하는 것이므로 혈소판 수치를 측정하는 것은 중요하다. 의료기기나 원자재에 의한 혈액 응고 또는 혈소판 점착과 혈소판 응집 그리고 혈소판 격리(예들 들어, 비장 내에서의)에 의해 의료기기에 노출된 혈액의 혈소판 수치가 현저하게 감소될 수 있다. 순환계에서의 혈소판 제거나 파괴가 가속화되어 체내이식형 의료기기를 사용하는 동안 혈소판 수치가 감소할 수도 있다. 혈소판 수치는 EDTA 현탁 배지를 이용하여 측정한다.

채혈 기법은 재현성이 있어야 한다. 혈소판은 부적절한 채혈을 포함하여 다양한 조건 하에서 지나치게 활성화될 수 있다. 정상적인 혈소판 반응을 입증하는 시험은 일반적으로 응집 측정기(aggregometer)를 이용해 실시한다. 이러한 방법을 이용하면 반응이 감소된 혈소판 표본을 쉽게 검출할 수 있으나 지나치게 활성화된 혈소판은 정상적으로 검출되지 않는다. 혈소판이 원자재나 의료기기에 노출된 후에 과활성화된 경우에는 혈소판 응집 시험을 변경시켜서(혈소판 또는 응집제의 농도를 적절하게 낮추어서) 이를 측정할 수 있다.

B.4.2 혈소판 응집

지속적으로 교반한 PRP(platelet rich plasma)에 응집제(예들 들어, ADP, 에피네프린 [epinephrine], 콜라겐 [collagen], 트롬빈 [thrombin] 등등)를 첨가하여 혈소판 응집을 유도한다. 혈소판 응집될수록 혈장은 점점 더 맑아진다. 광학 시스템(응집측정기)은 광 투과의 변화를 검출하는데 사용되고, 기록계는 도식적으로 기준선으로부터 광 투과가 변한 정도를 나타낸다. 입자성분, 증가된 FDP 또는 특정한 약품 (예들 들어, 아스피린, 비스테로이드성 항염증제)의 방출과 혈소판 활성화에 의해 혈소판 응집이 지연되거나 또는 감소될 수 있다. 혈소판 응집은 이용하는 약품에 따라 다양하게 나타나거나 또는 일부 동물 종에서는 나타나지 않을 수 있다는 사실에 주의하여야 한다. 작용물질을 첨가하지 않아도 일어나는 자연 발생적인 혈소판 응집은 혈소판의 활성화를 의미하는 비정상적인 상태이다. 혈소판 응집은 또한 WU/HOAK 방법으로도 자동 선별할 수 있다.

B.4.3 혈액세포점착

혈액세포점착은 말초부위 색전 또는 하나 이상의 혈액학적 인자 활성화의 증거와 관련하여 원자재의 혈액적합성을 측정하는 것이다.

Kuniki K-score와 같이 표면에 대한 세포의 점착을 측정하는 다양한 방법들이 설계되어 왔다. 이 방법들의 대부분은 통제된 흐름이나 압력 조건에서 유리 비드 컬럼(a column of glass beads)을 통과하면서 정상적 전혈에서 제거되는 혈소판의 특정 비율을 관찰하는데 기초한다. 이 원리는 유리 비드에 코팅된 중합체에 대한 기타 혈액세포의 정량에 적합하도록 변형되어왔다. 이런 방법으로 연구한 결과 폴리(수산화에틸 메타크릴레이트)[poly(hydroxyethylmethacrylate); PHEMA]로 코팅된 비드에 대한 개과 종의 말초 림프구와 다형핵 백혈구(PMNs)의 점착은 폴리스티렌(polystyrene)과 기타 중합체로 코팅된 비드에 대한 점착보다 낮은 것으로 보고되고 있다. 이 연구에는 고립성 림프구와 다형핵 백혈구(PMNs)가 이용되었다.

다른 방법으로 시험 표면에 대한 혈소판 점착을 직접 측정하는 방법이 있다. 표준화된 조건 하에서 PRP(platelet rich plasma)나 혈액에 시험표면을 노출 시킨 다음 점착되지 않은 세포를 씻어내어 제거한 후, 표면을 고정시키고, 주사 전자 현미경이나 광학 현미경 검사를 위한 준비를 한다. 단위 면적당 점착 혈소판의 수치를 직접 측정하고, 형태(예들 들어, 확산된 양, 응집 형성의 정도)를 기록한다. 51Cr(크롬)이나 111 In(인듐)으로 사전 표지한 혈소판을 대신 이용할 수도 있다.

B.4.4 혈소판 활성화

특정한 원자재나 의료기기를 이용하는 경우 그로 인해 혈소판이 활성화될 수 있다.

어떤 원자재 또는 의료기기를 사용하면 혈소판 활성화를 유발할 수 있고, 이는 다음의 결과를 나타낼 수 있다.

1) 혈소판 인자 4(PF 4), 세로토닌(serotonin) 그리고 BTG (베타 트롬보글로블린[Beta thromboglobulin])과 같은 혈소판 과립체의 방출

2) 변형된 혈소판 형태

3) 혈소판 미립자의 생성

활성화된 혈소판은 혈전형성성(pro-thrombotic)이다. 혈소판 활성화는 다양한 방법으로 측정할 수 있다. ; 원자재나 의료기기에 점착된 혈소판의 형태에 대한 현미경 (광학 현미경과 전자 현미경)검사, BTG, PF4, 세로토닌의 측정 및 유세포 분석기(Flow cytometry)를 이용한 혈소판 활성화 평가(미립자 생성 측정, P-selectin 발현 측정, 또는 단클론 항체를 이용하여 활성화된 글리코프로테인lb 및 llB/llla 발현 측정). 활성화된 혈소판의 다른 에피톱(epitope)들은 두 개의 항체를 사용하여 유세포 분석기(Flow cytometry)에 의해 인식된다: 하나는 혈소판(GPlb or GP llb/llla)에 대해 특이적이고, 또 하나는 혈소판 활성(P-selectin)에 대해 특이적이다.

B.4.5 템플레이트 출혈 시간 (TBT: Template bleeding time)

표준 조건 하에서 표준 깊이와 길이로 피부를 절개하는데 멸균한 1회용 기구를 상업적으로 이용할 수 있게 되면서 이러한 시험의 유용성과 재현성이 현저하게 향상되었다. 출혈 시간이 길어졌다는 것은 혈소판 기능의 감소나 혈소판 수치의 감소를 나타낸다.; 혈소판 수치는 독립적으로 측정할 수 있다 (B.4.1 참조). 제한적으로 인체에 접촉하는 몇몇 체내․외 연결형 의료기기(external communicating devices; 예를 들면 심폐 우회로 관련 의료기기)와 관련하여 혈소판 수치가 정상임에도 출혈시간이 길어지는 것이 관찰되어왔다. 이 시험은 몇몇 실험동물에 사용하기에 적합하다. 체외 출혈시간 측정도 적절하다.

B.4.6 혈소판 기능 분석

전형적인 템플레이트 출혈 시간은 자동화된 방법을 위한 원리로 이용되어 왔다. 구경이 150 ㎛인 콜라겐 필터를 통해 전혈을 흡입한다. 흡입이 완료될 때까지 혈소판은 점착되고, 응집된다. 혈압과 온도가 표준화되고, 항응고요법(anticoagulation)는 이 시험에 영향을 미치지 않는다. 동물의 혈액을 이용하는 경우 적합한 시험방법이다.

B.4.7 방사선 표지 혈소판의 감마 영상

이 시험을 위하여 감마선 방출이 높은 111In(인듐)을 이용할 수 있다. 본 방법을 통해 혈소판이 침착된 의료기기의 부위와 침착된 양을 측정할 수 있다. 체내․외 연결형 의료기기(external communicating devices)뿐만 아니라 체내이식형 의료기기에도 유용한 시험법이다.

B.4.8 혈소판 수명 (잔존 혈소판)

환자의 혈액에서 혈소판을 채취한 후 51Cr이나 111In으로 표지를 한다. 검체에 존재하는 모든 연령(ages)의 혈소판에 표지하는 이 두 시약은, 혈소판으로부터 지나치게 녹여서 분리하지 않고, 다른 세포에 흡수되거나 혈전형성에 재사용되지 않는다. 수명 연구와 연관된 국소적 혈소판 점착을 평가하는데 있어 111In(인듐)은 체표면 수치를 측정할 수 있고, 보다 적은 수의 표지 혈소판을 필요로 하며, 강력한 감마방사체라는 장점을 지니고 있다. 혈소판 수명의 감소는 면역, 혈전 또는 기타 과정에 의해 순환계로부터 제거되는 속도가 가속화되었음을 의미한다.

B.5 혈액학

B.5.1 백혈구

L-selectin과 CD11b와 같이 증가된 백혈구 표지자를 평가하고, 백혈구 아집단(subgroup) 내의 교란을 정량적으로 평가하기 위하여 유세포 분석기를 이용하고, 활성화된 백혈구 또는 의료기기 표면을 현미경으로 검사하여 백혈구 활성을 측정한다.

B.5.2 용혈성

이는 증가된 혈장 헤모글로빈 수치로 인해 특히 중요한 선별 시험으로 간주된다. 만일 이 시험이 적합하게 수행되면, 증가된 혈장 헤모글로빈 수치는 용혈을 의미하며, 이는 의료기기와 원자재에 접촉 하는 적혈구 막의 취약성을 반영한다(부록 C 참조).

B.5.3 망상 적혈구 수치

증가된 망상 적혈구 수치는 골수에서 적혈구의 생성이 증가되었음을 의미한다. 이는 만성적인 혈액 손실 (출혈)이나 용혈 또는 기타 기전에 의해 적혈구 양이 감소된 결과일 수 있다.

B.6 보체계 - CH50과 C3a, C5a, TCC, Bb, iC3b, C4d, SC5b-9

CH50의 감소는 전체 보체 소비량의 지표이다. 이들 보체 성분의 수준 상승은 보체계가 활성화되었음을 의미한다. 일부 원자재는 보체를 활성화 시키고, 활성화된 보체 성분은 백혈구를 활성화 시키며, 이로 인해 폐에서 보체 성분들을 응집시키고 격리시킨다.

체외 시험 후에 보체 분해 산물을 측정하면, 종 특이성과 기선 수준(baseline level)이 높다는 단점이 있다. 전형적인 CH-50 방법은 사람, 소, 돼지 그리고 토끼의 혈청에 유용한 것으로 나타났다.

체외 보체 활성 측정에 대한 또 다른 기능적 방법은 기질 전환법으로 측정되는 C3-전환 효소나 C5-전환 효소의 보체 생성이다.

부록 C

(참조)

의료기기와 의료기기 구성 성분의 용혈성에 대한 평가

C.1 일반적 고려 사항

혈액과 의료기기의 상호작용에 관한 논문은 광범위하게 존재하고 있다. 그러나 신뢰할 만하고, 재현 가능하며, 임상적 성능을 예측하는 방법은 소수에 지나지 않는다. 본 부록은 이미 알려져 있는 용혈성 시험방법을 검토하고, 의료용 및 치과용 원자재와 의료기기의 특성을 규명하기 위한 시험방법의 요건과 관련된 요소들을 논의하고자 한다.

C.2 용어 및 정의

본 부록에서는 다음의 정의를 적용한다.

C.2.1 항응고제

혈액 응고를 지연시키거나 예방하는 약품

예) 헤파린 또는 구연산염

C.2.2 교질 삼투압, 콜로이드 삼투압

단백질 또는 분자량이 큰 물질이 혈장의 삼투활성에 미치는 총체적 영향

C.2.3 적혈구 용적

주어진 검체의 전혈 중 적혈구의 용적율

C.2.4 용혈(haemolysis)

세포막이 파괴된 적혈구 또는 부분적으로 손상되었으나 세포막은 그대로인 적혈구에서 헤모글로빈이 유리되는 것

C.2.5 음성 참고 물질(negative reference material)

고밀도 폴리에틸렌 또는 유사한 것으로 검증된 대체물질

C.2.6 농축 적혈구(packed erythrocytes)

1단위의 혈액을 원심분리하고 혈장 상층액을 제거한 후 얻은 성분

주) 수혈에 관한 적혈구의 특성 : 성분의 적혈구 용적율은 0.65에서 0.80이다. 농축 적혈구 1단위에는 원래혈액 1단위의 적혈구 전체가 들어있고, 백혈구의 대부분이 들어있으며(약 2.5~3.0 × 109 개), 혈소판의 양은 원심분리 방법에 따라 다양하게 들어있다.

C.2.7 세척 적혈구(washed erythrocytes)

전혈에서 혈장을 제거하고 등장액으로 세척한 후 얻은 적혈구 현탁물

주) 세척 적혈구는 혈장과 백혈구 그리고 혈소판을 대부분 제거한 후 얻은 적혈구 현탁물이다. 잔류 혈장의 양은 세척 방법에 의해 좌우된다. 세척 이후 보관 기간은 가능한 짧아야 하며, 1~6℃ 에서 24시간을 넘기지 않도록 한다.

C.2.8 전혈(whole blood)

선정된 기증자로부터 유래한 혈액으로, 항응고제인 헤파린이나 구연산염을 함유하고 있는 분리되지 않은 혈액

C.3 용혈의 원인

C.3.1 기계적 힘 - 압력

적혈구 막은 반투막이다. 농도가 다른  두 용액이 반투막에 의해 분리되어 있을 때 압력의 차이가 발생한다. 막이 수동 수송에 대해 불투과성일때 삼투압이 생긴다. 압력의 차이는 유리된 헤모글로빈의 방출과 함께 적혈구 팽창과 세포막 파열을 유발한다.

C.3.2 기계적 힘 - 유동학 (레올로지; Rheology)

혈액의 유속, 전단력, 기타 힘에 영향을 주는 요소로 적혈구 막을 변형시켜 파열을 유발할 수 있다.

C.3.3 생화학적 인자

분자 수준에서의 막 구조 변경으로 적혈구 막의 탄력 특성과 강도가 변할 수 있다. 영양소나 대사 에너지(ATP)의 결핍은 원반 형태로 미세 소수포를 가지고 있는 헤모글로빈의 손실을 유발할 수 있다. 기타 화학물질, 세균 독소 그리고 pH와 온도에 의해 유도되는 대사 변화 등에 의해 적혈구 막이 손상될 수도 있다. 이런 변화는 예상한 삼투압보다 낮은 삼투압에서 막을 파열시킬 수 있다. 적혈구 막이 파열되는(삼투압 취약성) 압력을 측정하기 위한 시험을 실시하여야 한다.

C.4 용혈의 임상적 중요성

C.4.1 독성 효과

자유 혈장 헤모글로빈의 수준이 높아지면 신장이나 또는 기타 기관에 스트레스를 줄 수 있는 진행이 시작되거나 독성 효과가 유도될 수 있다. 자유 혈장 헤모글로빈(free plasma haemoglobin)의 농도는 적혈구의 손상을 측정하기에도 편리할 뿐 아니라, 기타 혈액 성분 손상의 간접적 지표가 되기도 한다.

C.4.2 혈전증(Thrombosis)

혈관 내 용혈은 인지질을 유리시켜 혈전을 촉진할 수 있다. 용혈로 인해 임상적으로 적혈구 수치가 현저하게 떨어지는 경우에는 뇌와 기타 기관 또는 조직에 영향을 줄 수 있는 빈혈과 산소운반능력 감소현상이 발생한다.

C.5 용혈에 대한 적합/부적합 평가 결정

용혈은 표면 에너지, 표면 형태 그리고 표면의 화학적 성질과 같은 물질의 특성과 시간의 작용이다. 용혈은 또한 전단력, 세포벽 상호작용, 흡수된 단백질 층의 특성, 흐름 안정성, 공기유입(air entrainment), 혈액의 출처․수명․화학적 변수에 의한 작용이기도 하다. 이런 변수들은 원자재와 의료기기 사이의 잠재적 용혈성을 비교하기 위하여 적절하게 조절되어야 한다. 용혈을 평가하기 위한 방법의 범위는 단순한 모델에서 고도로 복잡한 모델까지 다양하다. 흐르는 혈액에 대한 특정 체외 평가모델 및 체내 평가모델이 알려져 있다. 잠재적 용혈성은 절대적 측정보다는 특정 시험실에서 동일한 모델로 시험하여 의료기기 또는 원자재를 상대 비교한다. 체내 조건 하에서는 측정할 수 없는 매우 낮은 수준의 혈장 헤모글로빈의 양을(예들 들어, 혈장 헤모글로빈이 합토글로빈[haptoglobin]과 결합되거나 인체에서 급속히 제거되는 경우) 체외 시험방법으로 측정할 수 있다. 또한 체내 시험 환경에서 용혈을 나타내는 지표로써 유산염(lactate) 탈수소 효소와 합토글로빈의 측정을 고려할 수 있다.

모든 의료기기의 이용과 관련해 허용될 수 있거나, 허용될 수 없는 용혈의 보편적인 양을 규명하는 것은 불가능하다. 의료기기가 용혈에 미치는 영향은 외과적 시술에서의 외상에 의해 단기간에 가려질 수 있다. 의료기기는 상당한 양의 용혈을 일으킬 수 있지만, 생명에 치명적인 상황에서 가능한 유일한 조치이다. 직관적으로, 혈액 적합성인 원자재는 비용혈성이다. 사실상 많은 의료기기가 용혈을 일으키지만, 이들 의료기기의 임상적 혜택은 용혈과 관련된 위험성을 능가한다. 따라서 의료기기가 용혈을 일으키는 경우에는 의료기기가 제공하는 임상적 혜택과 임상적으로 허용될 수 있는 용혈의 한도를 확실하게 하는 것이 중요하다. 허용 기준은 위험성과 혜택 평가의 일정 형식을 바탕으로 정당화되어야 한다. 다음의 질문들이 그러한 평가를 위해 제안된다.

1) 환자에게 얼마동안 의료기기를 노출 시키는가?

2) 원자재나 의료기기가 일으키는 용혈 정도는? 의료기기가 환자에게 노출되어 있는 시간 내내 계속해서 용혈을 일으키는가? 의료기기를 제거한 후에도 용혈이 지속되는가?

3) 치료조건에 대해 이용할 수 있는 다른 방법들의 혜택과 위험성은 무엇인가?

4) 알려진 치료법의 용혈 특성은 무엇인가? 문제의 의료기기와 다른 치료법을 비교하는 방법은 무엇인가?

5) 시험 의료기기는 다른 형태의 치료법과 비교하여 얼마나 효율적인가? 보다 효율적인 의료기기가 사용하는 동안 더 많은 용혈을 유발할 수도 있지만, 이런 추가적인 효율성은 환자에게 보다 큰 혜택을 제공할 수도 있다.

C.6 용혈성 시험 - 일반적 고려 사항

C.6.1 방법

C.6.1.1 일반사항

적혈구의 손상을 평가하기 위하여 체외 시험을 이용한다. 직접적 방법은 적혈구와의 화학적, 물리적 상호작용에 의한 용혈을 측정한다. 간접적 방법은 시험검체의 용출액에 의한 용혈을 측정한다. 이외에도 의료기기의 구조 및 사용목적에 따른 영향, 그리고 혈액 역학적 요소를 평가하기 위해 동적 시험을 고려하여야 한다.

가장 간단한 형태로, 많이 희석된 적혈구 현탁액과 시험원자재가 접촉을 하는 경우 (시험 시작 시에 측정할 수 있는) 총 헤모글로빈에 대한 상청액에 유리된 헤모글로빈의 비율로 기록한다[즉, (유리된 헤모글로빈 농도/총 헤모글로빈 농도) × 100%]. 만일 시험의 시작 단계에 존재하던 모든 적혈구가 파괴되면, 용혈성이 100%이다. 많이 희석한 적혈구 현탁액을 의료기기 시험에 사용할 수 없는 경우에는, 용혈지수의 표준화에 있어서 적혈구용적률(haematocrit)과 기타 요소들을 설명하여야 한다.

각각의 실험에서는 최소한 전혈 헤모글로빈 농도와 혈장 헤모글로빈 농도 또는 상청액 헤모글로빈 농도를 측정할 수 있어야 한다. 혈장에 있는 헤모글로빈의 농도는 전혈 헤모글로빈 농도보다 훨씬 적다. 전혈 헤모글로빈의 정상 범위가 11000mg/dl에서 18000mg/dl 인 반면에 유리된 혈장 헤모글로빈의 체내 농도는 일반적으로 0mg/dl 에서 10mg/dl이다. 이런 이유로 용혈 시험을 실시하는 동안 나타나게 되는 광범위한 헤모글로빈 농도를 측정하기 위하여 다양한 방법들을 이용되어 왔다.

관행에 따라, 세 가지 분석 방법을 혈액 헤모글로빈 (Hb) 농도를 측정하는데 이용해 왔다.

주) 연구자들은 의료용 원자재나 용액에 들어 있는 화학물질이 적혈구 취약성을 변경시키고(예들 들어, 포름알데히드 또는 글루탈알데히드와 같은 정착제에 의해), 헤모글로빈을 침전시키거나(예들 들어, 구리 또는 아연 이온에 의해) 헤모글로빈의 흡수 스펙트럼을 변경시킬 수 있는(예들 들어, 폴리에틸렌글리콜 또는 에탄올에 의해) 부작용을 일으킬 수 있음을 인식하여야 한다.

C.6.1.2 전혈 헤모글로빈 농도 측정

C.6.1.2.1 시안메트헤모글로빈 (Cyanmethaemoglobin) 방법

첫 번째로 전형적인 방법인 시안메트헤모글로빈 검출법은 ICSH(International Committee for Standardization in Haematology)에 의해 발표되었다. 시안메트헤모글로빈 (헤모글로빈시아나이드; HiCN) 분석법은 1차 참조 표준 (HiCN)을 이용할 수 있으며, 자동화되어 쉽고, 편리하다는 것이 장점이다. 이 방법은 Hb를 산화시켜 540nm에서 넓은 흡광영역을 가지는 헤모글로빈시아나이드를 형성하는 것이다. 세정제와 같은 적혈구 용혈제를 이용하여 적혈구에서 Hb를 방출시키고, 단백질 침전에 의한 혼탁도 (540nm에서의 유사 흡광을 나타내어 간섭을 일으키는 원인)를 감소시킨다. 총헤모글로빈 농도의 경우, 혈장으로 인한 스펙트럼 간섭이 가장 적으며, 검체의 흡광도를 HiCN 표준 용액과 직접 비교할 수 있다.

이 범위 내에서 HiCN의 흡광 영역이 넓기 때문에 수동 또는 자동 검출용 협대역 분광 광도계뿐만 아니라 단순한 필터형 광도계도 이용할 수가 있다. HiCN 참조 표준을 이용하면 이 방법을 이용하고 있는 모든 시험실 간에 비교가 가능하다. 시아나이드 용액을 이용하는 경우 가장 큰 단점은 잠재적으로 인체에 위해할 수 있다는 것이다. 시아노 시약들은 독성의 노출 경로가 다양할 뿐만 아니라 산성화 되어 HCN을 방출한다. 또한 시약과 제품의 폐기에 상당한 주의를 기울여야 하고 많은 비용이 필요하다.

C.6.1.2.2 산화헤모글로빈 (Oxyhaemoglobin) 방법

총헤모글로빈 농도를 측정하는 두 번째 전형적인 방법은 오늘날 그다지 널리 사용되지 않고 있다. 산화헤모글로빈 방법은 수산화암모늄을 처리하는 동안 형성되는 HbO2를 분광광도계로 검출하는 것이다. 또한 희석한 탄산나트륨 용액에서 산화헤모글로빈을 정량하는 방법이 이용되기도 하였다. 안정적인 참조 물질을 이용할 수는 없으나, 원래 검체의 총 헤모글로빈이 혈장에도 존재하는 비율이 측정에 필요한 전부이기 때문에 이는 중요하지 않다. 어느 경우든 단기 표준은 신선한 혈액 검체에서 준비하여야 한다.

C.6.1.2.3 철분 농도 측정법

총 헤모글로빈의 농도를 측정하는 세 번째 전형적인 방법은 용액의 헤모글로빈 철분 농도를 측정하는 것이다. 먼저 일반적으로 산이나 회화법(ashing)을 이용하여 Hb에서 철분을 분리시킨 다음에 광도를 측정할 수 있도록 색상을 발현시키기 위하여 삼염화티타늄(TiCl3)또는 시약과 합성한 삼염화티타늄으로 적정한다. 본 방법은 일상적인 연구에 이용하기에는 너무 복잡하기 때문에 거의 이용되지 않고 있다.

C.6.1.3 혈장 또는 상청 헤모글로빈 농도 측정법

C.6.1.3.1 직접 광학 기법과 부가적인 화학적 기법

수많은 다양한 요인들 (예들 들어, 전통, 사용의 용이함, 폐기 화학물질의 처리, 표준 용액의 이용가능성)로 인해, 현재 용혈에 대한 지표로 혈장 헤모글로빈을 측정하는 데에는 약 20개의 방법이 이용되고 있다. 그러나 그 중 어느 방법도 폭넓게 인정받지는 못하고 있다. 평가 방법은 두 개의 커다란 범주로 분류될 수 있다. 하나는 직접 광학 기법 (즉, 미분 분광 광도계[derivative spectrophotometry]를 이용하거나 직접적으로 415, 541 그리고 577nm에서 산화헤모글로빈 흡광 피크를 측정하는 것을 이용하는 방법)이며, 다른 하나는 부가적인 화학적 기법 (즉, 벤지딘 같은 발색제나 과산화수소와 같은 시약들과의 화학적 상호작용 또는 시안메트헤모글로빈의 형성을 근거로 헤모글로빈을 정량하는 방법)이다. 모든 분석은 수동이나 자동으로 실행할 수 있다.

헤모글로빈의 농도를 측정하는데 가장 널리 이용되고 있는 방법은 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidene)과 같은 벤지딘 유도체의 산화에서 과산화수소에 의한 촉매 작용을 근거로 하고 있다. 착색된 산출물 (600nm에서 흡광도 측정법으로 측정되는)의 형성 비율은 헤모글로빈의 농도와 정비례한다. 이 방법의 장점은 자동화되어 있어 용이하며(상업적 장비), 잠재적 독성을 제거하고 환경적으로 불안전한 시아노 시약들을 사용하지 않으며, 1차 참조 표준인 HiCN에 대응하여 Hb 표준세트를 이용할 수 있다는 것이다. 평가의 측정 한도 (5.0 mg/dl 정도로 낮은 측정한도)는 헤모글로빈 시아나이드 방법과 유사하다. 주요 단점은 벤지딘 염료를 이용하기 때문에 건강에 대한 잠재적 위험이 여전히 있으며, 시약과 산물의 폐기에 비용이 많이 든다는 점이다. 더욱이 이 방법의 동적 범위는 낮은 것 (5 mg/dl에서 50mg/dl)으로 보고되고 있고, 칼슘 킬레이트 항응고제 (예들 들어, 구연산염, 수산염, EDTA), 알부민, 또는 과산화수소의 산화에 간섭을 일으킬 수 있는 기타 비특정 혈장 성분에 의해 반응 억제가 일어날 수도 있다(40%정도).

이러한 이유들로 인해, 하보(Harboe), 크립스 (Cripps) 또는 타우리어 (Taulier)가 제시한 비교 가능한 민감도 및 재현성을 가진 방법들과 같은 직접 광학 방법이 대체방법이 될 수 있다. 그러나 앞에서 언급했던 바와 같이 헤모글로빈과 스펙트럼에 화학적으로 유도된 변형이 생기면 일부 헤모글로빈에 대한 평가가 무효화될 수도 있다. 더욱이, 혈장 배경간섭(background interference)은 헤모글로빈의 스펙트럼도 변형시킬 수 있기 때문에 이를 보정할 필요가 있다. 연구자는 혈장 헤모글로빈 평가에서 이러한 한계를 인식하고, 적합한 기법을 이용하고 있는 지의 여부를 확인하여야 한다. 여기에는 시험 상청액에 침전물의 존재여부를 평가하는 것과 검출된 광학 스펙트럼(예들 들어, 400nm에서 700nm)을 분리된 산화헤모글로빈의 광학 스펙트럼과비교하는 것이 포함된다.

C.6.1.3.2 면역네펠로메트릭 (Immunonephelometric) 방법

면역네펠로메트릭 방법의 근거는 상업적으로 이용 가능한 항체를 이용하여 네펠로메트리(nephelometry) 장치로 혈장 헤모글로빈을 측정하는 것이다. 이 방법은 일상적인 검사를 위한 것이며, 광학기법과 유사하고 상관관계가 좋은 방법이다.

C.6.2 혈액과 혈액 성분 보관

이 항에는 미국 혈액 은행 협회(American Association of Blood Banks)와 유럽 이사회(Council of Europe)가 인증한 사람의 혈액을 보관하는데 가장 좋은 방법이 제시되어 있다. 일반적으로 원자재와 의료기기는 임상적으로 적용될 때의 조건(예들 들어 적절한 항응고제 선택, 최소한의 혈액방부제 사용, 적합한 혈액 pH)을 모방하고 있는 혈액을 사용하여 시험하여야 한다.

항응고 용액은 채혈 시 응고를 방지하고, 일정기간동안 적혈구의 보관을 위하여 개발되었다. 이 용액들은 모두 구연산나트륨, 구연산 그리고 포도당을 함유하고 있고, 일부 용액들은 추가적으로 아데닌, 구아노신, 만니톨, 자당(sucrose), 소르비톨 그리고/또는 인산염을 함유하고 있다. 헤파린은 혈액보관에는 사용되지 않지만, 종종 임상에서 의료기기에 노출되는 환자들을 위한 항응고제로 사용된다.

구연산은 칼슘과 결합하여 혈액의 응고를 방지한다. 적혈구는 저장되는 동안 포도당을 대사 시킨다. Embden-Myerhoff 혐기성 해당과정(anaerobic glycolysis cycle)을 거쳐 대사된 각각의 포도당으로 인해 ADP가 인산화(phosphorylation)되어 ATP 두 분자를 생성한다. ATP분자는 적혈구가 막 수송 기능 및 막 탄력성을 유지하는데 필요한 에너지를 보충해준다. 이런 기능들을 위해 필요한 에너지는 ATP가 ADP로 전환되면서 방출된다. 보관 기간을 연장하기 위해서는 항응고액에 구연산을 첨가하여 알칼리성을 유도하여야만 한다. 이는 4℃에서 적혈구를 보관하기 시작할 때 고농도의 수소 이온을 적절하게 제공하기 위함이다. 보관 기간 동안에 산도가 증가하면 해당율(rate of glycolysis)은 감소된다. 아데노신 뉴클레오티드 (ATP, ADP, AMP)는 보관 기간 동안 고갈되는데, 항응고액에 아데노신을 첨가하면 대체 AMP/ADP/ATP가 합성될 수 있다.

적혈구 농축액이 마련되면 포도당과 아데닌의 상당 부분은 혈장에 의해 제거된다. 세포가 과도하게 농축되지 않는 경우에는 혈장을 제거하여야만 적혈구의 충분한 생존력이 유지될 수 있다. 보통의 CDP (citrate phosphate dextrose) 아데닌 적혈구 농축물의 적혈구 부피율은 0.80보다 크지 않아야 한다. 혈장의 90%이상이 제거된다고 하더라도 현탁 배지나 첨가 배지를 추가하면 적혈구의 생존력을 유지시킬 수 있다. 세포막을 안정화시키고, 용혈을 방지하지하기 위해서는 만니톨이나 자당을 이용하는 반면에 생존력을 유지하기 위해서는 염화나트륨, 아데닌, 그리고 포도당이 필수적이다.

혈액 생성물을 보관하기에 적합한 용기는 혈액 생성물의 질을 측정하는 다양한 방법으로 평가되었다. 적절한 항응고제가 들어있는 혈액 생성물 용기는 정적인 조건 하에 1℃∼6℃ 사이의 온도에서 똑바로 세워 보관한다. 미리 정한 시간 간격마다 보관된 생성물의 질과 생존력을 평가하기 위하여 무세포(cell-free) 혈장 헤모글로빈의 양을 측정한다. 일주일에 한 번씩 가볍게 섞어주면 보관된 생성물의 질이 향상될 수 있다. 혼란을 일으키는 다른 요인들이 없는 경우에는 용기에 보관하는 것에 대한 평가는 간접적으로는 적혈구 대사로 생긴 이산화탄소를 내보내는 용기의 투과성을 평가하는 것이다.

C.6.3 혈액을 취급하는 사람들의 보호

앞서 쓰여진 과정들은 잠재적으로 오염되어 있을 수 있는 사람의 혈액을 채혈하고, 취급하며 연구하고 있는 사람들을 위하여 필수적인 것이다. 잠재적으로 오염됐을 수 있는 원자재에는 혈액/ 체액/ 생성물들과, 혈액 또는 체액과 접촉을 했거나 또는 하고 있는 장치, 그리고 혈액 유래 감염을 일으키는 미생물 배양에 사용된 물질이 포함된다.

C.6.4 채혈(정맥 절개)

정맥을 절개한 피부 표면이 100% 무균임을 보증하는 것이 불가능하다고 하더라도, 정맥 절개 부위를 준비하는 것과 관련된 엄격하고 표준화된 과정이 있어야 한다. 특히 정맥 천자에 앞서 피부 표면을 건조하게 하기 위하여 살균용액을 사용하고, 정맥 절개용 바늘을 삽입하기 이전에 피부 표면에 더 이상의 접촉이 없도록 하는 것이 중요하다.

세균에 의한 오염을 방지하기 위하여 밀폐 용기 시스템 (즉, 공기가 들어가지 않는 것)이 가장 널리 이용되고 있다. 바늘을 뺀 후에는 검체를 담은 용기의 고무마개에 있는 바늘구멍을 완전히 밀봉시켜야 하며, 그렇지 않은 경우에는 냉각을 시킨 이후에 부분적으로 진공 상태를 만들어 오염된 공기를 빼내도록 한다.

주) 진공관을 이용하는 경우에는 약간의 용혈이 일어날 수도 있다.

오픈된 시스템에서 채혈을 하는 경우에는 공기 중에 노출되어 오염이 될 수 있어 무균 상태로 간주되지 않는다. 세균에 의한 오염은 용혈을 일으키는 것으로 알려져 있다.

C.6.5 종의 선정

가장 이상적인 용혈 시험은 사람의 적혈구를 가지고 실시하는 것이다. 그러나 몇몇의 요인들로 인해 사람의 적혈구로 시험 하는 것은 어렵거나 불가능하다. 일부 국가들에서는 사람 혈액의 공급을 제한하고 있으며, 혈액은 사람에게 수혈을 하기 위해서만 보관하여야 한다. 동물과 사람 기증자의 건강에 대한 기준도 또한 고려되어야 한다. 모든 혈액의 ‘보존 기간’은 한정되어 있으므로, 적시에 사람의 혈액 세포를 얻는다는 것이 한층 어려울 수 있다. 동물의 적혈구를 사용하는 경우에는 동물 종들 사이에서도 막 안정성이 서로 다르기 때문에 전체 헤모글로빈 성분을 얻기 위하여 100% 용혈을 보증하는데 주의를 기울여야 한다. 음성 대조군이 최소한의 용혈을 일으켜야 시험원자재의 활성이 감추어지지 않는다. 토끼와 사람의 적혈구 용혈 특성은 유사한 것으로 보고된 반면에, 원숭이의 적혈구는 보다 민감하며, 기니피그의 적혈구는 보다 덜 민감한 것으로 보고되어 있다.

C.6.6 용혈성에 대한 평가 - 혈액 또는 혈액 성분에 대한 체외 노출, 체내․외 순환 노출, 체내 노출

체외 노출, 체내․외 순환 노출, 체내 노출조건으로 의료기기 또는 원자재를 노출시켜 용혈성을 평가할 수 있다. 체외 조건은 의료기기뿐만 아니라 원자재를 평가하는데도 이용한다. 하나 이상의 원자재를 함유하고 있는 의료기기는 체내․외 순환 조건 및 체내 조건을 이용하여 평가한다.

체내 또는 체내․외 순환 평가는 동물 모델이나 임상 시험을 하는 동안 가능하다. 다음에 따라 시험을 설계하는 경우에는 정당성을 입증할 수 있다. 첫째, 허용된 용혈 수준을 가지고 있고 판매되고 있는 의료기기를 참조 대조군으로 하여 시험 의료기기와 비교한다. 두 번째, 임상적으로 유의한 용혈의 결과로 시험 대상을 평가한다.

체내 또는 체내․외 순환 시험의 목적은 의료기기의 잠재적 용혈성을 규명하는 것이다. 선행 연구로 체외 시험을 시행할 수 있고, 신선하거나 시일이 지난 사람의 혈액 또는 사람이외의 종의 혈액을 이용할 수 있다. 체내에 사용될 의료기기와 관련된 일반적인 방법은 임상적 용도를 모방한 조건을 이용하여 혈액을 의료기기를 통해 재순환시키는 것이다. 이런 조사 후에 체내․외 순환 모의시험을 시행하는데, 체내․외 순환 모의시험은 동물모델에서 몇몇 의료기기에 대해 시행하거나, 제한되고 통제된 조건으로 사람에게 시행하여야 한다. 의료기기의 크기와 용도는 시험의 설계에 영향을 준다.

C.6.7 직접 접촉 방법 대 간접 접촉 방법

이용해야 하는 용출 조건은 제11장(ISO 10993-12)에 요약되어 있다. 일부 시험방법은 적혈구와 직접 접촉을 하는 의료기기를 평가하는 반면에 이외의 방법들은 적혈구에 노출되는 용출액의 준비를 설명하고 있다. 사용하게 될 조건과 의료기기 자체를 근거로 시험방법을 선정하여야 한다. 상승된 온도를 이용하는 경우에 고려하여야 하는 한계 조건은 제11장(ISO 10993-12)에 요약되어 있다.

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제8장 잠재적 분해산물의 확인과 정량을 위한 체제

(관련규격: ISO 10993-9:2009)

1 적용범위

본 장은 생분해 시험의 실행과 설계 그리고 의료기기에서 관찰된 생분해 및 생분해 잠재성을 체계적으로 평가하기 위한 기본 원리를 제시한다. 이러한 시험에서 얻은 정보는 「의료기기 생물학적 안전에 관한 공통기준규격」에 제시된 생물학적 평가에 사용될 수 있다. 본 장은 비흡수성 및 흡수성 원자재에 대하여 설명한다.

다음과 같은 경우에는 본 장을 적용하지 않는다.

1) 기계적 과정에 의해 생성되는 분해산물에 대한 평가; 가능한 경우, 이러한 유형의 분해산물의 생성에 관한 방법은 개별 기준규격(specific product standards)에 설명되어 있다.

주 1) 기계적 분해는 일반적으로 미립물질을 생성시킨다. 이 부분이 본 장의 적용 범위에서 제외되기는 했지만, 이러한 분해산물은 생물학적 반응을 일으킬 수 있으므로, 본 규격의 다른 장에 설명된 대로 생물학적 평가를 실시할 필요가 있다.

2) 분해 산물이 아닌 용출 성분(leachable components)

3) 환자의 신체에 직․간접적으로 접촉하지 않는 의료기기 또는 성분

주 2) 본 장은 「의료기기 생물학적 안전에 관한 공통기준규격」제1장의 정의에 포함되는 제품에 사용된 원자재의 분해에 적용할 수 있다. 물론 이러한 제품들은 조직공학제품(tissue engineered medical product)의 지지체(scaffold) 또는 약물이나 생물제제를 전달하는 운반 매트릭스(carrier matrix)에 적용되는 규정과는 다른 규정을 따른다.

2 정의

본 장에서는 이 규격의 제1장(ISO 10993-1)과 다음의 용어 및 정의가 적용된다.

2.1 분해(degradation)

원자재의 분해

2.2 생분해(biodegradation)

생물학적 환경에 기인하는 분해

2.3 생체 흡수성(bioresorbable) 의료기기

인체의 생물학적 환경에서 분해되고 흡수되는 의료기기

2.4 용출물(leachable)

분해 산물이 아닌 원자재에서 용출할 수 있는 성분

2.5 부식(corrosion)

화학적 반응이나 전기화학적 반응에 의한 금속성 원자재에 대한 공격

주) 간혹 본 용어는 다른 원자재의 분해와 관련하여 일반적인 의미로 사용되기도 하지만, 본 장에서는 금속성 원자재에 관한 것으로만 제한된다.

2.6 물질(substance)

단일 화학 원소 또는 화합물, 또는 화합물의 복합 구조

2.7 의료기기 구성품(device component)

의료기기를 구성하고 있는 서로 다른 부분 가운데 하나

2.8 분해산물(degradation product)

본래 원자재의 화학적 파괴로 인해 유도된 화학적 화합물 또는 입자

2.9 사용 환경(service environment)

체액 주변, 조직 및 생체분자(biomolecules)를 포함하여 의료기기가 의도적으로 사용되는 해부학적 위치

3 분해 시험의 설계에 관한 원리

3.1 개요

분해 평가에 접근하는 방법은 조사 대상 원자재의 특성, 의료기기 및 특정 의료기기의 인체적용 위치에 따라 다양하다. 평가를 위해 선정된 모델은 의료기기의 사용 환경을 대표해야 한다. 수행하여야할 시험이 생물학적 환경을 필요로 하지는 않으나, 생물학적 환경의 조건을 모의 실험하는 시험도 있다. 일부 분해 과정에서 체외 모델은 사용 환경의 모든 측면을 반영하지 않을 수 있다. 예를 들어, 기계적 과정들은 생분해에 영향을 미칠 수 있으므로, 모델 사용 환경을 정할 때 반드시 고려해야 한다.

분해 연구를 설계할 때에는 분해산물의 정성 및 정량에 대해 기술하고 있는 원자재별 또는 제품별 분해 표준을 사용하도록 한다. 적절한 원자재별 규격이 존재하지 않는다면 고분자에 관해서는 제12장(ISO 10993-13), 세라믹에 대해서는 제13장(ISO 10993-14), 금속과 합금에 대해서는 제14장(ISO 10993-15)을 적용한다. 두 가지 유형 이상의 원자재로 구성된 의료기기는 관련된 모든 분해 표준을 고려하여야 한다.

제12장(ISO 10993-13), 제13장(ISO 10993-14) 및 제14장(ISO 10993-15)은 의료기기 완제품의 화학적 변형에 의해 생긴 분해산물만을 고려한다. 이 장들은 기계적 응력, 마모, 전자기방사선에 의해 사용되는 동안 유도된 의료기기의 분해에는 적용되지 않는다. 이러한 분해를 위해서는 다른 방법들이 고려되어야 한다.

3.2 사전 고려사항

의료기기의 생물학적 안전성을 평가하는 데 있어 가장 중요한 것은 원자재의 의도된 분해 가능성 또는 의도되지 않은 분해 가능성에 대해 신중하게 고려하는 것이다. 본 고려 사항의 일부는 화학적 특성과 이미 알려져 있는 분해 메커니즘에 관한 평가를 통하여 실험적 생분해 연구의 필요성 및 설계를 평가하는 것이다.

모든 의료기기를 대상으로 분해 시험을 반드시 수행해야 하거나 모든 의료기기에 대한 분해 시험이 실질적으로 도움이 되는 것은 아니다. 분해 시험의 필요성에 관한 고려 사항은 부록 A에 제시되어 있다. 실험적 분해 시험의 필요성에 대한 평가에는 논문의 검토 및/또는 알려진 임상 경험이 포함되어야 한다. 문헌에 대한 적절한 검토 지침은 제1장(ISO 10993-1)에 제시되어 있다. 대상 제품에 대한 만족스러운 임상 경험 이력, 새로운 자료, 발표된 자료 그리고 이미 알고 있는 의료기기와 원자재 그리고 분해 산물의 유사성이 입증된 경우에는 그러한 평가를 통하여 더 이상의 시험이 필요하지 않다는 결론이 도출될 수 있다.

분해 산물 및 용출물의 생물학적 평가에 대한 지침은 제1장(ISO 10993-1), 제15장(ISO 10993-16) 및 제16장(ISO 10993-17)에 제시되어 있다. 의료기기 용출물의 용출에 관한 지침은 제11장(ISO 10993-12)을 참조하고, 의료기기에 사용된 원자재의 화학적 특성과 그 용출물에 관한 지침은 제12장(ISO 10993-13)을 참조한다. 그리고 원자재의 물리화학적, 형태학적 및 표면상 특성에 관한 지침은 ISO 10993-19를 참조한다. 분해시험을 수행하기 전, 이러한 규격들을 고려하면 분해산물에서 용출물을 구분하는데 도움이 될 수 있다.

주) 용출물과 분해 산물 간에 차이가 있지만, 분해 산물에 대한 시험과 용출 성분들에 대한 시험을 병행할 수 있다. 추가적인 생물학적 평가 시험을 위해 분해산물과 다른 유형의 용출물을 구분할 필요는 없다. 하지만 위험관리조치로 용출 성분의 수준을 감소시키는 것이 필요하다고 생각될 때는 이 정보가 중요하다.

3.3 시험 설계

시험의 목적과 관련하여 완성된 생분해 시험 계획은 3.1에 규명되어 있는 문제를 다루기 위하여 설계되고, 입증되어야 한다. 시험 계획에는 분해 산물의 특성에 대한 다음의 조사를 통하여 분석적 방법이 정의되어야 한다.

1) 화학적 특성과 물리화학적 특성

2) 표면 형태

3) 생화학적 특성

또한 시험 계획에는 분해 산물을 생성하는데 이용된 방법이 설명되어야 한다. 시험방법은 분해물질의 검출에 적합하여야 하며 근거를 제시하여야 한다.

여러 성분의 의료기기에 대한 시험 계획에는 각각의 개별 성분/원자재가 고려되어야 하며, 서로 다른 부분의 분해에 미치는 상승 영향(synergistic effects)과 분해 산물간의 이차적 반응 가능성이 고려되어야 한다.

주)  생분해는 체외 시험에 의한 모델이 될 수 있다.

3.4 의료기기에서 분해된 분해 산물의 특성

시험에서 생성된 분해 산물은 미립자이거나 가용성 화합물 또는 이온일 수 있다. 적합한 분석방법을 이용하여 이러한 산물의 특성을 규명하여야 하며, 이를 입증하고, 시험보고서에 기록하여야 한다. 미립자가 생기는 경우에는 크기, 형태, 표면적 및 기타 연관된 특성들과 관련하여 특성을 규명할 필요가 있다.

주 1) 미립원자재의 물리·화학적 특성은 나노규모에서 변할 수 있으므로, 그 독성학적 특성에 영향을 미칠 수 있다.

분해 산물에 대한 생물학적 평가가 필요한 경우에는 생물학적 분석을 방해하지 않도록 분해시험 설계에 신중을 기하여야 한다.

생분해 시험에 관한 고려 사항은 부록 B에 제시되어 있다. 방법에는 다음과 같은 사항이 포함되어야 한다.

1) 의료기기 및/또는 원자재와 사용목적의 확인 및 특성 규명

2) 가능한 분해 메커니즘의 확인과 특성 규명

3) 알려져 있는 분해 산물, 예상되는 분해 산물 그리고 잠재적 분해가능성이 있는 분해 산물의 확인과 특성규명

4) 시험방법론

주 1) 분해 산물의 방출 정도와 비율은 표본 조성과 구조, 원자재 내부에서 표면으로의 이동, 생리학적 환경에서의 가용성과 화학적 조성 그리고 제조 과정 등과 같은 변수에 의해 좌우된다.

4 시험보고서

해당되는 경우, 시험보고서에는 다음의 정보가 수록되어야 한다.

1) 인체 접촉의 특성 및 사용목적을 포함하는, 원자재 또는 의료기기에 대한 설명(부록 B.2 참조)

2) 분해 평가와 분해 평가에 대한 이론적 근거

3) 분해 산물의 확인과 정량화 (예들 들어, 분해 산물의 형태와 상태, 분해 산물의 안정성과 사용된 대조군)

4) 대조군을 포함하여 분해 시험방법, 시험조건, 시험원자재 그리고 시험과정에 대한 설명

5) 정량 한계와 대조군을 포함하는 분석적 방법에 대한 설명

6) 시험실에 대한 관리 시스템의 특성 그리고 적합한 우수 시험 기관 운영 기준에 부합하는 지에 관한 설명(예, ISO/IEC 17025)

7) 결과에 대한 요약

8) 결과에 대한 해석 및 검토 (discussion)

부록 A

(규정)

분해 시험의 필요성에 관련한 고려사항

A.1 다음과 같은 경우에 분해 시험을 고려하여야 한다.

1) 의료기기가 생체 흡수되도록 설계된 경우

2) 의료기기가 30일 이상의 기간 동안 이식되는 경우

3) 원자재(들) 시스템을 정보에 입각하여 고려하였을 때 인체와 접촉하는 동안 독성 물질이 방출될 수 있는 징후가 있는 경우

A.2 다음과 같은 경우에는 분해 시험이 필요하지 않을 수 있다.

1) 예상 분해 산물이 동일한 물질이고, 예상되는 양 이내로 존재하며, 안전한 임상적 사용 이력을 가지는 의료기기에서 생성된 것들과 유사한 비율로 비슷한 위치에 생성되는 경우

2) 예상 분해 산물이 미립자이고, 안전한 임상적 사용 이력을 가지는 의료기기에서 생성된 것들과 물리적 상태(예; 크기, 분포 및 형태)가 유사하고, 예상되는 양으로 존재하며, 유사한 비율로 비슷한 위치에 생성되는 경우

3) 사용 시 생성될 수 있는 분해산물이나 물질들에 대해 충분한 분해 자료가 이미 존재하는 경우

체내 시험의 필요성은 체외 시험의 결과에 비추어 고려하여야 한다.

해당되는 경우에는 이론적으로 가능한 분해 과정을 조사하기 위하여 체외 시험을 고려하여야 한다. 체내 시험에서는 동물복지를 고려해야 한다.(제2장(ISO 10993-2) 참조) 또한 예상 분해 산물의 확인과 분해율 그리고 분해가 일어날 가능성을 평가하기 위하여 체외 시험과 체내 시험을 고려하여야 한다.

그림 A.1의 흐름도는 이러한 고려사항들에 대한 논리적 적용을 보여준다.

그림 A.1 —분해 시험의 필요성에 대한 고려사항을 나타내는 흐름도

부록 B

(참조)

생분해 시험에 관한 고려 사항

B.1 개요

본 부록에는 생분해 가능성을 평가할 때 고려해야하는 사항들이 수록되어 있다.

잠재적 생분해 산물의 생물학적 영향 및 의료기기나 원자재의 분해에 관해 중요 정보를 얻지 못한 경우에는 적절한 실제 시험(practical studies)을 고려하여야 한다.

B.2 의료기기 및/또는 원자재에 대한 설명

시험 중인 의료기기 또는 원자재를 설명할 때는 다음 사항들이 고려되어야 한다.

1) 의료기기 및/또는 원자재의 명칭

2) 의료기기의 기능

3) 사용목적(용도)

4) 예정된 생물학적 환경

5) 원자재의 조성

6) 원자재의 조절 (공정이나 멸균)

7) 표면 상태(surface condition)

8) 크기

9) 단일 성분(single component)

10) 다른 것과 함께 사용되는 단일 성분 및 그 상호작용의 특징

11) 다성분 의료기기 - 각 성분 원자재에 대하여 실시한 평가

12) 접촉 기간

13) 기타 특성

B.3 잠재적 분해 산물과 이미 알려져 있는 분해 산물에 대한 평가

B.3.1 벌크 원자재 변화(Bulk material changes)

벌크 원자재의 의도된 변화나 의도되지 않은 변화는 미립자 분해 산물을 생성할 수 있으며, 표면의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 예들 들어, 벌크 원자재의 변화는 다음과 같은 경우에 발생할 수 있다.

- 제조되는 동안

- 멸균되는 동안

- 이식되는 동안 및 이식된 동안

- 예정된 생체 흡수성에 의하여

- 보관되는 동안 및 불안정성으로 인하여

- 물리적 상태가 변화되는 동안 (팽창, 상전이 등)

B.3.2 표면에서 일어나는 물질의 방출

표면에서 일어나는 물질의 방출은 다음과 같은 과정에 의하여 발생할 수 있다.

- 화학적 반응

- 용출(leaching)

- 이동(migration)

- 해중합(depolymerization; 중합의 역반응)

- 박리, 벗겨짐

B.3.3 다른 성분과 함께 사용되는 의료기기나 다성분 의료기기

단일 성분 시스템에 대한 고려사항뿐만 아니라 다음과 같은 사항들을 다루어야할 필요가 있다.

- 구조의 파괴

- 판 분리(delamination)

- 한 부분에서 다른 부분으로의 물질 이동

- 분해 산물들 간의 반응 가능성

참고문헌

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[2] ISO 10993-14, Biological evaluation of medical devices —Part 14: Identification and quantification of degradation products from ceramics.

[3] ISO 10993-15, Biological evaluation of medical devices —Part 14: Identification and quantification of degradation products from metals and alloys.

[4] ISO Guide 25:1990, General requirements for competence of calibration and testing laboratories.

제9장 자극성과 피부 감작성 시험

(관련규격: ISO 10993-10:2010)

1. 적용범위

본 장에서는 자극 및 피부 감작성과 관련된 의료기기와 의료기기 원자재에 대한 평가과정을 기술하고 있으며, 다음의 사항을 포함한다.

1) 자극성 예비시험 시의 고려사항(피부 노출에 대한 컴퓨터 가상시험(in silico) 및 체외(in vitro) 시험방법을 포함한다.)

2) 체내(자극성 및 감작성) 시험 과정에 대한 세부사항

3) 결과 해석에 대한 중요 요소

이 시험을 위한 검체 준비과정에 관한 사항은 부록 A에 구체적으로 기술되어 있다. 부록 B에는 피부 이외의 신체부위에 의료기기를 적용할 경우에 대한 몇 가지 자극성 시험들이 설명되어 있다.

2. 정의

본 장에서는 다음의 용어 및 정의가 적용된다.

2.1 알레르겐(allergen)

감작제(sensitizer)

물질 또는 원자재와 반복 접촉하였을 때 특정 감작성을 유도할 수 있는 물질/원자재

2.2 공시험액(blank)

시험물질을 담은 것과 동일한 용기에 담아 시험물질과 동일한 조건으로 용출한 것으로 시험물질을 포함하고 있지 않은 용출 용매

주) 공시험액 대조군의 (사용)목적은 용출 용기, 용매 및 용출 과정으로 인해 생길 수 있는 중첩효과(confounding effect)를 평가하기 위한 것이다.

2.3 유발 (challenge)

도출(elicitation)

유도물질에 대한 일련의 노출로 면역효과가 검사되는 과정으로써 유도단계 후의 과정

2.4 투여량 (dose, 또는 dosage)

단위 체중 또는 체표면적 당 투여된 시험 검체의 양(예: 질량, 부피)

주)  dose로 종종 통용되나 dosage으로 더 흔히 사용됨

2.5 홍반 (erythema)

피부나 점막이 붉게 변하는 것

2.6 가피 (eschar)

딱지 또는 피부의 변색된 허물

2.7 용출액(extract)

통제된 조건(controlled conditions)에서 시험물질이나 대조물질을 용매에 노출시켜 얻는 액체 또는 현탁액

2.8 유도 (induction)

특정물질에 대한 면역학적 반응이 새로이 활성화 될 수 있도록 하는 과정.

2.9 자극제 (irritant)

자극을 유발하는 물질

2.10 자극 (irritation)

물질/원자재의 1회, 반복 또는 지속적인 접촉에 대한 국소적 비특이성 염증 반응

주) 피부 자극은 가역반응으로, 주로 피부의 국소적 홍반(붉어짐)이 특징이다.

2.11 괴사 (necrosis)

상해나 질병에 의해 유발되는 비가역적인 결과인 세포사멸

주) 조직 수복(tissue repair)은 완벽한 기능적 회복 또는 흉터 형성 결과를 가져온다는 것을 알아야 한다.

2.12 음성대조군 (negative control)

특정 절차에 의해 시험할 때, 시험시스템의 재현성, 적절한 음성, 비활성 반응 또는 최소반응을 나타내는 것으로, 시험과정의 적합성을 증명하는 특성이 잘 나타나는 원자재 또는 물질

주) 실제로 음성대조군에는 공시험액, 용매/용액 및 표준물질(reference materials)이 포함된다.

2.13 부종 (oedema)

조직에 비정상으로 체액이 침윤되어 붓는 것

2.14 양성대조군 (positive control)

특정 시험방법으로 평가할 때, 시험시스템의 재현성, 적절한 양성, 활성반응을 보여주는 것으로 시험시스템의 적합성을 증명하는 특성이 잘 나타나는 원자재 또는 물질

2.15 피부 부식(skin corrosion)

시험검체의 적용으로 인한 피부의 비가역적인 손상으로 표피에서 진피까지 육안으로 확인 가능한 괴사를 특징으로 함

예)  합성물/화학물질/시험 검체의 작용이 피부의 궤양을 일으킴(2.19 참조).

2.16 피부 감작성(skin sensitization)

알러지성 접촉 피부염(allergic contact dermatitis)

어떤 물질에 대한 면역매개성 피부 반응

주) 사람에서의 반응은 피부소양증, 홍반, 부종, 구진, 소포, 물집 또는 이러한 증상의 혼합으로 나타날 수 있다. 다른 종에서는 반응이 다를 수 있으며, 홍반과 부종만 나타날 수도 있다.

2.17 시험물질 (test material)

생물학적 또는 화학적 시험을 위해 채취된 원자재, 의료기기, 의료기기 부분품 또는 구성성분

2.18 시험검체 (test sample)

생물학적 또는 화학적 시험 또는 평가에 사용하기 위한 원자재, 의료기기, 의료기기 부분품, 구성성분, 용출액 또는 그 일부분

2.19 궤양 (ulceration)

표면조직의 결손을 나타내는 개방 창상

2.20 용매(vehicle)

시험물질/원자재를 적시고, 희석하고, 현탁하고, 용출 또는 용해할 때 사용되는 용액

3. 일반원리 - 단계식 접근법

감작 시험과 자극성 시험에 사용할 수 있는 방법은 특히 잠재적인 피부 및 점막의 자극성과 피부 감작을 측정하기 위해 개발되었다. 일반적으로 다른 유형의 부작용들은 이들 시험으로 예측되지 않는다. 이식재 또는 체내․외 연결형 의료기기(external communicating devices)로 사용되는 의료기기의 경우에는 적용 접근방법에서 피내검사(intradermal testing)가 더 적합하므로, 자극성을 파악하기 위해서는 5.4에 기술된 것처럼 피내반응시험(intracutaneous testing)을 이용해야 한다.

본 장에서는 단계적 접근을 요구하고 있고, 아래의 사항들 중 하나 이상이 포함되어야 한다.

1) 제8장(ISO 10993-9), 제12장(ISO 10993-13), 제13장(ISO 10993-14), 제14장(ISO 10993-15), 제17장(ISO10993-18)에 기술되어 있는 시험검체의 분석 및 화학적 특성과 관련된 시험원자재의 특성을 분석함.

2) 의료기기의 원자재뿐만 아니라 구성품의 잠재적 감작성과 자극성에 관한 정보 및 화학적·물리적 특성에 대한 평가가 포함되어 있는 문헌을 검토함.

3) 제2장(ISO 10993-2)에 따라, 과학적으로 검증되고 합리적이고 실제적으로 이용할 수 있는 새로운 체외시험이 개발되면 체내 시험에 앞서 체외 시험을 고려하고 체내 시험을 대체한다. 피부 자극성과 부식의 평가를 위해, 체외 대체시험은 화학물질에 대해 이용 가능하다. 현재까지 감작제(sensitizer)를 검출하는 것 외에 국제적으로 검증되고 인정된 체외 시험법(internationally validated and accepted in vitro test)은 없다.

4) 동물 체내 시험 : 재현성과 민감성을 확보하기 위해 시험 마다(in each assay) 자극 및 피부 감작성에 대한 양성 대조물질 시험을 포함시켜 시험함으로써 시험시스템을 검증하고 양성 반응을 입증하여야 한다. 그러나 기니피그 감작성 시험법에서는 6개월 또는 그 이상의 기간 동안 일관성이 입증된 경우 시험 마다 양성 대조군을 포함 시킬 필요는 없으나, 6개월을 넘지 않는 일정한 간격을 두고 양성대조군을 포함한 시험을 시행할 수는 있다.

주 1) 감작성은 현재 체내(in vivo)시험법에 의해서만 측정될 수 있으며, 마우스 국소림프절시험법(local lymph node assay, LLNA), 기니피그 폐색 첩포 시험(occluded patch test) 또는 기니피그 극대화시험(guinea pig maximization test, GPMT)을 이용하여 수행될 수 있다. 단일 화학물질에 대한 감작능(sensitizing potential)을 확인하기 위해 최근 선호되는 시험법은 LLNA이다.(참고문헌 [69], [88], [90] 참조)

주 2) 시험물질의 특성이 분석될 수 없고 1), 2) 및 3)에서 제시된 방법으로 얻은 정보를 사용하여 위험 측정(risk assessment)을 할 수 없을 때는 체내 동물 시험이 적합하다.

주 3) 기니피그를 사용하는 감작성 시험의 경우, 일반적으로 6개월에 한번 양성 대조군으로서 10마리의 시험동물이 사용된다. 양성 대조물질이 포함된 시험의 빈도가 6개월에 한번이상이라면 기니피그의 수를 줄여 사용할 수도 있다. 최소 5마리의 양성 대조동물과 5마리의 대조동물이 사용되어야 한다.

5) 비침습적 인체시험 / 임상시험

만일 시험검체가 동물시험에서 독성 물질, 감작제, 자극제가 아님이 입증되었다면, 인체를 대상으로 하는 비침습적 피부 자극성 시험을 고려할 수 있다.

관리기준 ISO 14155-1, ISO 14155-2, 윤리 원칙에 따라 수행되는 임상시험은 1)∼4)에서의 평가 결과를 알기 전에는 시행되어서는 안 된다.

4. 예비시험 시의 고려사항

4.1 일반사항

예비시험을 고려하는 과정 중에 자극성 및/또는 감작성 시험이 필요하지 않다는 결론을 내릴 수 있다.

제1장(ISO 10993-1) 제6항과 아래의 항에 제시되어 있는 필요 조건들이 적용된다.

시험검체의 미생물 오염 가능성이 최종 시험에 대한 해석을 혼란스럽게 할 수 있으므로 비멸균 검체는 표면적용 시험(topical investigation)에 의해서만 시험되어야 한다. 시험검체의 멸균이 보장될 수 없지만 검체가 오염되지 않은 것으로 간주되는 경우에, 피내 투여가 정당화될 수 있다.

4.2 시험물질의 유형

4.2.1 초기의 고려 사항

의료기기의 제조 공정 중에 추가적인 화학적 성분, 예를 들어, 윤활제나 몰드 이형제와 같은 성분들이 사용되는지를 고려하여야 한다. 이외에도 멸균과정에서 발생하는 반응 산물, 멸균 잔류물, 조립 시의 접착제 잔류물, 용매 잔류물, 제조과정의 보조제 및 개시제 등의 화학성분이 완제품에 남아있을 수 있다. 이들 성분이 위해/위험을 나타내는지 여부는 완제품의 누출 또는 분해 특성에 달려있다. 이들 성분의 잠재적 자극성/감작성 반응에 대해서도 고려하여야 한다.

4.2.2 세라믹, 금속, 합금

이 시험검체는 일반적으로 화학적 조성의 수가 고분자물질이나 생물학적으로 유도된 시험검체보다는 덜 복잡하다.

4.2.3 고분자물질

이 물질은 일반적으로 조성의 측면에서 4.2.2항에 제시되어 있는 물질보다는 화학적으로 더 복잡하다. 수많은 반응 생성물/불순물/첨가제가 존재할 수 있고, 중합의 완전도도 다양할 수 있다.

4.2.4 생물학적으로 유도된 물질

이 물질은 본래 조성이 복잡하다. 이 물질은 종종 공정상의 잔류물(예를 들면 가교제와 항균제)이 함유되어 있다. 생물학적 물질은 검체마다 균일하지 않다.

이 규격의 시험방법은 생물학적으로 유도된 물질의 시험을 위해 설계된 것들이 아니므로 적절하지 않을 수 있다. 예를 들어, 이 규격의 시험방법은 교차-종(cross-species) 감작성은 고려하지 않고 있다.

4.3 화학적 조성에 대한 정보

4.3.1 일반사항

물질의 화학적 조성에 관한 완전한 정성 자료를 확립하여야 한다. 생물학적 안전성과 관련이 있는 경우에도 정량 자료를 확보하여야 한다. 만일 정량 자료가 확보되지 않으면, 이론적 근거가 제출되어야 하고, 그 근거는 타당하여야 한다.

4.3.2 기존 자료의 출처

조성에 대한 정성 및 정량 정보는 가능한 한 원자재의 공급자로부터 확보하여야 한다.

고분자물질의 경우에는 종종 특허 정보에 접근을 해야 할 필요가 있다. 그러한 기밀 정보의 이용 및 이전에 관한 규정이 만들어져야 한다.

보조 공정 첨가물(예를 들어, 몰드 이형제)에 관한 정성 정보도 마찬가지로 부품 제조업자와 가공업자(convert)를 포함하여 제조 공정의 구성원들로부터 제공받아야 한다.

조성에 관한 자료가 존재하지 않는 경우에는, 해당 물질에 대한 가장 적절한 분석 방법을 선정하기 위해 원자재 및 첨가제의 특성 확립에 관한 문헌고찰이 권장된다.

완제품의 화학 조성은 제17장(ISO 10993-18)에 따라 결정되어야 한다.

주) 세라믹, 금속, 그리고 합금의 조성은 ISO나 미국 원자재 시험 학회 (ASTM)의 표준을 따를 수 있고, 그리고/또는 사용자가 그 조건을 지정할 수도 있다. 그러나 조성에 관한 전체적인 정성 및 정량 자료를 얻기 위해서는 원자재의 제조업자나 공급업자에게 이를 요구할 필요가 있고, 공정상 보조제를 확인하기 위해서 부품 제조업자에게도 이를 요구할 필요가 있다. 원자재 마스터 파일 (master file)에 접근할 수 있는 경우에는 규제 당국이 관리를 하고 있는 원자재 마스터 파일이 또 하나의 정보 출처가 된다.

5. 자극성 시험

5.1 체외 자극성 시험

체외 방법에서, 랫드의 피부 경피성전기저항(Transcutaneous Electrical Resistance, TER)시험과 인체유래 인공피부모델시험(Human skin model test)은 화학물질의 피부 부식성을 평가하기 위한 대안으로 국제적으로 검증되고 인정받은 시험방법이다(OECD 가이드라인 430[9] 와 431[10]).

국가 및 국제기관들은 대안적인 방법을 모색함과 동시에 피부 자극성에 대한 체외 시험을 개발하고 검증하기 위한 작업을 진행하고 있다. 다른 기관들은 비침습 기법을 이용해 종점(endpoint)을 보다 확실하게 규명하기 위하여 사람과 동물의 반응을 양적으로 측정하는 방법들을 대안으로 개발하고 있다. (부록 F.1 참조)

주) 2007년 유럽 동물대체시험법검증센터(ECVAM) 과학자문위원회(ESAC)는 화학물질에 대한 피부 자극성을 규명하기 위해 체외 인체유래 인공피부모델의 검증 과정을 평가하였다(참고문헌 [101] 참조). 화학물질의 피부유발 잠재성을 평가하기 위해 인체유래 인공피부모델을 사용하는 체외 시험방법은 부록 D에 설명되어 있다.

피부 자극성에 대한 체외 시험은 지금까지 단일 화학물질에 대해서만 검증되었고 의료기기 용출액에 대해서는 검증되지 않았다. 의료기기의 잠재적 자극성을 시험하는데 이러한 시험을 적용하기 위해서는 이러한 특정 부분에 대한 추가적 검증이 필수적이다.

5.2 체내 자극성 시험 - 시험의 설계와 선정 시 고려 사항

의료기기의 자극성 시험은 완제품 그리고/또는 완제품의 용출액으로 시행한다.

자극성 연구의 결과에 영향을 미치는 요인들은 다음과 같다.

1) 첩포시험(patch test)에 사용되는 의료기기의 특성

2) 시험물질의 투여량

3) 시험물질의 적용방법

4) 폐쇄 정도

5) 적용부위

6) 노출 횟수 및 기간

7) 시험결과를 평가하는데 사용된 기법

추가적인 배경 정보는 부록 F에 제시되어 있다.

정확한 시험계획과 관련하여 시험의 유연성을 높임으로써, 사용조건과 모집단 노출의 적합성을 꾀하여 시험의 감도를 증가시킬 수 있는 반면, 시험절차에 일관성을 기하게 되면 실험실간 서로 다른 시험물질에 대한 시험결과를 비교할 수 있다.

시험은 임상적인 상황에서 예상되는 접촉(시간 및/또는 농도)을 과장하여 설계하여야 하고, 시험결과를 해석할 때 이를 고려하여야 한다.

시험검체의 pH가 2이하이거나 11.5이상인 경우에는 그 재료는 자극성이 있다고 간주되고 추가적인 시험은 요구되지 않는다. 그러나 시험재료의 산성/알칼리성에 관한 시험자료만으로는 그 시험물질이 심각한 손상을 일으키는 것으로 판단할 수는 없다. 시험물질의 접촉기간, 농도, 그리고 다양한 물리적․화학적 특성들도 중요한 요소이다.

추가적인 위험 특성 분석 및 측정(risk characterization)이 필요한 예외적인 경우에는 자극성이 있는 시험물질 또는 앞에서 언급된 pH의 범위를 벗어나는 시험물질에 대한 시험이 필요할 수 있다. 이러한 경우는 근거가 제시되고 문서화되어야 한다.

5.3 자극성 동물시험

5.3.1 원리

적합한 동물 모델을 이용하여 피부 자극을 유발하는 시험으로 시험물질의 피부자극 잠재성을 평가한다.

선호되고 있는 동물 모델은 토끼이다.

5.3.2 시험물질

시험물질이 고체이거나 액체인 경우에는 부록 A에 명시되어 있는 내용에 따라 준비하여야 한다.

시험의 민감도가 증명되어야 하며, 시험의 민감도 증명을 위하여 시험에 양성 대조군을 포함시킬 수 있다. 그러나 민감도 확인을 위한 양성 대조군은 실험실에서 지난 6개월 이내에 해당 시험 방법을 사용하여 양성결과를 얻지 못했을 때에만 사용하는 것이 적합하다.

주) 적합한 양성대조군은 SLS(Sodium Lauryl Sulfate)이다.

5.3.3 동물과 관리

동일한 품종으로 암, 수구별 없이 무게 2kg 이상의 젊고 건강한 알비노 토끼 성체를 이용하여야 한다. 자극성이 예상되는 경우에는 먼저 한 마리 동물로만 시험하는 것을 고려해야 한다. 명확한 양성 반응[홍반이나 부종 어느 것이든 수치가 2보다 큰 경우 (표 11 참조)]이 관찰되지 않는다면, 최소 두 마리의 동물을 더 이용하여 시험을 수행하여야 한다. 만약 최소 세 마리의 동물을 이용한 시험에서도 명확하지 않거나 불분명한 경우에는 추가 시험을 고려하여야 한다.

제2장(ISO 10993-2)에 명시되어 있는 바에 따라 동물들을 환경에 순응시키고, 관리하여야 한다.

5.3.4 시험과정

5.3.4.1 동물의 준비

가장 중요한 요소는 피부의 상태이다. 피부가 손상되지 않고 건강한 동물만을 이용한다. 시험부위 (약 10cm × 15cm)를 모두 이용하고 관찰하기 위하여 24시간～4시간 이내에 등뼈 양쪽으로 충분한 거리를 확보할 수 있도록 하여 털을 짧게 깎는다.

반복적인 노출에 적응시키고 관찰을 용이하게 하기 위하여 털을 다시 잘라내기도 한다. 탈모제는 시험기관에서 그 공정이 검증된 경우에 숙련된 전문가에 의해 사용될 수 있다. 반복 노출이 필요한 경우, 5.3.4.2.1항, 5.3.4.2.2항 또는 5.3.4.2.3항에 제시된 과정에 따라 최대 21일 동안 반복한다.

1. 머리 쪽

2. 시험부위

3. 대조군 부위

4. 제모한 등 쪽

5. 꼬리 쪽

그림 2 피부 적용부위의 위치

5.3.4.2 시험검체의 적용

5.3.4.2.1 분말 또는 액상검체의 적용

그림 2에 제시된 각각의 시험 피부 부위에 0.5g 또는 0.5ml의 시험물질을 직접 바른다. 단단하고 소수성인 시험물질의 경우에는 촉촉하게 적실 필요가 없다. 시험물질이 분말인 경우에는 사용하기 전에 적당한 용매나 물로 약간 적셔야 한다. (부록 A 참조)

2.5cm × 2.5 cm의 비폐쇄드레싱(흡수성 거즈 첩포(patch))으로 적용부위를 덮고 난 후 최소 4시간 동안 붕대(반폐쇄 또는 폐쇄붕대)로 적용부위를 감싸둔다. 접촉 시간이 끝나면 드레싱을 제거하고 영구적인 잉크로 부위의 위치를 표시한다. 적당한 비자극성 용매나 미지근한 물로 닦아내는 것과 같은 적절한 방법을 이용하여 남은 시험물질을 제거하고, 조심스럽게 건조시킨다.

5.3.4.2.2 용출액과 용출용매의 적용

2.5cm × 2.5 cm의 흡수성 거즈 첩포(patch)에 적당한 용출액을 바른다. 충분한 양의 용출액(보통 첩포 당 0.5g 또는 0.5ml)을 이용하여 거즈를 흠뻑 적신다. 그림 2에 제시된 대로 동물의 양쪽에 첩포를 하나씩 붙인다. 그림 2에서 가리키는 대로 용출용매로 적신 거즈의 대조군 첩포(patch)를 붙인다.

최소 4시간 동안 붕대(반폐쇄 또는 폐쇄붕대)로 적용부위를 감싸둔다. 접촉 시간이 끝나면 드레싱을 제거하고 영구적인 잉크로 부위의 위치를 표시한다. 적당한 비자극성 용매나 미지근한 물로 닦아내는 것과 같은 적절한 방법을 이용하여 남은 시험물질을 제거하고, 조심스럽게 건조시킨다.

5.3.4.2.3 고형 검체

그림 2에 제시된 피부의 시험부위 각각에 시험물질을 직접 바른다. 동일한 방법으로 각각의 토끼에 대조군을 바른다. 고체로 시험을 하는 경우(필요한 경우 분쇄하기도 하는), 충분한 피부 접촉을 위해 물 또는 필요한 경우 대체 용매를 이용하여 시험물질을 충분하게 적셔야 한다.(부록A 참조) 용매를 사용하는 경우, 시험물질에 의한 피부 자극에 용매가 미치는 영향을 고려해야 한다.

2.5cm × 2.5 cm의 비폐쇄드레싱(거즈 첩포(patch)와 같은)으로 적용부위를 덮고 난 후 최소 4시간 동안 붕대(반폐쇄 또는 폐쇄붕대)로 적용부위를 감싸둔다. 접촉 시간이 끝나면 드레싱을 제거하고 영구적인 잉크로 부위의 위치를 표시한다. 적당한 비자극성 용매나 미지근한 물로 닦아내는 것과 같은 적절한 방법을 이용하여 남은 시험물질을 제거하고, 조심스럽게 건조시킨다.

5.3.5 동물의 관찰

5.3.5.1 일반사항

피부 반응을 시각화하기 위하여 전파장(full-spectrum) 조명이나 자연(natural) 조명을 이용할 것을 강력히 권장하고 있다. 표 11에 제시되어 있는 수치 체계에 따라 매 시간 간격마다 각각의 적용부위에 대한 피부 홍반과 부종 반응 수치를 채점하고, 기술하며, 시험보고서를 위해 결과를 기록한다.

주) 어떤 경우에는 조직학적 혹은 비침습 기법이 피부 반응 평가를 보조할 수 있다.

5.3.5.2 1회 노출 시험

1회 노출 시험의 경우에는 첩포(patch)를 제거한 후 (1 ± 0.1) 시간, (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간, (72 ± 2)시간 마다 적용부위의 모습을 각각 기록한다. 지속적인 손상이 일어나는 경우에는 손상의 가역성이나 비가역성을 평가하기 위하여 관찰 기간을 연장할 필요가 있다. 필요한 기간은 14일을 초과하지 않는다.

반 응	자극 점수
홍반과 가피 형성
홍반 없음	0
아주 약간의 홍반(거의 지각할 수 없음)	1
잘 형성된 홍반	2
중간 정도의 홍반	3
가피의 형성으로 홍반의 등급을 매기지 못할 정도의 극심한 홍반	4
부종 형성
부종 없음	0
아주 약간의 부종(거의 지각할 수 없음)	1
잘 형성된 부종(분명히 부풀어 올라 부종부위의 경계가 명확함)	2
중간 정도의 부종(1mm 정도 부풀어 오름)	3
극심한 부종(1mm 이상 부풀어 오르고 노출 범위 이상으로 확장됨)	4
최대 가능한 자극점수	8
피부 부위에 나타나는 기타 이상 변화는 기록하고 보고한다.

표 11 피부반응 점수체계

5.3.5.3 반복 노출 시험

반복 노출은 급성 1회 노출 시험이 완료된 이후에 실시되어야 한다(적어도 관찰하고 (72 ± 2)시간이 지난 후에).

반복 노출 시험의 경우에는 첩포(patch)를 제거하고 (1 ± 0.1)시간 후에 그리고 다음 적용 직전에 적용부위의 모습을 기록한다. 노출의 횟수는 다양하다.

마지막 노출 후에 첩포(patch)를 제거하고 (1 ± 0.1) 시간, (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간, (72 ± 2)시간 마다 적용부위의 모습을 각각 기록한다. 지속적인 손상이 일어나는 경우에는 손상의 가역성이나 비가역성을 평가하기 위하여 관찰 기간을 연장할 필요가 있다. 필요한 기간은 14일을 초과하지 않는다.

5.3.6 결과의 평가

1회 노출 시험의 경우에는 다음과 같이 1차 자극 지수(PII; Primary Irritation Index)를 측정한다.

(24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간, (72 ± 2)시간 관찰결과만을 계산에 이용한다. 투여 이전의 관찰 또는 회복을 감시하기 위하여 72시간이 지난 후에 관찰한 결과는 측정치로 사용하지 않는다.

72시간 등급을 매긴 후에 (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간, (72 ± 2)시간 관찰된 모든 홍반 등급과 부종 등급을 더하여 각 시험 검체와 각 동물의 공시험액에 대해 별도로 누계를 낸다. 동물에 대한 1차 자극 점수는 모든 점수의 총합을 6으로 나누어 산출된다(2회 시험/관찰 부위, 3회 관찰시간별 점수).

시험 검체에 대한 1차 자극 지수를 얻기 위해서는 개체별 동물들의 모든 1차 자극 점수를 더하여 동물의 수로 나눈다(일반적으로 3).

공시험액 또는 음성 대조군을 사용하는 경우에는 대조군에 대한 1차 피부 자극 점수를 계산하고, 시험물질에 대한 점수에서 대조군에 대해 계산한 점수를 빼 1차 피부 자극 점수를 구한다.

반복 노출 시험의 경우에는 모든 평가 점수를 고려하여 각 동물에 대한 1차 자극 점수를 앞에서 언급한 원칙에 따라 계산해야 한다.

반복 노출에서는 다음과 같이 누적자극지수(Cumulative Irritation Index)를 계산한다.

각 동물의 자극 점수를 더하고 총 동물 숫자로 나눈다. 이 값이 1차 자극 지수(PII)이다.

누적자극지수는 표 12에 명시된 자극반응의 범주와 비교하여 적절한 범주를 보고서에 기록하도록 한다.

주) 누적자극지수의 범주는 토끼와 사람 두 종 모두에 대하여 많은 화학물질을 시험하였을 때 나타난 화학물질에 대한 토끼의 1차자극지수(PII)와 사람의 1차자극반응을 관련시킨 자료에 기초한 것이다.

어떤 반응의 경우에는, 표 11에 의거하여 각 동물에 대한 최대 1차자극점수, 반응시작시간, 최대반응 시간을 기록한다.

표 12에 제시된 점수와 설명(반응 범주)은 1차 자극 점수 또는 누적 자극 점수의 특성을 나타내고 있다. 시험된 용출액이 서로 다른 경우에는 최대 1차 자극 점수를 나타내는 것에 의해 반응 범주가 결정된다.

표 12 토끼의 1차 또는 누적 자극 지수 범주

평균 점수	반응 범주
0 - 0.4	무시해도 좋은
0.5 - 1.9	약간 있는
2 - 4.9	중간 정도의
5 - 8	심한

5.3.7 시험보고서

시험보고서는 다음과 같은 내용을 포함하여야 한다.

1) 시험원자재나 의료기기에 대한 설명

2) 시험원자재나 의료기기의 사용목적/적용

3) 시험원자재나 시험검체의 준비방법에 대한 자세한 설명

4) 시험동물

5) 시험부위에의 적용방법과 붕대 원자재의 유형(반폐쇄 또는 폐쇄)

6) 적용부위의 표시방법과 관찰내용

7) 관찰결과

8) 반복노출 시 노출 횟수와 노출 간격

9) 결과의 평가

5.4 동물 피내 (진피내) 반응 검사

5.4.1. 서론

이식재로 사용되는 의료기기는 피내반응시험의 적용이 권고된다. 원자재 용출액의 피내주사 후에 시험물질이 자극을 일으킬 잠재성에 대하여 평가한다.

5.4.2 시험을 배제하는 경우

피부, 눈 및 점막 자극제나 pH가 ≤2 또는 ≥11.5인 원자재는 피내에 시험하지 않는다. 위험 특성분석/평가가 필요한 예외적인 경우에는 자극성이 있거나 앞에서 언급한 pH의 범위를 벗어나는 시험물질에 대해서 시험이 필요할 수 있다. 이러한 경우에는 근거를 제시하고 문서화하여야 한다.

5.4.3 시험검체

시험검체는 부록 A에 제시되어 있는 바에 따라 준비된 용출액이어야 한다. 각 동물에 시험부위가 여러 군데 있으므로, 적합한 음성 대조군 또는 공시험액과 함께 여러 개의 시험검체가 적용될 수 있다.

5.4.4 시험동물 및 관리

동일한 혈통으로 암수 구별 없이 무게 2kg 이상의 건강하고 어린 알비노 토끼 성체를 이용하여야 한다. 제2장(ISO 10993-2)에 명시되어 있는 바에 따라 동물들을 환경에 순응시키고, 관리해야 한다. 처음부터 최소 3마리의 동물을 이용해 시험원자재를 평가해야 한다. 자극성이 예상되는 경우에는 먼저 한 마리 동물로만 시험하는 것을 고려한다. 명확한 양성 반응[홍반이나 부종 어느 것이든 수치가 2보다 큰 경우(표 11 참조)]가 관찰되지 않는다면, 최소 2마리의 동물을 더 이용하여 시험을 수행하여야 한다. 최소 3마리의 동물을 이용한 시험에서 반응이 명확하지 않거나 또는 불분명한 경우에는 추가 시험을 고려해야 한다.

5.4.5 시험방법

용출액을 주사하기 위하여 시험하기 4시간∼18시간 전에 양쪽 등뼈에서 충분한 거리를 두고 동물의 등에 있는 털을 깎는다.

극성용매 또는 비극성 용매를 이용하여 얻은 용출액 0.2ml를 각각의 토끼의 한쪽부분에 5군데씩 피내 주사한다. 피내주사 시에 시험물질의 점도에 맞추어 최대한 작은 바늘을 적절하게 사용한다.

그림 3에는 주사 부위 배열의 예가 제시되어 있다.

이와 마찬가지로 극성 또는 비극성 용매 대조군(polar or non-polar solvent control) 0.2ml를 각각의 토끼의 대칭되는 반대쪽 부위 5군데에 주사한다(그림 3 참조).

만약 다른 용매를 사용할 경우에는 다른 용매 대조군과 다른 용매를 이용하여 얻은 용출액으로 위와 같은 과정을 반복하도록 한다.

	머리쪽
극성 용출액 0.2ml 주사	┏ ┃ ┃ ┃ ┗	1	◎	◎	1	┓ ┃ ┃ ┃ ┛	극성 용매 0.2ml 주사
		2	◎	◎	2
		3	◎	◎	3
		4	◎	◎	4
		5	◎	◎	5
비극성 용출액 0.2ml 주사	┏ ┃ ┃ ┃ ┗	6	◎	◎	6	┓ ┃ ┃ ┃ ┛	비극성 용매 0.2ml 주사
		7	◎	◎	7
		8	◎	◎	8
		9	◎	◎	9
		10	◎	◎	10
	꼬리쪽

그림 3 주사위치의 배치

5.4.6 시험동물의 관찰

주사부위의 양상을 주사직후 및 (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간, (72 ± 2)시간 후에 기록한다.

조직의 홍반과 부종반응을 표 13에 나와 있는 분류체계에 따라 주사부위별로 시간대별로 관찰사항에 대한 등급을 정하여 결과를 기록한다.

주) 피내에 오일을 주사할 경우에는 종종 염증반응을 일으킬 수 있다.

주사 후 (72 ± 2)시간 후에 트립판 블루(Trypan blue) 혹은 에반스 블루(Evans blue)와 같은 생체 염색시약(vital dye)을 정맥 내 주사하면 자극 반응을 보인 곳을 평가하는데 도움이 될 수 있다.

가능한 경우에는 평가를 용이하게 하기 위하여 비침습 기법을 사용하기도 한다.

반응	등급
홍반과 가피 형성
홍반 없음	0
아주 약간의 홍반(거의 지각할 수 없음)	1
명백한 홍반 (well-defined)	2
중간 정도의 홍반	3
심한 홍반(짙은 붉은색)∼홍반 등급을 매기기 어려운 가피 형성	4
부종 형성
부종 없음	0
아주 약간의 부종(거의 지각할 수 없음)	1
잘 형성된 부종(분명히 부풀어 올라 부종부위의 경계가 명확함)	2
중간 정도의 부종(대략 1mm 정도 부풀어 오름)	3
극심한 부종(1mm 이상 부풀어 오르고 노출 범위 이상으로 확장됨)	4
최대 가능한 자극 점수	8
피부 부위에 나타나는 기타 이상 변화는 기록하고 보고한다.

표 13 — 피내 (진피내) 반응에 관한 등급 체계

5.4.7 결과의 평가

등급을 매기고 (72 ± 2) 시간이 지난 후에 (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간, (72 ± 2)시간 관찰된 각각의 시험검체와 용매대조군(vehicle blank) 별로 홍반 등급과 부종 등급을 합산한다. 각각의 개체별 동물에 대한 시험 검체 또는 공시험액의 점수를 계산하기 위해서는 각각의 총합을 15로 나눈다(3회 시간별 관찰 점수 x 5회 시험 또는 공시험액 주사 부위). 각 시험 검체와 이에 상응하는 각 공시험액에 대한 전체 평균 점수를 결정하기 위해서는 3마리의 동물에 대한 점수를 더하여 3으로 나눈다. 최종 시험 검체 점수는 시험 검체 점수에서 공시험액의 점수를 빼서 얻을 수 있다. 최종 시험 검체 점수가 1.0 이하이면 시험의 필요조건이 충족된다. 만일 어떠한 관찰 기간에 시험검체에 대한 평균 반응이 용매대조군에 대한 평균 반응보다 의심스러울 만큼 크다면, 3마리 토끼를 추가로 사용하여 다시 시험한다. 최종 시험 검체 점수가 1.0 이하라면 시험의 필요조건이 충족된다.

주) 공시험액 대조 검체는 그림 3에 언급된 것처럼 극성 또는 비극성 용매 대조군이다.

5.4.8 시험보고서

시험보고서에는 다음 사항이 포함되어야 한다.

1) 시험원자재나 의료기기에 대한 설명

2) 시험원자재나 의료기기의 사용목적/적용

3) 시험검체의 준비방법에 대한 자세한 설명

4) 주사 방법

5) 시험부위의 적용방법

6) 적용부위의 식별방법과 관찰내용

7) 결과의 평가

5.5 사람 피부 자극성 시험

5.5.1 서론

현재 위험 요인을 규명하기 위하여 사람의 피부 자극성을 예측하는 시험은 주로 시험동물의 사용에 의존하고 있다 (부록 F 참조). 그러나 동물 자료에 의거하여 사람의 피부 자극성을 추정하는 데에는 문제가 있다. 사람에게 높은 수준으로 노출되는 화학 물질 (예를 들어, 화장품이나 세제)의 경우에는 종종 사람의 피부 첩포(patch) 시험방법을 이용해 위험성을 평가한다.

사람 피부에 대한 시험은 몇 가지 목적을 충족시켜줄 수 있다.

1) 시험동물 보다는 사람을 대상으로 하는 화학 물질 시험으로 사람에 대한 위험성을 직접적으로 규명

2) 사람에게 높은 수준으로 노출되는 특정한 화학 물질의 위험성 평가를 제공

3) 과거에 시험동물 시험에서 얻어진 자료를 인간에게 적용하는 것을 용이하게 함

이 규격은 위해를 규명하기 위하여 피부 자극성에 대한 자료를 사람에게서 직접 얻을 수 있도록 한다. 이것의 목적은 급성 노출로 인해 시험물질이 중대한 피부 자극의 위해를 나타내는 지의 여부를 측정하기 위한 것이다.

임상시험은, “의료기기법 시행규칙 제13조(임상실험실시기준 등)” 및 ISO 14155-1과 ISO 14155-2에 따라 시행되어야 한다. 임상시험에 관한 추가 기준은 부록 C에 설명되어 있다.

주) 자극성 시험에 대한 추가 자료는 부록 F.1 참조

5.5.2 시험 전 고려 사항

피부 흡수 자료를 포함한 시험물질과 시험물질의 화학적 조성에 대한 독성 분석표를 통해 중대한 건강상 손상을 야기하지 않는 시험이라는 것을 나타내야 한다.

다음은 시험물질을 사람에게 시험해서는 안 되는 경우이다.

1) 체내 또는 체외 예측 평가에서 시험물질이 자극성이 있는 것으로 나타난 경우

주) 어떤 상황에서는 사람에 대한 잠재적 위험을 추가로 확인하기 위해 사람에 대한 제품의 자극성 검체/용출액에 대한 추가 시험을 수행하는 것이 필요할 수 있다.

2) 체내 또는 체외 예측 평가에서 시험물질이 부식성이 있는 것으로 나타난 경우

3) 물리화학적 특성 및/또는 구조/기능 상관성에 근거하여 사람 피부에 대해 잠재적인 부식성이 예측되는 강산 또는 알칼리성 잔류물과 같은 물질인 경우

4) 시험물질이 피부 손상이나 기도 감작을 나타내는 경우

5) 시험물질이 시험조건 하에서 급성 독성의 위험성을 나타내는 경우

6) 시험물질이 유전 독성, 생식 독성 또는 발암성의 위험성을 나타내는 경우

지원자의 선정과 관련된 추가적 지침은 부록C와 부록F에 제시되어 있다.

6. 피부 감작성 시험

6.1 시험방법의 선정

현재 화학물질의 피부 감작능(skin sensitizing potential)을 측정하기 위해 사용되는 동물 시험법은 세 가지가 있다. 두 종류의 기니피그 시험법(guinea pig assay)과 하나의 마우스 시험법(murine assay)이 이에 속한다. 지금까지 일반적으로 피부 감작성 시험에는 기니피그 극대화시험(guinea pig maximization test; GPMT)과 폐쇄첩포시험(Buehler test, 뷸러 시험)이 사용되었다. 극대화 시험방법은 가장 민감한 방법이다. (참고문헌 [51] 참조) 폐쇄 첩포 시험은 국소적인 제품에 적합하다.

마우스의 국소림프절시험법 (Murine Local Lymph Node Assay, LLNA)이 단일 화학 물질을 시험하기 위한 기니피그 평가 방법의 유일한 대안으로 국제적으로 인정받아 현재 화학물질에 대해 선호되는 시험법이다. (참고문헌 [69], [88], [91] 참조) 일부 경우에는 특정 시험 검체의 잠재적 감작성의 평가를 위해 기니피그 시험이 필요할 수도 있다. 위음성, 위양성, 특정 금속 및 피부에 침투하지 못하는 고분자 물질의 경우가 이에 해당될 수 있다. 자극제의 활성이 양성 림프절 반응을 일으킬 수 있음을 알아야 한다.

동물 복지 기준에 관한 제2장(ISO 10993-2)의 규정을 고려하여 국소림프절시험법(LLNA)이 고려되어야 한다. 동물 복지 요구사항을 고려하는 것 외에, LLNA는 객관적인 정량 데이터를 제공하는 장점이 있다.

주) 세 가지 시험법 모두 화학물질의 피부 잠재적 감작성 즉, 지연성(유형 IV) 감작성인 접촉성 피부염의 검출을 위해 개발되었다.

6.2 마우스 국소림프절시험법(LLNA)

6.2.1 원리

시험 검체를 귓등에 국소 처리 후에 (귀의) 도포부위에서 가까운 림프절 내 림프구 증식의 정도를 측정한다. 대조군의 활성도(activity)와 비교하여 3배 또는 그 이상의 세포증식의 반응은 시험물질을 감작제(sensitizer)로 지정할 수 있는 역치이다.

LLNA는 물질이 사용될 때 투여량-반응 접근법을 사용하여 수행해야 한다. 최종제품/의료기기 완제품의 경우에는 희석되지 않은 용출액 만으로 시험하는 것으로 충분하다.

주) 참고문헌에 대표적인 LLNA 문헌(publication)이 포함되어 있다. 이 시험을 수행하는 실험실에서는 이러한 문헌과 기타 이용 가능한 관련 자료들을 검토해야 한다. 이외에 LLNA에 대한 체외 대체시험법이 현재 개발 중에 있다. 이러한 시험법 개발에 관한 최신 정보는 참고문헌에 제시된 ECVAM, ICCVAM 및 JaCVAM 웹사이트를 참조하면 된다. (참고문헌 [114], [115], [116] 참조)

6.2.2 시험 검체 준비

시험 검체는 마우스의 귀에 도포할 수 있는 액체, 현탄액, 겔 또는 페이스트(paste)상태이어야 한다. 가능하다면 단계별 희석 용량으로 시험해야 한다. 그렇지 않으면 화학용액이나 현탁액 또는 용출액으로 준비된 최대농도를 사용해야 한다. 전신 독성과 지나친 국소 피부 자극은 시험 결과를 무효화할 수 있다. 따라서 이런 반응은 피해야 한다. 특정 상황에서는 예비 시험이 필요할 수도 있다.

물질/화학물질에 대해 흔히 사용되는 용매는 아세톤 올리브 오일(acetone olive oil, AOO) 4:1 혼합물이다. 친수성이고/또는 귀의 피부에 적절히 붙지 않는 액체 검체는 시험 부위에 잘 붙게 변형해야 한다. 이것은 카르복시메틸셀룰로오스(carboxy methyl cellulose)나 하이드록시에칠셀룰로오스(hydroxyethyl cellulose) (0.5 % w/v)와 같은 물질을 첨가하여 얻을 수 있다.

수용성 화학물질의 경우, DMSO(dimethyl sulfoxide) 또는 DMF(dimethyl formamide)가 계면활성제 Pluronic® L92보다 선호된다. (참고문헌 [89] 참조) 그렇지 않다면 앞서 언급된 다른 용출 용매를 사용할 수 있다. (참고문헌 [88] 참조) 용출액 배지(extract media)에 대한 첨가물의 영향 및/또는 용매 조성에서의 변화를 검증하고 문서화하여야 한다. 이는 흔히 양성대조군으로 사용되는 약한 정도에서 중간 정도의 감작제를 이용한 실험을 통해 검증할 수 있다. 추가적으로 준비된 용출액이 잠재적 감작제의 존재를 검출할 수 있다는 것을 증명하기 위해 양성대조군을 이용하여 시험검체에 대한 첨가(spiking) 시험이 수행될 수 있다. 용출 방법은 제11장(ISO 10993-12)에 기술되어 있다.

각각의 투여를 위해서는 별도의 용출액을 준비해야 한다.

주) 고분자 물질의 용출액 준비를 위한 구체적인 방법에 관한 정보는 부록 E에 제시되어 있다.

6.2.3 동물과 사육관리

다른 계통(strain)이 검증되지 않았다면 CBA/Ca 또는 CBA/J 계통의 건강한 암컷 마우스를 사용해야 한다.(참고문헌 [88] [96] 참조) 몇몇 마우스의 혈통이 승인된 것으로 보고되었다(DBA/2, B6C3F1, BALB/c). (참고문헌 [90] 참조) 마우스는 임신하지 않은, 8-12주령이어야 한다. 각 시험에 사용되는 마우스의 나이가 일치해야 한다(1주령 이내).  수컷 마우스가 암컷의 민감도 수준과 같다면 수컷 마우스를 사용할 수 있다.

동물의 선정 및 사육관리는 제2장(ISO 10993-2)에 따라야 한다. 통상적으로 실험실에서 순화 된 마우스들은 개체식별을 해준다. 특정 시험 검체의 경우, 개체별 우리가 필요할 수 있다. 이에 대해서는 정당한 근거가 있어야 하고 문서화되어야 한다.

주) 집단 사육을 하는 경우에는 교차 오염과 원치 않는 섭취를 고려해야 한다.

6.2.4 시험 과정

화학물질의 경우에 LLNA는 일반적으로 투여량-반응(dose-response) 방식으로 수행된다. 의료기기의 경우에는 시험 검체가 용출액일 수 있다. 이러한 경우에는 시험을 위해 단일 투여량(single dose)만을 이용할 수 있다. 일반적으로 용출액은 희석하지 않고 시험할 수 있다. 하지만 용출액이 독성이 강한 성분을 함유하는 경우에 독성으로 인해 LLNA에서 음성반응을 일으킬 수 있다. 따라서 독성이 강한 용출액을 시험할 때(제5장, ISO 10993-5 참조)는 투여량-반응(dose-response) 방식으로 LLNA를 수행하고 용출액을 희석할 것을 권장한다.

시험과정의 재현성과 민감도를 확인하기 위해서는 잘 알려진 약한 정도에서 중간 정도의  접촉 알레르겐, 예를 들어 메르캅토벤조티아졸(mercaptobenzothiazole), 헥실시나믹알데히드(hexyl cinnamic aldehyde) 및 벤조카인(benzocaine)을 이용한 시험이 각 시험에 포함되어야 한다. 언급된 예는 검체 준비를 위해 사용되는 각 용매(즉, 수계 용매)에는 적합하지 않을 수 있다. 그러한 경우에는 또 다른 양성 대조군이 선정될 수 있고, 이에 대해서는 정당한 근거가 제시되고 문서화하여야 한다. 시험을 자주 실시할 때는 각 시험에 양성 대조군을 포함할 필요가 없지만, 최소 6개월에 한번은 포함해야 한다.

시험 시작과 종료 시에 개체별 체중을 기록해야 한다. 시험 검체의 잠재적 독성을 파악하기 위해서는 시험 중에 임상관찰을 수행하고 기록하여야 한다.

주) 6개월에 한번만 양성대조군을 사용하는 경우, 이 양성 대조군이 음성 결과를 보일 때 과거 6개월에 얻은 결과에 영향을 미칠 수 있다. 참고문헌 [88]에서는 LLNA을 정기적으로 시행하고(즉, 월 1회 이상의 횟수로 LLNA를 실시하고), 음성대조군을 이용하여 일관된 결과를 얻은 이력과 문서화된 방법을 갖추고 있는 실험실에서는 양성 대조물질에 대한 주기적(즉, 6개월 이하의 간격으로) 시험을 고려할 수 있다고 밝히고 있다. 양성 대조군을 매시간 포함하는 대신  주기적으로만 포함하는 것은 각각의 주기적 양성 대조군 시험의 간격 동안에 공존하는 양성대조군 없이 시험되어 얻은 음성 결과의 타당성과 용인성에 대하여 영향을 미칠 수 있음을 아는 것이 중요하다. 예를 들어 위음성 결과를 주기적 양성 대조군 시험에서 얻는 경우에는 마지막으로 승인된 주기적 양성 대조군 시험과 승인되지 않는 주기적 양성 대조군 시험 사이의 간격에서 얻은 모든 음성 시험물질의 결과에 의문이 들 수 있다. 이전의 음성 시험 물질의 결과가 승인된 것을 입증하기 위해서는 실험실에서 추가 비용과 동물 수를 증가시켜 모든 음성 시험을 반복 실시하는 것을 생각할 수 있다.

6.2.5 처리군(Treatment groups)

LLNA 수행 시, 군당 최소 4마리 마우스의 자료가 평가에 사용되어야 한다. 림프절 반응은 개체별 측정에 의해서 또는 혼합된(pooled) 림프절 검체의 측정을 통해 결정될 수 있다. 통계 분석을 위해서는 개체별 측정이 선호된다.

평가를 위해 단일 투여량만 이용할 수 있는 경우, 예를 들어 하나의 용출액 만을 이용할 수 있는 경우에는 개체별 반응을 측정할 때 각 군 당 최소 5마리의 마우스를 사용해야 한다.

처리군에는 다음이 포함되어야 한다.

- 각각의 사용된 용매 유형의 공시험액(부록 A 참조)

- 해당되는 경우, 각각의 사용된 용매에 대한 양성 대조군

- 각각의 사용된 용출 용매에 대한 시험군

단일 화학물질 또는 물질을 시험할 때, LLNA는 투여량-반응 방식으로 수행되어야 한다. 다른 유형의 시험과 검체 같은 용출액의 경우에는 투여량-반응 평가가 실현가능하지 않다. 실험군 하나만 사용할 때는 정당한 근거를 제시하고 문서화하여야 한다.

주) 양성대조군의 용량 반응에 대한 일관성을 입증하는 충분한 자료가 수집된 경우 시험의 민감도를 증명하기 위해 단일용량을 포함시킬 수 있다. (참고문헌 [88] 참조)

3일간 연속으로 25 μl/d 용량씩 지정된 마우스의 양쪽 귀의 뒷(배)면에 적합한 검체를 도포한다. 결과 해석에 간섭할 수 있는 귀의 자극 신호를 매일 관찰한다. (참고문헌 [73], [82], [84] 참조)

6.2.6 세포 증식에 대한 측정 및 조직 준비

배출 림프절(draining lymph nodes)에서의 증식 세포는 방사성 또는 형광성 표지로 표시할 수 있다. 흔히 사용되는 방사성 표지는 3H-methyl thymidine과 125I-iododeoxyuridine인 반면에 형광성 표지로는 fluorodeoxyuridine이 사용될 수 있다.

마지막 처리 후 (72 ± 2)시간이 지난 후에 마우스의 개별 체중을 기록하고 세포 증식에 대한 표지용액을 정맥주사로 투여한다. 3H-methyl thymidine 방사성의 20 μCi(740 KBq) 단위를 함유한 PBS(인산완충액) 0.25ml를 모든 시험군 및 대조군 마우스의 꼬리정맥을 통해 주사한다. 125I-iododexyuridine의 경우에는 2 μCi(74 KBq)을 함유한 PBS 0.25ml를 주사하고, fluorodeoxyuridine의 경우에는 10−5 mol/l을 함유한 0.25ml를 꼬리 정맥에 주사한다. (참고문헌 [88] 참조)

방사성 표지를 필요로 하지 않는 다른 대체 과정을 이용할 수 있으며, 정당한 근거가 있을 때에는 사용될 수 있다[예를 들어, 브로모데옥시우리다인(BrdU), 아데노신삼인산(ATP) 측정(DA 방법)].

주 1) 보다 자세한 정보는 참고문헌 [88], [91], [100], [114] 를 참조.

표지 용액의 투여 후 (5 ± 0.75) 시간이 지난 후에 마우스를 안락사 시킨다. 배출 귓바퀴 림프절(draining auricular lymph node)을 제거한다. 조직 검체의 교차 오염이 생기지 않도록 주의한다. 각 군의 림프절을 혼합하거나, 각 개체별 동물의 양측 림프절(pairs of lymph nodes)을 혼합할 수 있다. 단일세포 준비는 200 μm 스테인리스 와이어 메쉬망이나 나일론 메쉬망을 통해 림프절을 부드럽게 눌러 준비한다. 각 개체별 동물의 자료가 실험군에서 각 동물 간의 변이성을 제공한다면 더욱 좋다. 세포 준비는 원심분리법에 의해 두 번 세척하여 PBS에서 재부유시킨다. 세포는 5%의 트리클로로초산(TCA)으로 (4 ± 2)°C에서 (18 ± 1)시간 동안 침전시킨다. 마지막 원심분리 후에 단계 펠릿(step pellets)를 TCA 1ml로 부유시키고 3H-계수(counting)를 위해 섬광액(scintillation fluid) 10ml가 든 섬광 유리병으로 옮겨 담거나 125I-계수를 위해 바로 감마계수기(gamma counter)로 옮긴다.(참고문헌 [70], [90], [91] 참조)

주 2) 다른 방법으로 표지와 세포 증식의 측정이 체외(ex vivo)로 수행될 수 있다. (참고문헌 [92] [93] 참조)

6.2.7 결과 및 해석

마우스 한 마리당 분(min)당으로 계산하여 림프절 세포에서의 방사성 수준을 측정한다(cpm/mouse). 분당카운트(counts per minute, cpm)를 분당붕괴수(disintegration per minute, dpm)로 변환한다. 각 군의 마우스에 대한 분당계산수(cpm) 또는 분당붕괴수(dpm)의 평균과 표준편차를 계산한다. (참고문헌 [88] 참조) 각 결과에서 배경값(background value)을 뺀다.

시험 분당계산수(cpm) 또는 분당붕괴수(dpm)를 공시험액 분당계산수(cpm) 또는 분당붕괴수(dpm)로 나누어 자극지수(Stimulation Index, SI)를 결정한다. 3 이상(≥ 3.0)의 자극지수(SI)는 시험검체를 감작제로 지정하도록 양성으로 간주해야 한다. (참고문헌 [64] 참조)

양성 대조 검체는 3.0 이상(≥3)의 자극지수(SI)이다.

시험의 유효성을 위해, 양성대조군은 과거 6개월 이내에 또는 매 시험마다 동시에 포함되어야 한다. (참고문헌 [88] 참조)

6.2.8 시험 보고서

시험보고서에는 다음과 같은 내용들이 포함되어야 한다.

1) 시험원자재 또는 의료기기에 대한 설명

2) 시험검체 또는 원자재의 사용목적/적용

3) 시험검체, 시험원자재, 의료기기의 준비에 사용된 방법에 대한 세부적인 설명

4) 시험동물에 대한 설명

5) 귀에 대한 적용방법

6) 세포 증식 결정 방법에 대한 설명

7) 임상과 몸무게 관찰을 포함한 관찰결과의 기록

8) 양성대조군을 포함한 결과의 평가

6.3 피부 감작성 탐지를 위한 기니피그 시험

6.3.1 원리

현재 화학물질과 의료기기의 감작 활성(sensitizing activity)을 탐지하기 위해  사용되는 두 가지 기니피그 시험에는 뷸러시험법(Buehler test)과 GPMT가 있다. 두 시험법 모두 유도(induction)와 유발(challenge) 단계로 구성되고, 과민성반응의 모든 단계를 다룬다.

6.3.2 시험검체 농도의 선정

단일 화학물질에 대한 잠재적 감작성 시험에 관한 현행 지침은 한 가지 농도만을 이용해 시험할 것을 권고하고 있다.

주) 고분자 물질의 용출액 준비를 위한 구체적인 방법에 관한 정보는 부록 E에 제시되어 있다.

6.3.3 유도

감작율은 유도 투여량에 의해 크게 좌우되며, 가능하면 그 양은 중간 정도의 자극을 일으키는 것이어야 한다. 자극 역치(threshold)에 영향을 미치지 않는다면, 가능한 가장 높은 농도를 사용하여야 한다. 그러나 이것이 동물의 건강상태에 영향을 미치는 것이어서는 안 된다. 기니피그 시험법에서 유도투여량은 일반적으로 개체별 기니피그 시험에 대해 설명한 것처럼 예비 시험을 기초로 선택된다.

통상적인 용매로 용출한 용출액이 비경구 투여일 경우, 희석되지 않은 용출액은 예비 시험의 대상으로 하지 않는다.

6.3.4 유발(challenge)

기니피그 시험법에서 유발 농도도 마찬가지로 과거에 시험검체에 노출된 적이 없는 동물의 예비 시험을 근거로 한다. 예비 시험 평가에서 측정된 대로, 자극을 유발하지 않는 최고 투여랑이 사용되어야 한다. 결과에 대한 평가를 용이하게 하기 위해서는 유발 과정에 한 가지 이상의 농도 사용을 권한다(F.2 참조).

6.4 시험결과에 영향을 미치는 중요한 요소

시험검체의 생화학적 특성과 물리적 특성이 시험방법의 선정에 영향을 미친다. 극대화 시험은 피내 주사를 하여야 하므로, 시험동물에 피내 주사를 할 수 없는 경우에는 대체 방법을 사용한다. 용출용액는 무균상태에서 준비되어야 한다. 피내 적용을 위해서는 멸균되지 않은 용액을 사용하여서는 안 된다.

모든 검체에 적합한 용매는 존재하지 않지만, 용해성과 침투력으로 노출을 최적화시켜주는 용매를 선정하여야 한다. 시험검체의 농도는 결과의 해석에 영향을 미치지 않는 범위에서 가장 높은 것이어야 한다. 현탁액이 침전물을 만들어 정확한 양을 투여하는 것이 어렵기 때문에 대부분의 조사자들은 용액상태의 시험검체를 선호한다. 피내 주사를 위한 용매에는 식염수, 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 식물성 유지가 포함된다.

다양한 실험실에서 나온 결과 간 차이의 원인은 여러 가지가 있을 수 있다.

다음의 요소들은 시험과정에서 중요한 것들이다.

- 시험환경상태,

- 동물의 시험부위,

- 털 제거방법(자르기/면도 또는 화학적 탈모),

- 첩포(patch) 모양,

- 시험검체의 양,

- 폐쇄의 특성(quality),

- 노출시간, 동물 관찰결과

동물의 반응성도 유전적 요인 및 관리에 따라 다양하다.

반응의 심한 정도는 해석에 도움이 되기는 하지만, 양성 시험결과를 표시해주는 가장 필수적인 요소는 적절한 대조군들에 대한 (유발; challenge에서) 양성 반응을 나타내는 시험동물의 숫자를 비교하는 것이다. 유발(challenge)시험결과가 모호한 경우, 재유발(rechallenge)로 명확한 결과를 얻을 수 있다. 조직병리학에서는 시험 결과에 대한 평가에 도움이 되는지를 보여주지 못하였다.

시험과정의 재현성과 민감성을 확인하기 위해 양성대조군을 이용한 시험을 정기적으로 수행하여야 한다. 양성 대조군은 가급적 머캡토벤조티아졸, (mercaptobenzothiazole) 핵실시아나믹알데히드 (hexyl ciannamic aldehyde), 벤조카인 (benzocaine)과 같이 약한 정도에서 중간 정도의 접촉 알레르겐이어야 한다. 양성대조군은 최소 6개월에 한번은 수행되어야 한다. (참고문헌 [6] 참조.)

주) 양성 반응을 얻기 위해 중간정도에서 강한 정도의 감작제의 희석물(예를 들어, 포름알데히드와 DNCB)이 사용될 수 있다. 그러나 이 시험법으로 의료기기의 용출액에서 약한 감작제의 반응 또한 확인 할 수 있다는 것을 보증하지는 않는다.

6.5  기니피그 극대화 시험(GPMT)

6.5.1 원리

본 시험은 기니피그 극대화 시험에서 단일 화학 물질에 적용된 기법을 이용하여 기니피그에게 피부 감작을 일으킬 수 있는 시험물질의 잠재성을 평가한다.

6.5.2 시험검체 준비

시험검체는 부록 A에 설명된 바에 따라 시험검체를 준비해야 한다. 시험검체의 농도는 결과의 해석에 영향을 미치지 않는 범위에서 가장 높은 것이어야 한다.(6.5.4.2항 참조)

주) 고분자 물질의 용출액 준비를 위한 구체적인 방법에 관한 정보는 부록 E에 제시되어 있다.

6.5.3 동물과 관리

단일교배종으로(single outbred strain) 암, 수구별 없이 무게가 300g에서 500g인 젊고 건강한 알비노 기니피그 성체를 이용하여야 한다. 암컷을 사용하는 경우에는 출산의 경험이 없고 임신하지 않은 것이어야 한다.

제2장(ISO 10993-2)에 명시되어 있는 바에 따라 동물들을 환경에 순응시키고 관리해야 한다. 필요할 경우, 가장 알맞은 시험농도를 결정하기 위하여 한 세트의 동물로 예비시험을 실시하여야 한다.(6.5.4.2항 참조)

시험물질이 액체이거나 고체인 경우에는 시험검체를 최소 10 마리의 동물에 처리해야 하며, 최소 5마리의 동물을 용매 대조군으로 써야 한다. 예비시험이 필요한 경우에는 추가 동물로 예비시험을 실시하여야 한다.

용출액으로 시험하는 경우에는 시험검체를 최소 10마리의 동물에 처리해야 하며, 최소 5마리의 동물을 용매 대조군으로 써야 한다. 예비시험이 필요한 경우에는 추가 동물로 예비시험을 실시하여야 한다.

10마리의 시험동물과 5마리의 대조동물이 시험에서 완전히 음성을 나타내는 경우에는 10마리의 동물에 5마리를 더한 추가적인 시험에서도 양성결과가 나타나지 않을 것이다. 그러나 만일 반응이 불분명하게 나타난다면 재유발(6.5.6 참조)하여야 한다. 만약 모호한 반응이 지속되면, 최소 20마리의 시험동물과 10마리의 대조동물을 이용하여 새로운 시험을 실시한다.

6.5.4 시험과정

6.5.4.1 준비

시험과정의 모든 단계에 앞서 처리부위의 털을 모두 제거한다.

피내 주사의 경우에는 부위 당 0.1ml씩 주사한다.

국소적 적용의 경우에는, 흡수거즈 첩포(patch) (4cm2-8cm2)나 적합한 여과지를 시험검체로 적시고, 털을 제거한 피부표면에 첩포(patch)를 붙이고 폐쇄드레싱으로 동물 몸통주위를 감싸서 보호한다.

주) 폐쇄드레싱을 보호하기 위해 동물을 감쌀 때는 동물의 정상적인 호흡이 가능하도록 주의해야 한다. 훈련된 전문가가 융통성 있게 붕대를 감는 것이 좋다.

6.5.4.2 예비시험

예비시험은 6.5.4.3항에 있는 본시험에 사용될 시험검체의 농도를 결정하기 위한 것이다.

통상적인 용매로 용출한 용출액을 희석하지 않은 경우, 예비시험의 대상으로 하지 않는다.

최소한 3마리 동물의 옆구리에 일정 범위의 희석된 시험검체를 국소적으로 적용한다. 24시간 후에 첩포와 폐쇄드레싱을 제거하고, 표 14에 제시된 매그누슨과 클리그만 등급 (Magnusson and Kligman grading)을 이용하여 적용부위의 홍반과 부종을 평가한다.

본시험(main test)의 국소적 유도단계에서는, 약간의 홍반은 수반하지만, 동물에게 부작용을 일으키지 않는 범위에서 가장 높은 농도를 선정한다. 의료기기 용출액의 경우, 자극 역치를 얻지 못할 수 있다는 점을 알아야 한다. 그런 경우에는 희석되지 않은 용출액과 같이 가능한 한 가장 높은 농도가 사용되어야 한다. 최종 제품/의료기기 완제품의 경우에는 희석되지 않은 용출액만 시험하는 것으로도 충분할 수 있다.

본시험(main test)의 유발(challenge) 단계에서는 홍반을 일으키지 않는 범위에서 가장 높은 농도를 선정한다.

표 14  매그누슨과 클리그만 (Magnusson and Kligman) 등급표

첩포(patch) 시험 반응	등급
눈에 띄는 변화 없음	0
분리성 또는 반성 홍반	1
중간 정도의 홍반과 융합성 홍반	2
심한 홍반과 부풀어 오름	3

프로이드 완전 보조제(Freund's complete adjuvant, FCA)를 모든 동물에 전처리로 주사할 때, 본시험이 진행되는 동안 과민피부 가능성과 그로 인한 판독(reading) 간섭을 고려하여야 한다.

6.5.4.3 본시험(main test)

6.5.4.3.1 피내 유도단계

그림 4에 제시되어 있는 것처럼 털을 제거한 견갑골 내 부위(intrascapular region)에 있는 주사부위 (A, B, C)에 검체 0.1ml를 양쪽에 피내 주사한다.

부위 A : 안정된 프로이드 완전 보조제 현탁액과 선정된 용매를 50 : 50 (양)의 비율로 혼합한다. 수용성 물질의 경우에는 생리식염수 (대한약전 또는 이에 상응하는)를 사용한다.

부위 B : 시험검체 (희석하지 않은 용출액) : 대조동물에는 용매만을 주사한다.

부위 C : 부위 B에 사용된 농도와 같은 농도의 시험검체를 프루인드 완전 보조제 에멀젼과 용매를 50 : 50 (부피 비; 50%)으로 혼합하여 유화시킨다. 대조동물에 보조제와 함께 공 시험액 에멀젼을 주사한다.

6.5.4.3.2 국소유도단계

피내유도단계가 완료된 지 7일 (±1)이 지나면 피내 주사부위(그림4)를 덮을 수 있도록 약 8cm2 크기의 첩포(여과지 또는 흡수성 거즈)를 이용하여 시험검체를 개별동물의 견갑골 내 부위(intrascapular region)에 국소적으로 적용한다. 6.5.4.3.1항에서 부위B에 투여한 농도를 사용한다. 만약 6.5.4.3.1항에서 구할 수 있는 최대농도가 자극을 일으키지 않는다면, 첩포(patch)를 붙이기 24 ± 2시간 전에 10%의 SDS(소디움 도데실 나트륨;sodium dodecyl sulfate)로 피부를 마사지 하여 해당부위를 전처리한다. 폐쇄드레싱으로 적용부위를 보호한다. 48 ± 2시간이 지난 후에 드레싱과 첩포(patch)를 제거한다.

준비한 용출액을 바로 사용하도록 한다. 만일 24 ± 2시간 이상 용출액을 보관하는 경우, 보관 조건에서 용출액의 안정성을 검증하여야 한다.

유사하게 공시험액만으로 대조동물을 처리한다.

		머리쪽
0.1ml 피내 주사	┏	A	A	┓	0.1ml 피내 주사
	┃	B	B	┃
	┃ ┗	C	C	┃ ┛
			*	━	털을 제거한 견갑골내 부위
		꼬리쪽

그림 4 피내 주사 부위의 위치

6.5.4.3.3 유발 단계(challenge phase)

국소유도단계가 완료된 후 (14 ± 1)일이 지나고 나면 모든 시험동물과 대조동물을 시험검체로 유발시킨다. 부위 C에 대해 6.5.4.3.1항에서 선정한 농도와 동일한 농도의 시험검체로 첩포(patch) 또는 챔버(chamber)를 적신 후 이를 이용하여 유도단계가 진행되는 동안 처리하지 않은 부위(옆구리 위쪽 부위)에 시험검체와 공시험액을 국소적으로 적용한다. 이 희석농도는 처리하지 않은 다른 부위에 유사한 방법으로 적용할 수도 있다. 폐쇄드레싱으로 보호해야 한다. 24 ± 2시간이 지난 후에 드레싱과 첩포(patch)를 제거한다.

6.5.5 동물의 관찰

드레싱을 제거하고 (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간 후에 시험동물과 대조동물의 유발된 피부부위의 모습을 관찰한다. 피부반응을 시각화하기 위하여 전 파장(full spectrum)조명이나 자연조명을 이용할 것을 권장한다. 표 14에 제시되어 있는 매그누슨과 클리그만 등급에 따라 매 시간 간격마다 각각의 적용부위에 대한 피부홍반과 부종반응 등급을 매기고, 이를 설명한다. 결과에 대한 평가에서 선입견을 최소화하기 위하여 처리방법에 관한 정보 없이 해석하도록 한다.

6.5.6 결과의 평가

대조동물의 매그누슨과 클리그만 등급이 1등급 미만을 나타내고, 시험군에서 1등급 이상인 경우 일반적으로 감작성을 나타낸다고 할 수 있다. 만일 대조동물이 1등급 이상으로 나타났다면, 시험동물에서의 반응은 감작 때문에 대조동물에서의 가장 심한 반응보다 더 심하게 나타날 것이라고 추정한다. 만일 반응이 불분명한 경우에는 첫 번째 유발시험의 결과를 확인하기 위하여 재유발할 것을 권고한다. 시험결과는 시험동물과 대조동물의 양성유발결과의 빈도수로 표시한다.

경우에 따라서 반응의 강도는 대조군에서 나타나는 것보다는 약하더라도 반응을 나타내는 동물들의 숫자가 대조군보다 시험군에 더 많기도 하다. 이런 경우에는 반응을 명확하게 규정하기 위해 재유발이 필요할 수도 있다. 재유발은 첫 번째 유발이 끝나고 1주에서 2주가 지난 후에 실시하여야 한다. 첫 번째 유발 방법과 동일한 방법을 사용하며, 동물 옆구리의 다른 부분을 이용한다.

6.5.7 시험보고서

시험보고서에는 다음과 같은 내용들이 포함되어야 한다.

1) 시험원자재 또는 의료기기에 대한 설명

2) 시험검체 또는 원자재의 사용목적/적용

3) 시험검체, 시험원자재, 의료기기의 준비에 사용된 방법에 대한 세부적인 설명

4) 시험동물에 대한 설명

5) 시험부위에 대한 적용방법

6) 적용부위의 표시방법과 관찰내용

7) 관찰결과의 기록

8) 결과의 평가

6.6 폐쇄 첩포(patch) 시험(Buehler test)

6.6.1 원리

기니피그에게 피부 감작을 일으킬 수 있는 시험물질의 잠재성을 평가한다.

6.6.2 시험검체 준비

시험검체는 부록 A에 설명되어 있는 바에 따라 준비하여야 한다. 시험 검체의 농도는 결과의 해석에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 가장 높은 것이어야 한다(6.6.4.2 참조). 인체에 국소적으로 적용하는 의료기기 중 모양과 크기가 적절한 경우, 예를 들어 전극(electrode)은 그 자체로 부착될 수도 있다.

6.6.3 동물과 관리

단일교배종으로(single outbred strain) 암, 수구별 없이 무게가 300g에서 500g인 젊고 건강한 알비노 기니피그 성체를 이용하여야 한다. 암컷을 사용하는 경우에는 출산의 경험이 없고 임신하지 않은 것이어야 한다.

제2장(ISO 10993-2)에 명시되어 있는 바에 따라 동물들을 환경에 순응시키고, 관리해야 한다. 가장 알맞은 시험농도를 결정하기 위하여 한 세트의 동물로 예비시험을 실시하여야 한다(6.5.4.2항 참조).

시험물질이 액체이거나 고체인 경우에는 시험검체를 최소 10 마리의 동물에 처리해야 하며, 최소 5마리의 동물을 용매 대조군으로 써야 한다. 예비시험이 필요한 경우에는 추가 동물로 예비시험을 실시하여야 한다.

용출액으로 시험하는 경우에는 시험검체를 최소 10마리의 동물에 처리해야 하며, 최소 5마리의 동물을 용매 대조군으로 써야 한다. 예비시험이 필요한 경우에는 추가 동물로 예비시험을 실시하여야 한다.

10마리의 시험동물과 5마리의 대조동물이 시험에서 완전히 음성을 나타내는 경우에는 10마리의 동물에 5마리를 더한 추가적인 시험에서도 양성 결과가 나타나지 않을 것이다. 그러나 만일 반응이 불분명하게 나타난다면 재유발(6.5.6 항 참조) 하여야 한다. 만약 모호한 반응이 지속되면, 최소 20마리의 시험동물과 10마리의 대조동물을 이용하여 새로운 시험을 실시한다.

6.6.4 시험과정

6.6.4.1 준비

시험과정의 모든 단계에 앞서 처리부위의 털을 모두 제거한다.

국소부위 적용의 경우에는 적당한 크기의 첩포 (여과지 또는 흡수 거즈)를 시험물질이나 용출액으로 적시고, 털을 제거한 부위에 붙이고 폐쇄드레싱으로 덮은 후 (6 ± 0.5)시간 동안 둔다. 시험부위를 안전하게 하기 위하여 각각의 동물들을 가두어 둘 수 있다.

주) 폐쇄드레싱을 보호하기 위해 동물을 감쌀 때는 동물의 정상적인 호흡이 가능하도록 주의해야 한다. 훈련된 전문가가 융통성 있게 붕대를 감는 것이 좋다.

6.6.4.2 예비시험

예비시험은 6.6.4.3항에 있는 본시험에 사용될 시험검체의 농도를 결정하기 위한 것이다.

국소적 용도의 의료기기와 통상적 용매로 용출한 용출액이 희석되지 않은 경우, 예비시험을 시행할 필요가 없다.

최소한 3마리 이상의 동물 옆구리에 적합한 첩포(patch)를 이용하여 4가지 농도의 시험검체를 국소적으로 적용한다. (6 ± 0.5)시간이 지난 후에 폐쇄드레싱과 첩포(patch)를 제거한다. 첩포를 제거한 후 (24 ± 2)시간, (48 ± 2) 시간이 지나면 표 14에 있는 매그누슨과 클리그만 등급을 이용해 적용부위의 홍반과 부종을 평가한다.

다음의 사항을 결정한다.

1) 본시험의 유도단계의 경우에 대해, 약간의 홍반은 수반하지만, 동물에게 부작용을 일으키지 않는 범위에서 가장 높은 농도를 선정한다.

2) 본시험의 유발단계의 경우에 대해 홍반을 일으키지 않는 범위에서 가장 높은 농도를 선정한다.

6.6.4.3 본시험(main test)

6.6.4.3.1 유도단계

6.6.4.2 1)항에서 선정한 농도와 동일한 농도의 시험검체로 적신 적합한 첩포(patch)를 이용하여 각 동물의 털을 제거한 등 왼쪽 윗부분에 국소적으로 시험검체를 적용한다. (6 ± 0.5) 시간 후에 가두어 두었던 것을 풀어주고 폐쇄드레싱과 첩포를 제거한다. 이와 같은 과정을 3주에 걸쳐 매 주마다 3일 동안 반복한다. 공시험액만을 이용하여 유사한 방법으로 대조동물을 처리한다.

6.6.4.3.2 유발단계 (Challenge phase)

국소 유도단계가 완료된 후 (14 ± 1)일이 지나고 나면 시험검체로 모든 시험동물과 대조동물을 유발시킨다. 6.6.4.2 2)항에서 선정한 농도와 동일한 농도의 시험검체로 적신 적합한 첩포를 이용하여 털을 제거한 시험되지 않은 부위에 시험검체를 국소적으로 적용한다. (6 ± 0.5)시간 후에 가두었던 것을 풀어주고 폐쇄드레싱과 첩포(patch)를 제거한다.

6.6.5 동물의 관찰

최초의 유발이나 재 유발 노출 후 (24 ± 2)시간이 지난 후에

1) 제조업체의 설명서에 따라 시험부위와 그 주변에 상업용 탈모제를 발라서 털을 제거하거나,

2) 모든 동물의 유발 부위와 그 주변을 면도한다.

털을 제거한 부위를 따뜻한 물로 완전히 닦아내고 수건으로 말린 후 우리(cage)에 다시 넣어둔다. 털을 제거한 후 최소 2시간이 지나면 표 14에 제시된 바에 따라 시험부위의 등급을 매긴다. 유발 첩포(patch)를 제거한 후 48±2시간이 지나면 등급을 다시 매긴다. 피부 반응을 시각화하기 위하여 전 파장(full-spectrum) 조명이나 자연 조명을 이용할 것을 권장한다. 결과에 대한 평가에서 선입견을 최소화하기 위하여 처리방법에 관한 정보 없이 해석할 것을 권고한다.

6.6.6 결과의 평가

대조동물의 매그누슨과 클리그만 등급이 1등급 미만을 나타내고, 시험군에서 1 등급 이상인 경우 일반적으로 감작성을 나타낸다고 할 수 있다. 만일 대조동물이 1등급 이상으로 나타났다면, 시험동물에서의 반응은 감작 때문에 대조동물에서의 가장 심한 반응보다 더 심하게 나타날 것이라고 추정한다. 첫 번째 유발의 결과를 확인하기 위해 재유발이 권장된다. 시험결과는 시험동물과 대조동물의 양성 유발결과의 빈도수로 표시한다.

경우에 따라서 반응의 강도는 대조군에서 나타나는 것보다는 약하더라도 반응을 나타내는 동물들의 숫자가 대조군보다 시험군에 더 많기도 하다. 이런 경우에는 반응을 명확하게 규정하기 위해 재유발이 필요할 수도 있다. 재유발은 첫 번째 유발이 끝나고 1주에서 2주가 지난 후에 실시하여야 한다. 첫 번째 유발 방법과 동일한 방법을 사용하며, 동물의 옆구리에서 다른 부분을 이용한다.

이러한 상황에서는 새로운 음성 대조군을 권장한다.

6.6.7 시험보고서

시험보고서에는 다음과 같은 내용들이 포함되어야 한다.

1) 시험원자재 또는 의료기기에 대한 설명

2) 시험검체 또는 원자재의 사용목적/적용

3) 시험검체, 시험원자재, 의료기기의 준비에 사용된 방법에 대한 세부적인 설명

4) 시험동물에 대한 설명

5) 시험부위에 대한 적용방법

6) 적용부위의 표시방법과 관찰내용

7) 관찰결과의 기록

8) 통계적 방법을 포함한 결과의 평가

7. 시험결과의 해석에 있어 핵심적인 요소들

이 규격에 수록되어 있는 시험방법은 안전한 제품을 개발하기 위한 중요한 장치들이며, 자격을 갖춘 사람들에 의해 시행되고, 해석되어야 한다.

시험과정에서 사용된 시험검체의 양이 실제 사용 조건과 비교해 과장될 수 있기 때문에 어떤 방법을 통해 자극과 피부 감작성의 증거가 나타났다고 해서 시험물질이나 의료기기를 사용하지 말아야 하는 것은 아니다. 상기 과정을 이용하여 발생한 부작용은 예정 인체 노출에 대한 위험평가의 추가 분석의 필요성을 나타낸 것이다.

이 장에서 설명된 과정에 의해 발생하는 시험 예측 결과는 독립적일 수 없다. 음성 시험 결과가 제품이 알레르기 피부 반응을 일으킬 수 있는 가능성을 항상 배제하는 것은 아니다.

위양성(false positive), 위음성(false-negative)과 같은 잘못된 결과를 최소화하기 위하여 평가를 통해 제시된 음성 시험결과와 양성 시험결과는 모두 엄격한 재조사를 실시해 철저하게 검증하여야 한다. 다음과 같은 다양한 정보의 출처를 비교하여 결과를 입증하여야 한다.

1) 산업계와 소비자 불만 자료

2) 유사한 성분이 포함되어 있는 의료기기에 대한 정보

3) 피부과에서 실시한 진단시험 결과

4) 소급적 역학자료

부록 A

자극성/감작성 시험을 위한 원자재의 준비

A.1 개요

자극성/감작성 시험을 실시하고 여기에서 얻은 자료를 해석할 때에는, 사람에 대한 의료기기의 노출조건과 기간, 빈도수, 정도, 특성이 고려되어야 한다. 이 시험에서 중요한 변수 가운데 하나가 시험원자재의 준비이다.

A.2 직접 접촉 노출 원자재

A.2.1 고형 시험원자재

적합한 물리적 상태 (예를 들어, 시트, 필름)에 있는 고형원자재를 변형시키지 않고 시험에 사용해야 한다. 두께는 일반적으로 사용되는 두께로 하되 0.5cm를 넘지 않도록 하며, 크기는 2.5cm × 2.5cm가 되도록 검체를 준비한다. 동일한 방법으로 적합한 음성 대조군을 준비한다. 음성 대조군은 물리적으로 시험원자재와 아주 유사한 것이어야 하며, 비자극성이어야 한다. 적합한 대조군이 없는 경우에는 흡수성 거즈(absorbent gauze)를 대신 사용한다.

고체는 분쇄를 하는 동안 오염되지 않도록 각별한 주위를 기울여 가루로 만들거나 조직과 접촉이 잘 되도록 적합한 비자극성 용매나 물을 이용해 충분히 적시게 한다. 반드시 가루로 만들어야 하는 세라믹의 경우에는 분쇄로 인해 세라믹의 물리화학적 특성이 바뀔 수도 있다는 사실을 명심해야 한다.

분말(예를 들어, 고흡수성)은 직접 적용하거나 적절한 용매로 반죽을 만들어 적용시켜 시험하여야 한다. 동일한 용매를 이용하는 대조군은 현탁되거나 희석되고 젖은 시험원자재와 동시에 평가해야 한다.

주) 표면적 및/또는 입자의 크기는 염증성과 면역반응에 중요한 역할을 하는 식세포 작용과 같은 생물학적 반응에 있어서 중요한 요소이다.

A.2.2 액상 시험원자재

액체는 희석하지 않고 직접 적용하거나, 그럴 수 없을 경우에는 적합한 용매로 희석시켜 사용한다. 동일한 용매를 이용하는 대조군은 희석시킨 시험검체와 동시에 평가해야 한다.

A.3 시험원자재의 용출액

고체는 고체의 용출액을 준비하여 사용한다. 용출액을 사용하는 경우에는 극성, 비극성 및/또는 적절한 경우 추가 용매를 이용하여 “제11장(ISO 10993-12) 검체준비방법과 참고물질”에 설명되어 있는 방법에 따라 용출액을 준비해야 한다. 용출 방법의 적합성에 대한 이론적 근거를 제시하여야 한다.

용출 용매를 이용하는 공시험액은 시험원자재의 용출액과 동시에 평가해야 한다.

A.4 용매

시험원자재를 용출, 희석, 현탁시키거나 적셔야 하는 경우에는 적합한 비자극성 용매를 이용해야 한다. “제11장(ISO 10993-12) 검체준비방법과 참고물질”에 적합한 용매 목록이 수록되어 있다.

A.5 멸균 시험원자재

완제품이 멸균 상태로 공급되는 경우에는, 시험 전에 이와 동일한 방법으로 시험원자재를 멸균해야 한다. 산화에틸렌으로 멸균하는 제품의 경우 산화에틸렌과 그것의 반응물이 이 규격의 시험에서 생물학적 반응을 일으킬 수 있다는 점에서 기술적 어려움이 존재한다.

자극 반응이 관찰되는 경우에는 산화에틸렌 잔류물이 미치는 영향과 시험원자재가 미치는 영향 사이의 차이를 구분하기 위하여 의료기기의 산화에틸렌 멸균 전 후 반응평가를 고려하여야 한다.

부록 B

추가 자극성 시험방법

B.1 개요

다음의 특정한 시험방법들은 특정한 부위에 사용하려는 의료기기에만 해당된다. 시험방법을 선정할 때에는 관련된 이론적 근거를 제시하여야 한다.

B.2 안자극성 시험

B.2.1 개요

안자극성 시험은 다른 방법으로 안전성 자료를 구할 수 없을 경우에만 고려하여야 하고, 눈 또는 눈꺼풀에 접촉을 하게 될 원자재의 경우에만 수행하여야 한다.

최근 ICCVAM에서는 4 가지의 체외 대체 시험 시스템을 평가하였고, 그 중 2가지는 심각한 자극 및 부식을 확인하기 위한 체내 동물시험을 대체하기 위해 개발되었다. BCOP 시험법(Bovine Corneal Opacity and Permeability test)과 ICE(Isolated Chicken Eye) 시험법이 이에 속한다. (참고문헌 [107] 참조) 약한 자극제(irritnats)에 대해서는 체내 시험이 여전히 필요할 수 있다.

B.2.2 원리

안자극을 유발하는 시험조건에서 재료의 안자극 유발 가능성 평가

B.2.3 시험에서 제외하는 경우

피부 시험에서 심한 자극을 일으키거나 명백한 자극제로 입증된 원자재 및/또는 완제품은 안자극성에 대해 추가적인 시험을 실시하지 않는다. 피부 자극성을 나타내거나 pH ≤ 2 또는 ≥ 11.5 인 원자재는 시험하지 않으며, 안자극성을 일으킬 가능성이 있는 것으로 간주한다.

추가적인 위험 특성분석/측정(risk characterization/assessment)이 필요한 경우를 제외하고, 자극성이 극미한 시험물질에 대해 시험이 필요할 수 있다.  이러한 경우에는 근거를 제시하고 문서화하여야 한다.

B.2.4 시험원자재

시험원자재가 액체인 경우에는, 0.1ml 정도를 희석시키지 말고 그대로 한쪽 눈의 아래쪽 결막낭에 주입시킨다. 시험원자재가 고체나 알갱이(granular product)일 경우에는 미세한 분말로 갈아서 사용한다. 분말이 형성되면 0.1ml 정도의 부피의 양(100mg을 넘지 않아야 함)을 한쪽 눈의 아래쪽 결막낭에 주입시킨다.

주) 어떤 물질들은 눈에 직접 시험하기에는 적합하지 않다. 눈을 다치게 하여 시험 자체를 의미 없게 만들 수 있다.

시험원자재가 펌프식으로 된 분무기에 들어 있을 때에는 0.1ml를 분사시켜 액체와 마찬가지로 주입한다. 시험재료가 에어로졸 용기에 들어 있는 경우에는 다음 중 하나의 방법으로 검사한다.

1) 눈을 뜬 상태에서 눈 앞 약 10cm 정도의 거리에서 1초간 뿌려주거나

2) 차가운 용기에 에어로졸을 분사하여 액체의 경우와 동일하게 시험한다.

시험원자재가 용출액으로만 적용할 수 있는 것이라면, 부록A에 나와 있는 대로 용출액을 준비하도록 한다. 0.1ml 정도의 용출액을 한쪽 눈의 아래쪽 결막낭에 주입시킨다.

위에서 언급한 것과 동일한 조건하에서 시험검체 없이 극성과 비극성 용매를 사용하여 공시험액을 준비한다.

B.2.5 동물과 관리

동일한 혈통으로 암, 수 구별 없이 무게가 2kg～3kg인 건강하고 어린 알비노 토끼 성체를 이용하여야 한다. 제2장(ISO 10993-2)에 명시되어 있는 바에 따라 동물들을 환경에 순응시키고, 관리해야 한다.  최초에는 1마리의 동물을 이용해 시험원자재를 평가해야 한다. 1마리 동물에게서 명확한 양성 반응 (표 B.1 참조)이 나타나는 경우에는 추가적인 시험을 시행할 필요가 없다. 고체나 액체 원자재에 대한 명확한 반응이 관찰되지 않는 경우에는 최소 2마리의 동물을 추가하여 사용해야 한다. 용출액의 경우에는 용출액 당 최소 2마리의 동물을 이용하여야 한다.

최소한 세 마리를 가지고 시험을 했는데도 그 결과가 명확하지 않다면, 추가적인 시험을 행한다.

B.2.6 시험방법

시험을 시작하기 최소한 24시간 전에 각각의 토끼의 양쪽 눈을 육안으로 검사하여 이상이 없음을 확인해야 한다. 만약 한 쪽이라도 이상이 있으면 다른 것으로 대체하도록 한다.

눈을 시험할 때는 각막 손상을 시각화하기 위하여 2%의 플루오레세인나트륨 (sodium fluorescein) BP (영국 약전)을 사용하기도 한다. 검안경이나 수동식 세극등 또는 기타 적합한 기기를 이용할 것을 권고한다.

B2.4에 언급된 대로 한쪽 눈에 삽입한다.

투여 후 약 1초간 토끼의 눈꺼풀을 잡는다.

각 동물의 반대쪽 눈은 대조군으로 이용하며, 용출액을 시험하는 경우에는 공시험액으로 처리하여야 한다.

원자재의 반복적인 노출이 예상되고 시험재료가 급성 시험에서 유의성 있는 반응을 보이지 않았다면 반복 노출 시험을 수행할 수도 있다. 반복 노출은 급성 노출 시험 이 끝난 이후에만 (최소 72시간이 지난 뒤에) 실시하여야 한다. 노출 기간은 임상적인 상황 하에서의 시험원자재 및 의료기기의 사용 기간과 비슷하게 조작하도록 한다.

B.2.7 동물의 관찰

시험원자재를 한번 주입한 동물에 대해서는 주입 후 (1 ± 0.1)시간, (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간 및 (72 ± 2)시간 마다 각 동물의 양쪽 눈을 검사한다.

외상이 지속적으로 존재할 경우에는 외상의 진행여부와 가역성을 알아보기 위하여 관찰기간을 연장할 필요가 있을 수 있으나, 이러한 경우에도 21일을 초과할 필요는 없다. 외상이 심한 경우에는 관찰기간을 연장하지 않는다.

주) ISO 9394[25]는 콘택트렌즈 시험에 관한 지침을 제시하며, 이 지침은 하루에 8시간씩 21일 동안 노출시키도록 하고 있다. 이는 동 지침에 대한 예외이다.

표 B.1의 눈의 외상등급에 대한 척도에 따라 관찰된 반응을 모두 기록하고 등급을 정한다.

시험원자재를 여러 번 주입한 동물에 대해서는 주입 직전 및 (1 ± 0.1)시간 후에 각 동물의 양쪽 눈을 검사한다.

만약, 최종적인 처리 후에 자극성의 징후가 나타나면 좀 더 관찰을 하도록 한다. 지속적인 각막 질환 및 다른 안자극이 발생한다면 진행정도와 가역성여부를 확인하기 위하여 관찰을 좀 더 연장할 수 있다.

표 B.1에 따라 관찰된 반응을 모두 기록하고 등급을 정한다.

만약에 다음과 같은 상황을 보이면 해당동물을 즉시 회수하여 인도적인 방법으로 폐사시킨다.

1) 아주 심한 눈의 손상(예를 들어, 결막이 벗겨지거나, 궤양이 생기거나, 각막에 구멍이 생기거나 눈의 전방에 피나 고름이 생길 경우)이 있거나,

2) 혈액이 섞인 혹은 화농성의 진물이 날 때,

3) 심각한 각막의 궤양이 관찰될 때

표 B.1에 제시된 등급 체계에서 최대 영향치를 나타나는 동물은 시험에서 제외시키고, 안락사 시킨다.

- 광반사 (2등급의 홍채 반응)를 하지 않거나 또는 (24 ± 2)시간 내에 회복될 조짐이 없는 각막 혼탁 (4등급)

- (48 ± 2) 시간 내에 회복될 조짐이 없는 최대 결막 염증 (충혈 3등급을 수반한 결막 부종 4등급)

B.2.8 결과의 평가

시험군의 눈과 대조군의 눈 사이의 차이는 표 B.1에 사용된 분류체계에 따라 특성을 규정하고 설명되어야 한다.

1) 급성 노출

관찰의 어느 단계에서든지 눈을 처리한 동물 가운데 1마리 이상이 양성 결과를 나타내는 경우에는 (표B.1의 각주가 있는 등급) 원자재에 안자극성이 있는 것으로 간주하며, 추가 시험은 실시하지 않는다.

관찰의 어느 단계에서든지 처리한 3마리 동물 가운데 1마리가 중간 정도 혹은 가벼운 반응을 나타내거나 반응이 불분명한 경우에는 동물을 추가로 처리한다. 추가적인 동물시험에서 시험군의 절반 이상에서 양성반응을 나타내면 안자극이 있다고 볼 수 있다. (표B.1의 각주가 있는 등급)

한 동물에서라도 심각한 반응을 나타내면 충분히 안자극성이 있는 원자재로 간주할 수 있다.

2) 반복 노출

관찰의 어느 단계에서든지 시험군 안에 있는 동물의 절반 이상이 양성 결과 (표 B.1의 각주가 있는 등급)를 나타내는 경우에는 시험원자재에 안자극성이 있는 것으로 간주한다.

B.2.9 시험보고서

시험보고서는 다음사항을 포함해야 한다.

1) 시험검체에 대한 설명

2) 시험검체의 사용목적/적용

3) 시험검체를 준비하는데 사용된 방법에 대한 세부적인 설명

4) 시험동물에 대한 설명

5) 투여 방법

6) 눈 해석방법

7) 관찰결과의 기록

8) 결과의 평가

반응	등급
1. 각막
혼탁의 정도(가장 밀도가 높은 부분)
-혼탁도 없음	0
-혼탁이 부분적으로 산재 또는 분산된 부분, 홍채의 세부구조가 뚜렷하게 보임	1a
-쉽게 분별할 수 있는 반투명한 부분, 홍채의 세부구조가 약간 흐릿하게 보임	2a
-젖빛을 띠는 부분, 홍채의 세부구조가 보이지 않고, 동공의 크기를 거의 구분할 수 없음	3a
-혼탁, 홍채의 세부구조가 보이지 않음	4a
관련된 각막의 면적
-1/4(또는 미만), 0은 아님	0
-1/4이상 1/2 이하	1
-1/2이상 1/3 이하	2
-3/4이상에서 전체 면적까지	3
2. 홍채
정상	0
-정상 이상의 주름, 충혈, 팽창, 각막 주변 혈관 충혈(이 가운데 어느 조합이나 또는 모든 조합), 홍채가 여전히 빛에 반응을 보임(느린 반응도 양성임)	1a
-빛에 대한 반응이 없음, 출혈, 전반적인 파괴(이 가운데 한 가지 또는 모두)	2a
3. 결막
충혈(각막과 홍채를 제외한 구상 결막과 안검 결막을 말함)
-정상 혈관	0
-정상 보다 확실하게 충혈된 혈관	1
-충혈이 조금 더 분산되어 있고, 진홍색이고, 개개의 혈관이 쉽게 구별되지 않음	2a
-적색이 분산되어 있음	3a
결막부종
-부종 없음	0
-정상 이상의 부종(순막[nictitating membrane] 포함)	1
-눈꺼풀이 약간 뒤집힌 명백한 부종	2a
-눈꺼풀이 반 정도 감긴 부종	3a
-눈꺼풀이 반 정도에서 완전히 감긴 부종	4a
고름(Discharge)
-고름 없음	0
-정상과는 차이가 있는 양(정상 동물의 안쪽 눈가에서 소량이 관찰되는 것은 제외)	1
-눈꺼풀과 눈꺼풀 바로 주변의 눈썹을 적시는 고름	2
-눈꺼풀과 눈썹 그리고 눈 주변의 상당 부분을 적시는 고름	3
a는 양성 결과

표 B.1 안구 병변 등급 체계

B.3 구강 점막 자극성 시험

B.3.1 개요

구강 자극성 시험은 구강 조직에 접촉을 하게 될 원자재에 대해 시험하고자 하는 경우, 그리고 다른 방법으로 안전성 자료를 구할 수 없을 경우에만 고려하여야 한다.

B.3.2 원리

구강 조직에 자극을 일으키는 시험에 대한 원자재의 구강 조직 자극 유발 가능성을 평가한다.

B.3.3 시험에서 제외하는 경우

피부 자극이나 눈 자극을 일으키는 원자재 또는 pH ≤ 2 또는 ≥ 11.5 인 원자재는 시험을 실시하지 않으며, 구강 조직 자극의 가능성이 있는 것으로 간주한다.

위험 특성분석/평가(risk characterization/assessment)가 필요한 예외적인 경우에는 자극성이 있는 원자재 또는 앞에서 언급된 pH의 범위를 벗어나는 원자재에 대해서 시험이 필요할 수 있다. 이러한 경우에는 근거를 제시하고 문서화하여야 한다.

B.3.4 시험물질

부록A에 따라 시험물질을 준비한다.

B.3.5 동물과 관리

동일한 계통으로 암, 수 구별 없이 건강하고 어린 시리아 햄스터 성체를 이용하여야 한다. 제2장(ISO 10993-2)에 명시되어 있는 바에 따라 동물들을 환경에 순응시키고, 관리해야 한다.

적절한 경우 폭이 3mm～4mm인 적합한 목걸이를 각 동물의 목둘레에 끼운다. 정상적으로 먹이를 주고 호흡을 하도록 하되 동물이 생면 펠리트(pellet)를 제거하지 못하도록 한다. 시험 기간 동안 매일 7일 간 각 동물의 몸무게를 측정한다. 이 기간 동안 체중이 감소한 동물이 있는 지 검사하고, 목걸이를 조절한다. 체중이 지속적으로 감소하는 동물은 시험에서 배제한다.

처음부터 최소 3마리의 동물을 이용해 시험원자재를 평가해야 한다.

주) 음성 대조군이나 공시험액으로 처리된 추가 동물을 사용하는 것이 적합할 수도 있다.

최초의 시험에서 반응이 명확하지 않거나 불분명하게 나타나는 경우에는 추가적인 시험을 고려해야 한다.

B.3.6 시험방법

각각의 동물에게서 목걸이를 제거하고 볼 주머니(cheek pouches)를 뒤집는다. 생리식염수로 주머니(pouches)를 닦고, 이상이 있는 지 검사한다.

고형 시험원자재의 경우는 볼 주머니 안으로 검체를 직접 집어넣는다.(지름이 5mm를 넘지 않는 경우)

액상 시험원자재나 용출액의 경우, 생면 펠리트를 검체에 적신다. 흡수량을 기록하고 각 동물의 한쪽 볼 주머니에 펠리트를 집어넣는다. 이 방법 대신 적합한 양의 검체를 볼 주머니 안으로 흘려보내기도 한다.

대조군으로 이용하는 다른 볼주머니 속에는 검체를 집어넣지 않는다. 적합한 대조동물을 동시에 시험해야 한다.

필요한 경우에는 목걸이를 교체하고 동물을 우리에 다시 넣는다.

노출 기간은 시험원자재의 실제 사용 기간과 유사해야 하지만, 5분 이상은 되어야 한다.

노출이 끝나면 목걸이와 생면 펠리트를 제거하고 주머니를 생리식염수로 씻어내어, 다른 주머니를 오염시키지 않도록 주의한다.

급성 노출 시험의 경우에는 4시간 동안 매시간(±0.1 시간) 간격으로 위 과정을 반복한다.

반복 노출 시험의 경우에는 임상적 상태에서의 노출 시간 간격과 기간, 적용 횟수를 근거로 한다.

B.3.7 동물의 관찰

반복 노출이 필요한 경우에는 다음번 투여에 앞서 즉각적으로 펠리트를 제거한 후 육안으로 검사한다.

각 동물의 볼 주머니 모양을 기술하고, 매 시간 간격마다 표 B.2에 제시된 체계에 따라 각각의 동물 주머니 표면에 나타나는 홍반에 반응 등급을 매긴다. 시험보고서를 위해 결과를 기록한다.

마지막 처리가 끝나고 (24 ± 2)시간이 지나면 볼 주머니를 육안으로 검사한다. 햄스터를 안락사 시키고, 주머니의 반응 부위에서 조직 검체를 제거한다. 조직 검사를 하기 위한 처리에 앞서 적합한 정착제에 담가둔다.

표 B.2 구강 및 음경 반응에 대한 등급 체계

반 응	등급 수치
홍반과 가피 형성 홍반 없음 아주 약간의 홍반 (거의 지각할 수 없는) 잘 형성된 홍반 중간 정도의 홍반 가피의 형성으로 홍반의 등급을 매기지 못하는 심한 홍반 (발적)	0 1 2 3 4
기타 조직의 부작용들도 기록하고 보고하여야 한다.

B.3.8 결과의 평가

B.3.8.1 육안 평가

처리하지 않은 볼 주머니를 반대쪽의 볼 주머니와 비교하고, 대조군이 포함된 경우, 대조군 동물의 볼 주머니와 비교한다.

각각의 관찰결과에 대한 등급 (표 B.2)을 합산하고, 총합을 관찰 횟수로 나누어 각 동물의 평균 등급을 계산한다.

주) 이들 관찰결과는 조직 평가에 도움이 되기도 한다.

주) 시험원자재를 적용하기 이전의 최초 관찰결과는 등급 평균에 포함하지 않는다.

B.3.8.2 조직 평가

구강 조직에 대한 자극 영향은 병리학자가 미시적으로 평가해야 한다. 병리학자는 표 B.3에 제시되어 있는 체계에 따라 각 조직의 등급을 매길 수 있다.

시험군 안에 있는 동물들의 현미경 평가 등급을 모두 합산하고, 총합을 관찰 횟수로 나누어 시험군 평균을 구한다. 대조군의 경우에도 이를 반복한다. 최대 점수는 16점이다.

대조 볼 주머니에 대한 현미경 평가 총점이 9보다 높은 경우에는 잠재적 병소가 있는 것을 의미하기도 하고, 대조동물의 경우에는 투여 시에 외상이 있었음을 나타내는 것일 수도 있다. 다른 시험동물이나 대조동물이 동일하게 높은 점수를 나타내는 경우에는 재시험을 시행하여야 한다.

자극 지수 (표 B.4 참조)를 얻기 위하여 시험군 평균에서 대조군 평균을 뺀다.

반복 노출 시험의 경우에는 만성적인 자극과 관련이 있는 조직 반응을 추가로 포함시키기 위하여 표 B.3를 수정해야할 수도 있다.

B.3.9 시험보고서

시험보고서에는 다음과 같은 내용들이 포함되어야 한다.

1) 시험검체에 대한 설명

2) 시험검체의 사용목적/적용

3) 시험검체를 준비하는데 사용된 방법에 대한 세부적인 설명

4) 시험동물에 대한 설명

5) 적용방법

6) 해석방법

7) 관찰결과의 기록

8) 조직 평가

9) 결과의 평가

표 B.3 구강, 음경, 직장, 질의 조직 반응에 대한 현미경 검사 등급 체계

반응	등급 수치
1. 상피 정상, 손상되지 않은 세포의 변성 또는 세포의 비활성화 변질(Metaplasia) 국소적 진무름 전신적 진무름 2. 백혈구 침투 (per high power field) 없음 최소 (25이하) 가벼운 (26에서 50) 중간 정도 (51에서 100) 눈에 띄는 (100이상) 3. 혈관 울혈 없음 최소 가벼운 중간 정도 눈에 띄는, 혈관 파열을 수반한 4. 부종 없음 최소 가벼운 중간 정도의 눈에 띄는	0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

표 B.4 자극 지수

자극 지수
평균 등급	반응 해석
0 1-4 5-8 9-11 12-16	없음 최소 가벼운 중간 정도의 심한
기타 조직의 부작용을 기록하고, 반응 평가에 포함하여야 한다. 표 B.3에 제시된 현미경 검사 등급 체계를 목록에 있는 모든 시험에 적용한다. ‘자극 지수’는 질 자극성 모델에 사용하기 위하여 개발되었으나, 다른 시험에도 이용할 수 있다.

B.4 음경 자극성 시험

B.4.1 개요

음경 자극성 시험은 음경 조직에 접촉을 하게 될 원자재에 대해 시험하고자 하는 경우, 그리고 다른 방법으로 안전성 자료를 얻을 수 없을 경우에만 고려하여야 한다.

B.4.2 원리

음경 조직에 자극을 일으킬 수 있는 시험에 대한 원자재의 음경 조직 자극 유발 가능성을 평가한다.

B.4.3 시험에서 제외하는 경우

피부 자극이나 눈 자극을 일으키거나 pH ≤ 2 또는 ≥ 11.5 인 원자재는 시험하지 않으며, 음경 자극성을 일으킬 가능성이 있는 것으로 간주한다.

B.4.4 시험검체

시험검체가 고체이거나 액체인 경우에는 부록 A에 설명된 바에 따라 준비하여야 한다.

B.4.5 동물과 관리

수컷 알비노 토끼와 기니피그를 이용하여야 한다. 토끼의 경우에는 무게가 2kg이상이어야 하고, 기니피그의 경우에는 300g～500g인 건강하고 어린 성체여야 한다.

제2장(ISO 10993-2)에 명시되어 있는 바에 따라 동물들을 환경에 순응시키고, 관리해야 한다.

노출될 수 있는 음경의 길이는 1cm 이상이어야 한다.

동물마다 다양하게 착색되기 때문에 첫 번째 시험에 사용하기 이전에 홍반을 관찰하고 등급을 매겨야 한다. 표 B.2에 제시된 체계는 어떠한 홍반에도 적용할 수 있다. 홍반 등급이 2이거나 혹은 그 이상인 동물 또는 심한 변색을 나타내는 동물은 사용하지 않는다.

처음에는 최소 3마리의 시험동물과 3마리의 대조동물로 시험원자재를 평가한다.

만일 최초의 시험에서 반응이 불분명하거나 명확하지 않다면, 추가 시험을 고려해야 한다.

B.4.6 시험방법

반듯이 누운 상태에서 보조 장치를 이용해 동물의 사지를 안전하게 고정 시킨다.

집게손가락과 중지를 이용해 생식기 부근을 가볍게 누르고 음경을 돌출 시킨다.

음경이 돌출되면, 시험검체가 음경에 완전히 묻도록 충분히 (약 0.2ml) 발라준다.

덮개 안으로 음경을 완전히 집어넣는다. 동물이 시험부위를 핥지 못하게 하며, 부수적인 요소들이 1차 자극을 혼란시키지 않도록 조치를 취한다. (예를 들어, 엘리자베스 칼라, Elizabethan collar)

마지막 적용을 마치고 나면 적절하게 설계된 억제물로 (1 ± 0.1)시간 동안 동물을 안전하게 고정 시킨다.

급성 노출의 경우에는 4시간 동안 매 시간(±0.1)마다 앞의 과정을 반복한다.

지속 반복 노출 시험의 경우에는 임상적 상태에서의 노출 시간 간격과 기간, 적용 횟수를 근거로 한다.

B.4.7 동물의 관찰

급성 노출의 경우에는 최초의 적용 (예를 들어, 다음 적용에 앞서 즉각적으로)과 그 다음의 처리가 끝난 후 1시간이 지나면 음경의 모습을 기록한다. 마지막 적용이 끝나고 (1 ± 0.1)시간, (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간 후의 음경의 모습을 관찰하고 기록한다.

지속 반복 노출 시험의 경우에는 최초의 적용이 끝나고 (1 ± 0.1) 시간 후와 다음 적용에 직전에 음경의 모습을 기록한다.

표 B.2에 제시된 체계에 따라 매 시간 간격마다 시험동물의 피부 표면에 나타난 홍반에 반응 등급을 매기고, 시험보고서를 위해 결과를 기록한다.

최초의 시험 적용에 앞서 어떤 동물에게서 발적이 나타난다면, 시험검체에 의해 생긴 홍반 등급을 결정하기 위하여 정해진 시간에(at the timed observations) 관찰한 홍반등급에서 시험검체를 최초로 적용하기 직전의 등급을 뺀다.

B.4.8 결과의 평가

B.4.8.1 육안 평가

처리하지 않은 음경과 덮개를 대조군과 비교한다.

각각의 관찰결과에 대한 등급(표 B.2)을 합산하고, 총합을 관찰 횟수로 나누어 각 동물의 평균 등급을 계산한다.

주) 이들 관찰결과는 조직 평가에 도움이 되기도 한다.

주) 시험원자재를 적용하기 이전에 최초로 관찰된 결과는 등급 평균에 포함하지 않는다.

48시간 관찰을 한 후에 즉각적으로 동물을 안락사 시킨다. 음경 말단과 덮개를 완전히 해부하고, 조직 검사를 위한 처리를 하기에 앞서 적절한 고정액에 넣어둔다.

B.4.8.2 조직 평가

음경 피부에 대한 자극 영향은 병리학자가 평가해야 한다. 병리학자는 표 B.3에 제시되어 있는 체계에 따라 각 조직의 등급을 매길 수 있다.

시험군 안에 있는 동물들의 현미경 평가 등급을 모두 합산하고, 총합을 관찰 횟수로 나누어 시험군 평균을 구한다. 최대 점수는 16점이다.

대조군의 경우에도 위의 과정을 반복한다.

대조동물에 대한 현미경 평가 총점이 9보다 높은 경우에는 투여 시에 외상이 있었음을 나타내는 것일 수도 있다. 다른 시험동물이나 대조동물들도 동일하게 높은 점수를 나타내는 경우에는 재시험을 할 필요가 있다.

자극 지수(표 B.4 참조)를 얻기 위하여 시험군 평균에서 대조군 평균을 뺀다.

지속 반복 노출 시험의 경우에는 만성적인 자극과 관련이 있는 조직 반응을 추가로 포함시키기 위하여 표 B.3을 수정해야할 수도 있다.

B.4.9 시험보고서

시험보고서에는 다음과 같은 내용들이 포함되어야 한다.

1) 시험검체에 대한 설명

2) 시험검체의 사용목적/적용

3) 시험검체를 준비하는데 사용된 방법에 대한 세부적인 설명

4) 시험동물에 대한 설명

5) 적용방법

6) 해석방법

7) 관찰결과의 기록

8) 조직 평가

9) 결과의 평가

B.5 직장 자극성 시험

B.5.1 개요

직장 자극성 시험은 직장 조직에 접촉을 하게 될 원자재에 대해 시험하고자 하는 경우, 그리고 다른 방법으로 안전성 자료를 구할 수 없을 경우에만 고려하여야 한다.

B.5.2 원리

직장 조직에 자극을 일으키는 시험에 대한 원자재의 직장 조직 자극 유발 가능성을 평가한다.

B.5.3 시험에서 제외하는 경우

피부 자극이나 눈 자극을 일으키거나 pH ≤ 2 또는 ≥ 11.5 인 원자재는 시험하지 않으며, 직장 자극성을 일으킬 가능성이 있는 것으로 간주한다.

B.5.4 시험검체

시험검체가 고체이거나 액체인 경우에는 부록 A에 설명된 바에 따라 준비하여야 한다.

B.5.5 동물과 관리

동일한 혈통으로 암, 수 구별 없이 무게 2kg 이상의 건강하고 어린 알비노 토끼 성체를 이용해야 한다. 다른 종을 사용하는 경우에는 종 선정에 대한 타당성을 입증해야 한다.

제2장(ISO 10993-2)에 명시되어 있는 바에 따라 동물들을 환경에 순응시키고, 관리해야 한다.

처음에는 최소 3마리의 동물로 시험원자재를 평가하며, 3마리의 동물을 대조군으로 이용한다.

만일 최초의 시험에서 반응이 불분명하거나 명확하지 않다면, 추가 시험을 고려해야 한다.

각각의 처리 이전에 직장 고름, 부종 및/또는 기타 내장 말단 감염의 증거, 자극 및/또는 상처가 있는 지 동물을 검사한다.

B.5.6 시험방법

1ml 이상을 전달할 수 있는 용량의 주사기에 짧고 (6cm) 유연한 카테터 또는 굵은 바늘이 달린 캐뉼러를 붙이고 투여될 검체를 1ml씩 카테터와 주사기에 채운다. 카테터가 부착된 주사기를 동물마다 별도로 준비한다.

회음부에 접근할 수 있도록 하는 감금 장치에 동물을 집어넣어 고정시키거나, 조심스럽게 동물을 고정시키고 뒷다리를 묶어서 회음부를 노출시킨다.

삽입에 앞서 적합한 윤활제나 대조검체를 이용해 카테터를 촉촉하게 적신다.

동물의 꼬리를 잡고 올려서 회음부를 노출 시킨다. 젖은 카테터를 직장 안으로 깊이 부드럽게 삽입하고, 주사기에 있는 1ml를 모두 집어넣는다. 카테터를 빼내고, 이를 적절한 방법으로 폐기한다.

동물마다 직장의 수용력이 다르기 때문에 시험검체를 집어넣은 후에 즉각적으로 또는 시험검체를 집어넣는 동안 시험검체의 일부가 흘러내리기도 한다. 새어나온 물질을 부드러운 휴지로 천천히 닦아 낸다.

5일 동안 연속해서 매일 (24 ± 2)시간 간격으로 위의 과정을 반복한다.

지속 반복 노출 시험의 경우에는 임상적 상태에서의 노출 시간 간격과 기간, 적용 횟수를 근거로 한다.

B.5.7 동물의 관찰

최초 적용 후 (24 ± 2)시간 후와 다음 처리 직전에 회음부에 고름, 홍반, 자극성의 징후가 있는 지 관찰하고, 기록한다.

동물이 심한 고름, 부종을 나타내거나, 투여하기 곤란한 경우 동물은 안락사 시키고, 조직을 검사해야 한다(B.5.8.1 과 B.5.8.2 참조).

B.5.8 결과의 평가

B.5.8.1 육안 평가

마지막 투여를 하고 (24 ± 2)시간이 지난 후에 동물을 안락사 시킨다. 아래 내장(lower bowel)을 완전히 해부하고, 길이 방향으로 열어 조직의 상피층 손상과 괴사 그리고 자극의 징후가 있는 지를 검사한다.

조직 검사를 위한 처리를 하기에 앞서 적절한 고정액에 직장과 대장 말단의 일부를 넣어둔다.

시험군 토끼의 직장 조직을 대조군 토끼의 직장 조직과 비교한다.

시험부위와 대조 부위 사이의 차이에 주목하면서 육안으로 관찰한 각 동물의 직장 조직의 모습을 묘사하고 기록한다.

주) 이들 관찰결과는 조직 평가에 도움이 될 수 있다.

B.5.8.2 조직 평가

직장 조직에 대한 자극 영향은 병리학자가 평가해야 한다. 병리학자는 표 B.3에 제시되어 있는 체계에 따라 각 조직의 등급을 매길 수 있다.

시험군 동물의 현미경 평가 등급을 모두 합산하고, 총합을 관찰 횟수로 나누어 시험군 평균을 구한다. 최대 점수는 16점이다.

대조군의 경우에도 위의 과정을 반복한다.

대조동물에 대한 현미경 평가 총점이 9보다 높은 경우에는 투여 시에 외상이 있었음을 나타내는 것일 수도 있다. 다른 시험동물이나 대조동물들도 동일하게 높은 점수를 나타내는 경우에는 재시험을 할 필요가 있다.

자극 지수(표 B.4 참조)를 얻기 위하여 시험군 평균에서 대조군 평균을 뺀다.

지속 반복 노출 시험의 경우에는 만성적인 자극과 관련이 있는 조직 반응을 추가로 포함시키기 위하여 표 B.3를 수정해야할 수도 있다.

B.5.9 시험보고서

시험보고서에는 다음과 같은 내용들이 포함되어야 한다.

1) 시험검체에 대한 설명

2) 시험검체의 사용목적/적용

3) 시험검체를 준비하는데 사용된 방법에 대한 세부적인 설명

4) 시험동물에 대한 설명

5) 적용방법

6) 해석방법

7) 관찰결과의 기록

8) 조직 평가

9) 결과의 평가

B.6 질 자극성 시험

B.6.1 개요

질 자극성 시험은 질 조직에 접촉을 하게 될 원자재에 대해 시험하고자 하는 경우, 그리고 다른 방법으로 안전성 자료를 얻을 수 없을 경우에만 고려하여야 한다.

B.6.2 원리

질 조직에 자극을 일으키는 시험에 대한 원자재의 질 조직 자극 유발 가능성을 평가한다.

B.6.3 시험에서 배제

피부 자극이나 눈 자극을 일으키거나 pH ≤ 2 또는 ≥ 11.5 인 원자재는 시험하지 않으며, 질 자극성의 가능성이 있는 것으로 간주한다.

B.6.4 시험검체

시험검체이 고체이거나 액체인 경우에는 부록 A에 설명된 바에 따라 준비하여야 한다.

B.6.5 동물과 관리

동일한 혈통으로 암, 수 구별 없이 무게 2kg 이상의 건강하고 어린 알비노 토끼 성체를 이용해야 한다. 다른 종을 사용하는 경우에는 선정에 대한 타당성을 입증해야 한다.

제2장(ISO 10993-2)에 명시되어 있는 바에 따라 동물들을 환경에 순응시키고, 관리해야 한다.

처음에는 최소 3마리의 동물로 시험원자재를 평가하며, 3마리의 동물을 대조군으로 이용한다.

만일 최초의 시험에서 반응이 불분명하거나 명확하지 않다면, 추가 시험을 고려해야 한다.

각각의 처리 이전에 질에 고름, 부종 및/또는 질 감염의 기타 증거, 자극 및/또는 상처가 있는 지 동물을 검사한다. 가양성 반응이 질의 생리학적 변화에 기인한 것이 아님을 확인하기 위해 발정기의 단계에서도 검사를 해야 한다.

B.6.6 시험방법

1ml 이상을 전달할 수 있는 용량의 주사기에 짧고 (6cm) 유연한 카테터 또는 굵은 바늘이 달린 캐뉼러를 붙이고 투여될 검체를 1ml씩 카테터와 주사기에 채운다. 카테터가 부착된 주사기를 동물마다 별도로 준비한다.

질에 접근할 수 있도록 동물을 감금 장치에 집어넣어 고정시키거나, 조심스럽게 동물을 고정시키고 뒷다리를 묶어서 질을 노출시킨다.

삽입에 앞서 적합한 윤활제나 대조물질을 이용해 카테터를 촉촉하게 적신다.

동물의 꼬리를 잡고 올려서 질을 노출 시킨다. 젖은 카테터를 질 안으로 깊이 부드럽게 삽입하고, 주사기에 있는 1ml를 모두 집어넣는다. 카테터를 빼내고, 이를 적절한 방법으로 폐기한다.

동물마다 질의 수용력이 다르기 때문에 시험검체를 집어넣은 후에 즉각적으로 또는 시험검체를 집어넣는 동안 시험검체의 일부가 흘러내리기도 한다. 새어나온 물질을 부드러운 휴지로 천천히 닦아 낸다.

5일 동안 연속해서 매일 (24 ± 2)시간 간격으로 위의 과정을 반복한다.

지속 반복 노출 시험의 경우에는 임상적 상태에서의 노출 시간 간격과 기간, 적용 횟수를 근거로 한다.

B.6.7 동물의 관찰

최초 적용 후 (24 ± 2)시간 후와 다음 처리 직전에 질구와 회음부에 고름, 홍반, 자극성의 징후가 있는 지 관찰하고, 기록한다.

동물이 심한 고름, 부종을 나타내거나 투여가 곤란한 경우 동물은 안락사 시키고, 조직을 검사해야 한다(B.6.8.1 과 B.6.8.2 참조).

B.6.8 결과의 평가

B.6.8.1 육안 평가

마지막 투여를 하고 (24 ± 2)시간이 지난 후에 동물을 안락사 시킨다. 질 전체를 완전히 해부하고, 길이 방향으로 열어 조직의 상피층 손상과 괴사 그리고 자극의 징후가 있는 지를 검사한다.

조직 검사를 위한 처리를 하기에 앞서 적절한 고정액에 질을 넣어둔다. 각 질의 경부, 중간부분, 끝부분을 포함하도록 하기 위해 3개의 절편을 취한다.

시험군 토끼의 질 조직을 대조군 토끼의 질 조직과 비교한다.

시험군과 대조군 사이의 차이에 주목하면서 육안으로 관찰한 각 동물의 질 조직의 모습을 묘사하고 기록한다.

주) 이들 관찰결과는 조직 평가에 도움이 될 수 있다.

B.6.8.2 조직 평가

질 조직에 대한 자극 영향은 병리학자가 평가해야 한다. 병리학자는 표 B.3에 제시되어 있는 체계에 따라 각 조직의 등급을 매길 수 있다.

시험군 동물의 현미경 평가 등급을 모두 합산하고, 총합을 관찰 횟수로 나누어 시험군 평균을 구한다. 최대 점수는 16점이다.

대조군의 경우에도 위의 과정을 반복한다.

대조동물에 대한 현미경 평가 총점이 9보다 높은 경우에는 투여 시에 외상이 있었음을 나타내는 것일 수도 있다. 다른 시험동물이나 대조동물들도 동일하게 높은 점수를 나타내는 경우에는 재시험을 할 필요가 있다.

자극 지수(표 B.4 참조)를 얻기 위하여 시험군 평균에서 대조군 평균을 뺀다.

지속 반복 노출 시험의 경우에는 만성적인 자극과 관련이 있는 조직 반응을 추가로 포함시키기 위하여 표 B.3를 수정해야할 수도 있다.

B.6.9 시험보고서

시험보고서에는 다음과 같은 내용들이 포함되어야 한다.

1) 시험검체에 대한 설명

2) 시험검체의 사용목적/적용

3) 시험검체를 준비하는데 사용된 방법에 대한 세부적인 설명

4) 시험동물에 대한 설명

5) 적용방법

6) 해석방법

7) 관찰결과의 기록

8) 조직 평가

9) 결과의 평가

부록 C

사람 피부 자극성 시험

C.1 일반사항

다음 기준은 의료기기 임상시험 관리기준인 ISO 14155-1과 ISO 14155-2 외에 보다 구체적인 범위까지 적용된다.

C.2 원리

시험하려는 시험물질의 1회 투여는 지원자의 피부를 폐쇄한 상태에서 시행되어야 한다. 시험물질을 단기간 동안 적용하여 자극을 최소한으로 유지한다. 특정 환경 하에서는 장기적 노출이 적절할 수도 있다.

평가의 주요 수단은 동시에 측정한 양성 대조군에 대한 반응과 관련하여 피부 자극을 일으키는 지원자의 비율을 측정하는 것이다.

C.3 시험방법

C.3.1 지원자의 선정

이 규격은 건강한 지원자를 대상으로 시험하기 위하여 설계되었다. 지원자는 임신과 수유를 하지 않는 18세 이상의 사람으로 선정하여야 한다. 또한 피부염의 징후가 보이거나 시험물질에 대해 민감한 지원자는 시험에서 제외시켜야 한다. 자격을 갖춘 사람이나 피부과 전문의가 지원자의 선정을 관리하고 감독하여야 한다.

C.3.2 투여 준비

일반적으로 액상 시험물질은 희석하지 않고 사용한다. 고형 시험물질로 시험을 하는 경우에는 피부와 충분히 접촉하도록 하기 위하여 적은 양의 물 (대체로 0.2ml)이나 다른 적당한 용매를 이용하여 시험물질을 적신다. 고형 시험물질의 구조를 고려해야하며, 시험물질 준비방법의 선정에는 충분한 근거가 있어야 한다. 젖은 검체를 이용하는 경우, 각각의 시험대상에 동일한 양의 시험물질이 적용되도록 주의한다. 시험검체를 적시기 위한 물의 양은 각각의 시험대상에 대해 동일하게 하고, 그 양을 기록한다.

용매를 사용하는 경우에 시험물질로 인한 피부자극에 용매가 미치는 영향을 고려해야 한다. 고체 화합물에 대한 습윤제로 물 이외의 용매를 사용하는 경우에는 각각의 대상에 공시험액 (용매 대조군)첩포(patch)를 붙일 것을 고려한다.

C.3.3 과정

C.3.3.1 지원자의 수

최소한 30명의 지원자들 (남성과 여성의 비율이 각각 3분의 1 이상)이 시험을 완수해야 한다.

C.3.3.2 시험물질의 적용

적합한 부위, 예를 들어 상완 바깥쪽에 있는 건강한 피부에 거즈 패드가 들어있는 폐쇄 챔버를 이용해 시험검체를 적용한다. 적용부위는 모든 지원자에게 동일해야 하고, 기록되어야 한다. 일반적으로 첩포(patch)의 크기는 1.8cm이상이 되어야 하며, 지름은 가급적으로 2.5cm가 되어야 한다. 노출 기간이 지속되는 동안 비자극성 테이프를 포함해 자극성이 없는 드레싱으로 첩포(patch)를 피부에 접촉시켜야 한다.

첩포(patch)는 단위 면적당 적당한 투여량을 전달해 주어야 한다. 시험검체의 양은 1 cm2 당 약 50mg～100mg이 가장 적당한 것으로 간주된다. 액상 시험물질을 사용하는 경우에는 일반적으로 0.2ml～0.4ml를 거즈 패드에 첨가하여 적신다. 고형 시험물질을 사용하는 경우, 일반적으로 0.2g의 시험물질을 촉촉하게 적셔 거즈패드에 적용한다. 고형 시험검체를 대신해서 적용하는 방법으로써, 거즈패드는 촉촉하게 적시고, 시험물질은 전체 시험부위를 덮는다.

C.3.3.3 노출 기간

불필요한 강력한 반응이 발생하지 않도록 신중한 시험 접근법을 채택하여야 한다. 순차적 첩포(patch) 검사에서는 심각하지 않은 양성 자극 반응이 나타날 수 있다. 첩포(patch)는 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간으로 단계적으로 적용한다. 1시간 노출 후 과도한 반응이 나타날 것 같은 충분한 징후가 없는 경우, 15분 및/또는 30분의 노출 기간은 생략할 수 있다. 피부 감작성을 적절하게 평가하기 위하여 피부의 다른 부위에 24시간동안 폐쇄 첩포(patch)를 적용한다. 이와 같이 노출시간을 연장하는 것은 단기간의 노출에서 피부 자극의 발생이 없는 경우(최소한 48시간까지 평가한다)에 한한다.

장기간 노출을 위해 시험검체를 적용할 때에는 항상 이전에 처리하지 않은 부위를 사용하여야 한다.

노출 기간이 끝나면, 사용해도 되는 적절한 용매나 물을 이용하여 표피를 손상시키지 않고 기존의 반응이 변형되지 않도록 남아있는 시험검체를 제거해야 한다.

C.3.3.4 제한적 노출

시험검체가 심한 자극성을 나타낼 가능성이 있는 경우, C.3.3.3에 기술되어 있는 것처럼 적용 기간을 단계적으로 증가시키는 것 이외에 노출 시간을 감소시켜 그 시험결과로부터 시험의 진행을 결정할 수 있다. (48 ± 2)시간/(72 ± 2)시간의 결과를 보고 난 다음 첩포(patch)를 붙여야 한다.

C.3.3.5 피부 반응 등급과 임상적 관찰

처리부위에서 자극성 징후를 검사하고 첩포(patch) 제거 직후, 제거 후 (1 ± 0.1)시간, (2 ± 1)시간, (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간, (72 ± 2)시간 마다 반응의 등급을 매긴다. 만약 반응의 가역성을 측정할 필요가 있는 경우, 관찰기간은 72시간 이상으로 늘릴 수 있다. 이 외에도 시험 전, 후의 피부 상태를 자세히 묘사해야 한다.(예를 들어, 착색과 수화정도) 표 C.1의 등급에 따라 피부 자극 등급을 매기고 기록한다.

비침습적 생물공학 방법이 이용되기도 한다. (부록 E 참조)

반응의 특징	등급
반응 없음	0
아주 약간의 양성 반응 (일반적으로 처리부위 대부분에서 나타나는 건조 및/또는 연한 홍반이 특징)	1
중간 정도의 양성 반응 (일반적으로 처리부위를 넘어서 확산된 뚜렷한 건조 또는 홍반이 특징)	2
강력한 양성 반응 (종종 가피의 형성 및/또는 부종을 수반하는 강력한 홍반과 그러한 홍반의 확산)	3

표 C.1 사람의 피부 자극성 시험, 등급표

4시간 미만의 노출 결과가 1등급 이상의 반응을 나타낸 지원자에 대해, 4시간 동안 시험검체에 노출시킨다면 더 강한 반응이 나타날 것으로 가정한다. 1등급 이상의 반응을 나타낸 지원자의 경우, 그 지원자를 대상으로 시험검체를 추가적으로 적용할 필요가 없다. 지원자를 적절하게 보호하기 위한 추가적인 관찰이 필요하다. 자극성에 대한 관찰 이외에도 기타 영향들을 자세히 묘사하고, 기록한다. 예를 들어, 지원자는 첩포(patch) 적용과 관련된 증상을 설명하는 훈련을 받아야 하며, 평가자는 첩포(patch)를 제거하자마자 반응(예를 들어 두드러기)을 즉각적으로 기록하는 훈련을 받아야 한다. 그러한 관찰을 통해, 자극 효과는 나타나지 않았으나 인지되었다면 시험보고서에 이를 포함시켜야 한다. 만일 그것이 중요한 것이라면, 지원자를 적절하게 보호하기 위하여 시험 관리차원에서 관찰내용을 고려해야 한다.

중요한 자료는 4시간까지 노출된 후에 피부 자극성을 나타내거나 피부 자극성이 나타날 것으로 예상되는 지원자의 숫자이다. 개체별로 반응을 일으키는 데 필요한 시간은(반응이 있더라도), 평가해야 하는 결과가 아니다; 이는 지원자를 적절하게 보호하기 위한 것일 뿐이다.

C.3.3.6  동시 양성 대조군 물질의 선별과 이론적 근거

사람의 자극성 반응은 다양하기 때문에 양성 대조군을 포함시켜 시험 패널이 시험 화합물의 자극 영향을 측정하기에 적합한지 결정한다. 가급적 자극 영향 특징을 가장 잘 나타내주는 20%의 황산 도데실 나트륨 (sodium dodecyl sulfate, SDS)을 양성대조군으로 사용한다.(부록 F.1 참조) 검증된 기타 대조군을 이용할 수도 있다.

통상적인 양성 대조군은 기준점(benchmark)으로써 시험에 포함될 수 있다. 피부 자극성은 절대적인 현상이 아니다. 모든 시험물질이 피부 자극을 일으킬 수 있다. 이는 단순히 노출의 정도와 특성 그리고 투여량의 문제이다. 따라서 사람의 피부 자극성 시험은 거의 항상 상대적이고, 알려진 화학적 자극과 관련이 있어야 한다.

C.4 시험자료와 보고서

C.4.1 시험자료

시험자료는, 양성 대조군과 음성 대조군의 결과를 포함하여, 첩포(patch)를 제거한 후 (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간, (72 ± 2)시간에서의 각각 대상에 대한 자극성 등급과 기타 관찰된 영향을 표의 형식으로 요약하여 나타내도록 한다.

C.4.2 자료 평가 및 해석

본 시험의 목적은 급성 노출에 의해 시험물질이 중대한 피부 자극의 잠재적 위험성을 나타내는지를 측정하기 위한 것이다. 따라서 시험물질이 빈번한 피부자극을 일으키고 그 자극이 양성 대조군과 유사하거나 또는 그보다 큰 경우, 이는 중대한 피부 자극으로 간주되어야 한다. 한편, 시험물질이 빈번한 피부자극을 일으키지만 그 자극이 양성 대조군보다 충분히 작다면, 중대한 피부 자극으로 간주하지 않을 수 있다. 중요한 것은 지원자 보호 측면에서 만들어진 중간결과자료를 종점(endpoint)자료(자극 반응을 보이는 대상의 비율)와 혼동해서는 안 된다는 것이다. 또한 대상간의 피부자극에 대한 감수성 차이를 시험물질의 일반적인 피부자극 잠재성의 문제와 혼동해서는 안 된다.

C.4.3 시험보고서

시험 보고서를 위해서는 ISO 14155-1과 ISO 14155-2의 기준을 따라야 한다. 사람 피부 자극성 시험에 대한 구체적인 보고를 위해서는 다음과 같은 정보들이 수록되어야 한다.

1) 지원자로부터 동의 확인과 윤리적 고려 사항

2) 시험검체

- 물리적 특성과, 해당되는 경우, 물리화학적 특성

- 동정(identification) 자료

3) 용매

- 고형 시험검체를 적시는 데 사용된 용매에 대한 규명과 해당 용매 선정의 타당성 입증

4) 지원자

- 시험검체를 적용할 지원자의 숫자

- 지원자의 연령/성별 분포

5) 결과

- 0시간, (1 ± 0.1)시간에서 (2 ± 0.2)시간, (24 ± 2)시간, (48 ± 2) 시간, (72 ± 2)시간, 기타 시간에서의 반응율

- 각각의 관찰 시간 동안 대상의 자극 반응 자료에 관한 표 (예를 들어, 첩포를 제거하고 난 후에 (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간, (72 ± 2)시간에서의 자극 반응율의 빈도수를 요약한 표)

- 관찰된 모든 자극 반응에 대한 설명

- 관찰된 자극성 이외에 기타 영향들에 대한 설명

- 결과의 통계적 처리 (양성 대조군과의 비교, 예를 들어, 피셔의 정확검증 방법[Fisher's exact test])

- 만약 체내․체외 동물 시험이 사람 지원자에게 시험하기 이전에 수행되었다면, 시험과정의 세부사항과 시험검체 및 참고물질을 통해 얻어진 결과를 포함하는 체내․체외 동물 시험의 설명 또는 참고사항.

6) 결과의 검토

부록 D

(참조)

피부 자극에 대한 체외시험(in vitro tests)

D.1 배경 정보

최근 토끼 피부 자극성 시험에 대한 대안으로 화학물질의 자극 활성(irritating activity)을 측정하는 체외 시험법에 대한 평가 및 검증에 관한 다양한 연구들이 발표되었다. (참고문헌 [101], [102], [103], [104] 참조) 2007년, ECVAM 과학자문위원회(ESAC)는 화학물질에 대한 피부자극(skin irritation)을 측정하기 위한 체외 인체유래 인공피부모델(in vitro human skin model)의 검증 과정을 평가하였다. (참고문헌 [101] 참조) 이러한 평가 후에 ESAC는 다음과 같이 지지하였다.

“충실한 밸리데이션 연구에 필수적인 과학적 보고서와 동료평가 문헌을 다음의 체외시험에 대해 검토한 후에

1. EpiDermTM (MTT 환원 및 IL-1α 유리)

2. EPISKINTM (MTT 환원 및 IL-1α 유리)

EPISKINTM 방법이 종말점(endpoint)을 MTT 환원(reduction)으로 평가할 때 토끼 피부 자극성을 예측하고, R38 피부 자극 시험물질과 비표지(피부 자극이 없는) 시험물질을 구별하기 위한 드레이즈 피부 자극성 시험(지침67/548/EEC의 부록 V의 OECD TG 404 및 시험법 B.4)에 대한 대체(replacement) 시험으로 사용하기 위한 신뢰할 만하고 타당한 독립 시험이라는 증거를 제시하였다. 현재, IL-1α 종말점은 그 특이도(specificity)를 줄이지 않고도 시험에 대한 민감도(sensitivity)를 증가시킬 가능성을 가지고 있기 때문에, MTT 시험에 대한 유용한 보조방법으로 간주해야 한다. 이 종점은 MTT 종말점을 통해 얻은 음성을 확인하는데 사용할 수 있다.

지금은 높은 특이도(high specificity) 때문에 EpiDermTM 모델에서는 피부자극제를 안정적으로 확인할 수 있지만 음성 결과는 추가 시험을 필요로 할 수 있다(예 ; 참고문헌 [7]에 설명된 배열 전략에 따라). 민감도(sensitivity)의 수준을 높이기 위해서는 EpiDermTM 시험계획에 대한 개선이 이루어져야 한다.“

EPISKINTM와 EpiDermTM 모델 모두에서 피부자극제들을 안정적으로 확인할 수 있지만, 오직 EPISKINTM 모델만 화학물질의 비자극(비표지) 특성을 입증하는데 사용될 수 있다.

EPISKINTM 모델의 경우에는 음성 반응에 대한 추가 확인을 위해 IL-1α 생성에 대한 측정이 이용될 수 있다. EpiDermTM 모델에서 음성 반응은 토끼 피부 자극 시험에서의 확인을 필요로 한다.

상업적으로 이용 가능한 피부 모델 외에(D.2.2 참조), “오픈소스(open source)” 모델도 이용할 수 있다. 이 모델들은 피부와 동등한 매트릭스에서 사람 세포를 이용하는 동일한 원리에 기초로 한다.(참고문헌 [109] 참조)

피부 자극성에 대한 체외 시험은 지금까지 단일 화합물질에 대해서만 검증되었고 의료기기 용출액에 대해서는 검증되지 않았다는 점에 유의해야 한다. 의료기기의 잠재적 자극성을 시험하는데 이러한 시험을 적용하기 위해서는 이러한 특정 부분에 대한 추가적 검증이 필수적이다. 이들 용출액에서 ‘화학물질의 가능 최저 농도’ 및 ‘용출기법’과 같은 의료기기 시험의 특정 측면들은 용출 기법이나 배양 시간을 변경하여 시험계획에 적응시킬 수 있다.

D.2 체외 피부 자극 시험의 원리

D.2.1 일반사항

체외 피부 모델 자극 시험의 원리는 자극 화학물질이 확산에 의해 각질층(stratum corneum)을 침투할 수 있고, 그 밑에 있는 층의 세포에 독성효과를 준다는 전제를 기초로 한다. 더 나아가 독성 효과가 없거나 약하면, 정량화 할 수 있는 염증 매개인자(inflammatory mediator)가 표피에 의해 유리되어 시험의 민감도(sensitivity)를 증가시키기 위한 단계별 접근법에서 사용할 수 있다.

시험물질은 3차원 인체 표피 모델에 국소적으로 적용되고, 최소한 몇몇 상피세포층의 재생 상피(reconstructed epidermis)와 기능적 각질층으로 구성된다.

자극 원자재는 정해진 역치 수준 밑으로 세포 생존능력을 감소시킬 수 있는 능력에 의해 확인된다(예를 들어, 50%). 피부 자극에 추가조치로 염증매개인자의 유리(예를 들어, Interleukin 1α)가 측정될 수 있다.

밸리데이션 시험에서는 피부자극에 대한 체외 인체유래 인공피부모델 시험계의 밸리데이션을 위하여 신중하게 선정된 화학물질이 이용되는데, 이 화학물질은 광범위한 화학물질을 대표한다. (참고문헌 [102], [103], [104] 참조) 기체나 에어로졸을 제외하고 이 방법은 일반적으로 화학물질 분류 전반에 걸쳐 적용될 것으로 예상된다.

D.2.2 일반 모델의 특성

인체유래 인공피부모델(Human skin models)은 상업적으로 얻거나(예를 들어, EpiDermTM, EPISKINTM, Vitrolife-Skin, TESTSKIN, Labcyte EPI-MODEL) 개발하거나 실험실에서 만들 수 있다. 모든 새로운 모델에 대해서는 검증이 이루어지고 기존모델들과 비교 분석이 되어야 한다. 인체 각질형성세포(Human keratinocyte)는 상피를 만드는데 사용해야 한다. 생존 상피세포의 여러 층(기저층, 각질층, 과립층)은 기능적인 각질층 밑에 존재해야 한다. 각질층은 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 또는 트리톤(Triton) X-100과 같은 세포독성 표지자 화학물질(cytotoxic marker chemical)의 신속한 침투에 저항하도록 기능장벽을 견고하게 만드는 필수 지질분획(lipid profile)을 포함하고, 여러 층으로 되어 있다. 이 특성은 정해진  세포독성 표지자 화학물질의 적용 후에  IC50 또는 ET50의 측정에 의해 추정될 수 있다. 모델의 억제 특성은 각질층 주변의 원자재가 피부생존 조직으로 이동하는 것을 막아, 피부 노출에 대한 빈약한 모델링을 이끌게 된다.

일반적으로 새로운 피부나 상피 모델의 특성분석을 위해서는 조직 평가(H&E 염색), 케라틴에 대한 식별(면역조직화학적 검색) 및 지질분획[고성능박충크로마토크래피(HPTLC)]이 수행되어야 한다. (참고문헌 [110] 참조)

피부 모델은 박테리아, 마이코플라즈마 또는 곰팡이에 의한 오염이 없어야 한다.

D.2.3 기능 모델 요구기준

D.2.3.1 일반사항

기능 모델 조건은 참고문헌 [105]에 설명되어 있다. 다음 기준들은 체외 피부 자극시험의 사용에 적용된다.

D.2.3.2 생존능력(Viability)

생존능력의 정도는 일반적으로 MTT나 기타 대사적으로 전환된 생체염료(vital dye)를 사용하여 정량화된다. 이런 경우에는 음성대조군 조직으로부터 용출된(가용성) 염료의 광도(OD)가 최소 용출 용매만의 광도보다 20배 이상이어야 한다. 음성대조군 조직의 광도(OD)는 가급적 0.8이상이어야 한다. 음성 대조군 조직이 시험 기간 동안 배양에서 안정적임을 문서화해야 한다. 이것은 시험 기간의 여러 시점에서 생존능력 시험을 수행하여 할 수 있다. 측정을 통해 각 시점에 대해 유사한 생존능력이 나타나야 한다.

D.2.3.3 장벽기능(Barrier function)

각질층(SC)과 그 지질 조성은 SDS 또는 Triton X-100같은 세포독성 표지자 화학물질(cytotoxic marker chemical)의 신속한 침투에 저항하기에 충분해야 한다. 이 특성은 표지자 화학물질이 고정 노출 시간 후에 50 %(IC50)에 의해 조직의 생존능력을 감소시키는 농도의 측정을 통해 또는 명시된 고정 농도에서 표지자 화학물질의 적용 시 50 %(ET50)에 의한 세포 생존능력을 감소시키는데 필요한 노출 시간의 측정을 통해 추정될 수 있다. 충분하게 기능적인 SC의 ET50은 2시간이상이어야 한다.

D.2.3.4 형태(Morphology)

사람 피부/상피 같은 구조(기능적 SC 포함)를 보이는 재생 피부/상피에 대한 지속적인 조직 검사를 수행해야 한다. 이 정보는 피부 구성체의 제조업체가 제공할 수 있다.

D.2.3.5 재현성(Reproducibility)

특정 모델을 사용한 방법의 결과는 시간이 흐르면서 재현성을 입증해야 한다. 이 모델은 연장된 시기 동안 기준 화학물질에 대한 정확한 예측을 입증할 수 있어야 한다(표 D.1 참조).

	하한허용기준	허용범위 평균	상한허용기준
EPISKINTM (18 h SLS)	IC50 = 1.0 mg/ml	IC50 = 2.32 mg/ml	IC50 = 3.0 mg/ml
EpiDermTM (1 % Triton X100)	ET50 = 4.8 시간	ET50 = 6.7 시간	ET50 = 8.7 시간

표 D.1 —품질관리 배치 출하 기준의 예

D.2.3.6 모델의 품질 관리(QC)

사용된 상피 모델의 각 배치는 정해진 생산 출하 기준을 충족해야 하는데, 그 중에서도 생존능력과 장벽기능에 대한 기준이 가장 관련이 있다.  IC50 또는 ET50에 대한 허용 범위(상한 및 하한)는 피부 모델 공급업체(또는 실험실내 모델을 사용할 경우에는 임상시험자)가 정해야 한다. 정량된 조직을 이용하여 생성된 결과만이 자극효과에 대해 신뢰할 수 있는 예측으로 허용될 수 있다.

한 예로, EPISKINTM 와 EpiDermTM의 허용 범위가 D.3에 제시되어 있다.

D.3 시험물질

시험물질은 고체, 액체, 반고체 및 왁스로 구성될 수 있다. 액체는 수성이거나 비수성일 수 있고, 고체는 수용성이거나 비수용성일 수 있다. 고체는 적용 전에 분말이 되도록 분쇄해야 한다. 검체의 다른 전처리는 필요하지 않다. 의료기기 또는 생체재료의 용출액의 경우에는 극성과 비극성 용매가 모두 사용될 수 있다.

음성 기준 대조군 및 양성 기준 대조군은 생존능력(음성 기준대조군), 장벽기능 및 조직들의 결과조직의 민감도(양성기준대조군)에 정해진 이력 허용 범위 내에 있다는 것을 입증하기 위해 시험물질과 동시에 처리해야 한다. 양성 대조물질의 목록의 경우 참고문헌 [105]를 참조한다.

비자극 음성 대조군(NC)(예를 들어, PBS, 물 또는 공시험액)은 시험물질과 동시에 처리해야 한다. 음성 대조 조직은 배양에서 안정적이어야 하고 시험화학물질 노출과 후배양 기간에 유사한 생존능력치(viability measurement)을 제공해야 한다. 최소 생존능력(예를 들어, 생체 염료의 절대 광도(OD)로 표시)은 시험 허용 기준으로 정해져야 한다. 일반적으로 그러한 음성 대조군은 OD가 0.8 이상이어야 한다.

모델의 완벽한 “녹아웃(knockout)”을 피하기 위해서는 시험에서 적합한 양성대조군(PC)을 사용해야 한다(예를 들어, 5 % SDS). 충분한 수의 독립 실험을 통해 얻은 데이터를 기초로 양성대조군에 대한 반응 범위가 파악되어야 한다. 각 시험에서 양성대조군은 정확하게 자극제로 분류되어야 하고 정해진 반응 범위 내에 포함되어야 한다. 그리고 세 개의 조직 배양 용기의 표준편차는 정해진 최대치 이하이어야 한다. 이러한 기준이 충족되지 못하면 시험은 무효한 것이 되어 반복 실시해야 한다. ECVAM 피부 자극 밸리데이션 시험에 사용된 두 가지 피부 모델(EPISKINTM 및 EpiDermTM)에 대한 일반적인 범위는 표 D.2에 제시되어 있다.

표 D.2 —양성대조군에 대한 모델 반응의 범위의 예(5 % SDS)

피부모델	생존능력	범위	SD
EPISKINTM	< 40%	1.5∼32.2 (1.3∼41.6)a	≤ 18%
EpiDermTM	< 20%	3.7∼3.8 (4.7∼13.6)a	≤ 18%
a 95% 신뢰구간

D.4 시험과정

조직 구성체(tissue construct)는 제조업체가 제공한 시험계획에 따라 조직 배양배지에서 배양한다. 조직이 운송되었으면 실험실에서 조직을 사용하기 전에 조직의 조절을 위해 주의하여 권장된 과정을 적용해야 한다.

최소한 3개의 충분한 크기의 동일한 조직(replicate) (최소 10mm 지름, 0.63㎠)을 시험검체와 대조군을 이용하여 배양해야 한다. 시험 검체와 대조군은 최소한 (15 ± 5)분간 피부 구성체와 함께 배양해야 한다.

충분한 양의 시험물질을 피부 표면에 균일하게 적용해야 한다. 최소 25 μl/cm2 또는 25mg/cm2를 사용해야 한다. 고형물질은 피부에 잘 접촉하도록 이온을 제거하거나 증류수로 적셔야 한다. 적합한 경우에는 고체는 적용하기 전에 분말로 분쇄해야 한다.

배양 후 (15 ± 5) 분이 지나면, 적절한 완충제나 0.9 % NaCl를 사용하여 철저하게 세척하고 헹굼으로 시험 검체를 제거한다. 세척과 헹굼 과정은 모든 시험물질을 제거하기에 적절해야 한다.

조직은 약한 자극 효과로부터 회복을 위해 허용되는 노출 후 회복기간처럼 신선한 배지에서 (42 ± 2)시간 동안 추가 배양한다. (42 ± 2) 시간 후에, 세포 생존을 확인한다.

주) 의료기기의 용출액이 저농도의 자극성 화학물질을 포함할 수 있음을 인지하는 것이 중요하다. 따라서 노출기간을 조정할 필요가 있을 수 있다.

세포 생존능력을 측정하기 위해서는 정량법만이 사용될 수 있다. 그 외에, 생존능력의 측정은 3차원 조직 구성체에서의 사용과 맞아야 한다. 비특이적 염료 결합(Non-specific dye binding)이 생존능력 측정을 방해해서는 안 된다. 따라서 단백질 결합 염료와  대사물로 전환되지 않는 염료들(예; neutral red) 은 적합하지 않다.

가장 자주 사용되는 시험은 정확하고 재현 가능한 결과를 나타내는 것으로 알려진 MTT 환원[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Thiazolyl blue; CAS number 298-93-1)]이다. 피부 검체를 적합한 농도의 MTT 용액(예를 들어, 0.3 mg/ml~1 mg/ml)에 3시간 동안 둔다. 그런 다음 용매(isopropanol)를 사용하여 침전물 청색 포르마잔(formazan) 제품을 추출하고, 포르마잔의 농도를 540nm과 595nm 사이의 파장에서 광도(OD)를 측정한다.

주 1) 생체염료와 시험물질과의 화학 상호반응이 세포 대사의 상호반응처럼 보여 생존능력에 잘못된 추정을 하게 할 수 있다. 이것은 헹굼 시 피부에서 시험물질을 완전히 제거하지 않을 때 발생할 수 있다. 시험물질이 직접 생체 염료에서 작용하면, 생존능력 측정에 시험물질의 간섭을 검사하여 파악하기 위해 추가 대조군이 사용되어야 한다.

주 2) 세포 생존능력 측정처럼 세포 대사작용의 검출을 위해서는 MTS 및 WST-1. XTT, MTS 및 WST-1처럼 테트라졸륨염의 변종을 이용할 수 있다.

특히 EPISKINTM모델에서 피부 구성체에서 세포의 생존능력 외에, 보완 종점으로 인터류킨(Interleukin) 1α가 측정될 수 있다. 세포 생존능력이 50% 초과( >50 %)를 보이는 상피 세포의 경우에는 후 배양기간 [(42 ± 2)시간 후 배양]의 종료 시에 조직 배양배지에 유리된 IL-1α의 양은 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트를 사용하여 배지에서(즉시 또는 냉동으로) 측정된다. (참고문헌 [107] 참조)  IL-1α의 양은 국제단위로 표시해야 한다.

D.5 결과 및 해석

각 시험 검체를 통해 얻은 광도(OD)값은 100%로 설정된 음성대조군과 비교하여 생존능력의 비율을 계산하는데 사용할 수 있다. 자극성 원자재와 비자극성 원자재를 구별하는 세포생존율의 절사(cut-off) 값과 결과를 평가하고 자극 물질을 확인하는데 사용된 통계 절차를 명확하게 규정하고 문서화하여 적합한 것으로 증명해야 한다.

EPISKINTM 또는 EpiDermTM  모델에서 노출 후와 후 배양 후 조직 생존능력이 50% 이하(≤ 50 %)이면 시험 물질은 피부에 자극이 있는 것으로 간주해야 한다.

IL-1α이 화학물질의 잠재적 자극성에 대한 추가정보를 얻는데 유용할 수 있지만, 현재는 MTT 시험을 통해 얻은 결과만이 시험검체를 자극이 있는 것으로 간주하기 위해 사용된다. 자극에 대한 신뢰할 만한 예측을 위해, 두 종점의 결합을 허용하기 위한 IL-1α 시험의 재현성을 개선하려는 추가 연구가 진행되고 있다.

세포 생존능력이 50% 초과(>50 %)를 보이는 조직에 대한 EPISKINTM모델에서, 후 배양기간 [(42 ± 2)시간 후 배양]의 종료 시에 조직 배양배지에 유리된 IL-1α의 양은 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트를 사용하여 배지에서(즉시 또는 냉동으로) 측정된다.

노출 후 (15 ± 5)분이 지나고 후 배양의 (42 ± 2) 시간이 지난 후에 생존능력이 50 %를 초과하면, IL-1α 유리 양은 9 IU/ml 이상이면, 시험물질은 피부에 자극이 있는 것으로 간주된다.

노출 후 (15 ± 5)분이 지난 후에 그리고 후 배양 후 (42 ± 2)시간이 지나고 생존능력이 50% 이상이고 IL-1α 유리의 양이 9 IU/ml 이하면, 시험물질은 피부에 자극이 없는 것으로 간주되어야 한다.

EpiDermTM 모델에서 음성 반응은 토끼 피부 자극 시험으로서 확인을 필요로 한다.

D.6 시험 보고서

시험 보고서는 다음 정보를 포함해야 한다.

a) 사용된 피부 모델 및 시험계획에 대한 정당한 근거

b) 알려진 IUPAC 또는 CAS 명칭 및 CAS번호와 같은 화학명을 포함한 시험 검체 및 대조검체에 대한 설명

c) 물질의 순도 및 조성 또는 준비[질량백분율]

d) 시험수행과 관련된 물리적 상태, 휘발성, pH, 안정성, 수용성과 같은 물리화학적 특성

e) 해당되는 경우, 시험 전의 시험/대조 물질의 처리(예를 들어, 보온, 분쇄)

f) 알려진 경우, 안정성

g) 사용된 세포시스템

h) 세포 생존능력을 측정하기 위해 사용한 측정기기에 대해 사용된 기기의 조정 정보(예를 들어, 분광광도계)

i) 그 타당성을 포함하여 사용된 특정 피부 모델에 대한 완벽한 보충 정보

j) 사용된 시험 과정에 대한 자세한 설명,

k) 사용된 시험 용량

l) 시험과정의 변경에 대한 설명

m) 모델의 이력 데이터에 대한 참고사항

n) 사용된 평가 기준에 대한 설명

o) 개별 시험 검체로부터 얻은 데이터 목록과 시험 대조군의 타당성을 포함한 결과 평가

p) 관찰된 기타 효과에 대한 설명

q) 결과에 대한 논의

r) 결론

부록 E

고분자 시험물질로부터 용출액 준비 방법

E.1 일반사항

이 부록은 기니피그 극대화시험(GPMT)에서 사용되는 고분자 시험물질의 용출액 준비에 관한 지침을 제공한다. 용출액 준비는 참고문헌 [22]에 기술되어 있다.

E.2 준비 방법

E.2.1 예비 용출

GPMT에서 사용을 위한 가장 적절한 용출 과정을 결정하기 위해 시험검체에 대해 예비 용출 과정을 수행한다.

용출을 위한 용매로는 메탄올과 아세톤을 권장한다. 시험검체는 (가능한 한) 작은 조각으로 잘라 별도의 두개의 플라스크에 놓는다. 각 용매의 10배∼20배(즉, 시험검체 각 1그램에 대한 용매 10 ml∼20 ml)를 각 플라스크에 첨가하여, 용출을 위해 플라스크를 실온에서 진탕(shake)한다. 24시간∼72시간 내에 매번 동일한 양의 새로운 용매를 사용하여 진탕(shaking)에 의한 용출을 3회 실시한다[예를 들어, (4 ± 1)시간, (8 ± 1)시간, 또는(24 ± 2) 시간]. 용출액을 각 용출 기간에 수집하여 혼합한다. 잔류물을 얻기 위해 용매를 증발시켜 제거한다.

시험에 가장 적합한 용매는 얻은 잔류물의 질량을 기초로 결정된다. 잔류물의 생성률을 측정해야 한다. 가장 많은 양의 잔류물을 생성하는 용매를 감작성 시험을 위한 용출 용매로 선정한다.

올리브오일, 아세톤, 메탄올 또는 DMSO(디메틸설폭사이드, dimethylsulfoxide)를 첨가하여 잔류물의 용해성을 결정한다.

대부분의 잔류물을 용해하는 용액을 GPMT에서 시험 용매로 사용한다.

주) 시험검체가 아세톤이나 메탄올로 용해되거나 분해되는 경우 또는 적합한 양의 잔류물을 얻을 수 없는 경우에는 노멀핵산(n-hexane)이나 시클로헥산과 2-프로파놀의 1:1 혼합물을 용출 용매로 사용할 수 있다.

E.2.2 최종 용출

E.2.2.1 일반사항

유기용매 용출로 시험용액을 준비하는 두 가지 방법이 있다. 방법 1은 잔류물의 충분한 양을 얻어서 시험검체의 용매용출에 의해 얻어진 잔류물의 양과 시험검체의 중량이 상대적으로 높을 때 적용한다. 이외에도 방법 1은 특히 반복적으로 사용하는 의료기기에 대한 위험을 평가하는데 권장된다. (참고문헌 [56] 참조)

방법 2는 시험검체의 용매 용출에 의해 얻어진 잔류물의 양 또는 시험검체의 중량이 상대적으로 낮을 때 적용한다. 후자의 예로는 콘택트렌즈와 인공수정체가 있다.

방법 1과 2 모두, 용매의 양은 시험검체의 용출 중에 사용된 용매의 양과 동일하며 시험 용출액과 같은 농도 과정을 따른다. 이 용매 공시험액은 시험의 각 단계를 위한 음성 대조군으로 사용된다.

E.2.2.2 방법 I에 따른 시험검체 준비

방법 1의 경우, 용출은 10-20배 용량을 가진 적합한 용매(예비 용출 시험에서 결정된 대로)로 시험검체를 덮고 실온에서 교반(진탕)하여 수행한다.  용매는 또 다른 플라스크에 채취한다. 용매는 3회 교체하고[예를 들어, (4 ± 1)시간, (8 ± 1)시간, 또는(24 ± 2) 시간], 시험물질로부터 용출된 물질의 침출과 안정성에 따라 24시간∼72시간 이내에 실온에서 교반을 반복한다.

채취한 용매를 증발시켜 잔류물을 얻는다. 감압(reduced pressure) 조건 하에서도 조정된 증발을 보장하는 가능한 한 최저의 온도에서 회전증발기(rotary evaporator)를 사용한다.

상기 예비 용출 시험의 용해도 실험에 의해 결정된 대로 적합한 용매(올리브오일/아세톤/에탄올/DMSO)에서 잔류물을 용해시켜 GPMT의 피내 유도 단계와 국소 유도 단계에 사용하는 10 %(w/w) 및 20 %(w/w)의 시험 용액을 준비한다.

GPMT에서 유발단계의 경우에는 10 %(w/w) 용액을 용매로 준비한다. 10 % 용액은 1 %, 0.1 %, 0.01 % 및 0.001 % 시험용액을 얻기 위해 용매와 추가로 희석한다.

E.2.2.3 방법 2에 따른 시험검체 준비

방법 2의 경우, 용출은 적합한 용매(예비 용출 시험에서 결정된 대로)의 10-20배의 용매로 시험검체를 덮고 실온에서 (24 ± 2)시간 동안 진탕하여 수행한다. 용매는 플라스크 하나에 채취한다. 용출 과정은 매번 동일한 양의 신선한 용매를 사용하여 24시간∼72시간 내에 3회 반복한다. 용출액은 플라스크 하나에서 혼합하고 용매는 증발시킨다.

피내 유도 단계의 경우, 얻어진 용출액은 용출액의 밀리미터(ml) 잔류 수치가 사용된 검체의 원래의 그램(g) 수의 절반보다 약간 적거나 같을 때까지 증발시키거나(예를 들어, 시험 검체 10g이 용출과정을 거치는 경우, 용출액은 약 5ml로 내려갈 때까지 증발시킴), 잔류물을 얻을 때까지 완전히 증발시킨다. 잔류물을 얻은 경우에는 이것을 적합한 용매(예비 용출 시험에서 결정된 대로)로 5ml까지 용해시킨다. 이 용액은 200% 시험 용액으로 간주한다.

이외에, 100 % 시험용액은 200% 시험용액을 용매와 희석하여 준비한다.

국소유도단계의 경우에는 100% 시험 용액을 사용한다. 피내 및 국소 유도 단계의 경우에는 200%와 100% 시험용액에서 용매는 올리브오일로 대체하는데 시험용액과 동일한 양의 올리브오일을 혼합하고 질소기체의 기류하에서 용매를 증발시킨다.

유발단계의 경우에는 100 %, 50%, 25%, 12.5% 및 6.25% 시험용액을 사용한다. 100% 시험용액은 용매와 희석하여 50 %, 25 %, 12.5 % 및 6.25 % 시험용액을 얻는다. 유발단계의 경우, 시험용액에서 용매는 올리브오일로 대체하지 않는다.

E.3 기니 피그 극대화 시험(GPMT)

E.3.1 일반사항

GPMT는 아래에 설명된 유발단계를 제외하고 6.3에 기술된 대로 시행해야 한다. 용매 용출 방법을 사용하는 유발단계는 폐쇄 드레싱이 없이 수행해야 한다.

E.3.2 유발단계

폐쇄 첩포 적용 후 2주일이 지나면 모든 시험동물 및 대조동물을 시험검체로 유발시킨다.

방법 1의 경우에는 10 %(w/w), 1 % 및 0.1 % 시험용액의 0.1ml 부분표본(aliquot)을 각각의 시험동물과 음성 대조동물의 오른쪽 옆구리에 국소적으로 적용한다. 이외에 0.01% 및 0.001 % 시험용액의 0.1ml 부분표본(aliquot)을 음성 대조 용매를 각각의 시험동물과 음성 대조동물의 왼쪽 옆구리에 국소적으로 적용한다.

방법 2의 경우에는 100%, 50% 및 25% 시험용액의 0.1ml 부분표본(aliquot)을 각각의 시험동물과 음성 대조동물의 오른쪽 옆구리에 국소적으로 적용한다. 이외에 12.5%와 6.25% 시험용액의 0.1ml 부분표본(aliquot)과 음성 대조 용매를 각각의 시험동물과 음성 대조동물의 왼쪽 옆구리에 국소적으로 적용한다.

방법 1과 방법 2의 경우 모두, 양성 대조 동물은 왼쪽 옆구리에 에탄올 0.1ml 부분표본(aliquot)을 적용하고, 오른쪽 옆구리에 0.1% DNCB가 들어있는 에탄올 0.1ml 부분표본(aliquot)을 적용한다.

주) 폐쇄 유발은 비슷하게 실시될 수 있다.

부록 F

(참조)

배경 정보

F.1 자극성 시험에 대한 배경 정보

덩치가 작은 동물의 피부 자극성 시험은 사람의 피부 자극 및/또는 점막 조직 자극을 일으킬 가능성이 있는 원자재를 식별하는 데 도움을 주기위하여 실시한다. 주요한 자극제는 심한 자극, 수포 및/또는 괴사, 염증의 출현을 특징으로 하는 직접 손상 효과의 결과로 피부에 염증성 변화를 일으키는 원자재이다.

토끼는 토끼의 피부 자극성에 관한 정보가 Registry of Toxic Effect of Chemical Material (RTECS)에 다수 입증되어 있기 때문에 가장 선호되고 있는 동물이다. RTECS 등록된 2000개 이상의 정보는 85%가 토끼에 대한 시험결과이며, 7.5%는 사람에 대한 시험결과이며, 4%는 마우스, 3%는 기니피그에 관한 시험결과이다. 즉, 공개적인 논문에 제시되어 있는 대다수의 유용한 자료들은 토끼를 이용해 얻은 것들이다. 비록 염증이 일어나지 않은 부위라도 염증이 일어난 부위와 동일 반응이 일어난 것일 수 있으므로 시험부위에 반드시 염증이 일어날 필요는 없다.

피부 자극성 시험에서는 숙주, 시험 투여량, 첩포 크기, 폐쇄의 정도, 노출 시간, 용매, 해석 시간과 해석 품질의 차이에 따라 다양한 결과가 나온다. 그러므로 사람의 피부 자극성 시험에 있어서는 잘 알려져 있는 양성 대조 원자재와 음성 대조 원자재를 포함시켜서 시험결과를 비교하는 것이 중요하다. 순도 ≥ 99%의 소디움도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)는 임상 연구에서 널리 사용되어 왔기 때문에 자극성에 대한 양성 대조군으로 선호되고 있다. 또한 이 물질은 기타 부작용을 일으키지 않으며, 광범위하고 쉽게 이용할 수 있다. SDS와는 다른 방식으로 작용하는 노나논산 (nonanoic acid)도 마찬가지로 양성 대조군으로 이용할 수 있다.

SDS 노출은 자원자 패널을 조정하고, 기준점으로 작용한다. SDS는 EU 표준 (88/ 379 / 1988년 6월 7일의 EEC 이사회 지침)에 따라 피부 자극제로 분류되었다. 그러나 SDS의 자극성이 피부 자극제로 간주해야 하는 반응 역치 수준에 있는 지 또는 이에 밀접해 있는 지는 명확하지 않다. 따라서 순수한 원자재를 사용하는 것보다는 최소한 하나 이상의 지역 그룹 (EU)이 피부에 대한 유의적인 급성 자극으로 간주하고 있는 SDS의 최소 수준, 즉 20% (질량 농도)의 수용성 제제를 기준으로 삼는 것이 보다 적절하다.

시험동물을 이용한 피부 자극성 시험은 체외 모델의 개발 및 지원자의 사용 빈도가 증가됨에 따라 점차 감소하고 있다. 생물공학 또는 비침습의 객관적인 측정 방법을 이용하여 자극 반응을 정량화하고 있기 때문에 주관적 육안 해석 기준에 의존하는 일은 점점 더 줄어들고 있다. 그러나 지난 10년간의 경험은 알비노 토끼의 드레이즈 (Draize) 피부 자극성 시험을 통해 얻어진 것들이다.  털을 자른 등 부분의 손상되지 않은 부위에 거즈 첩포(patch)를 붙이고 그 아래에 시험원자재를 넣는다. 이를 3마리 토끼에 적용한다. 접착테이프로 첩포를 안전하게 고정시키고, 동물들의 몸통을 (4 ±0.5)시간 동안 밀폐형 드레싱이나 또는 반밀폐형 드레싱으로 감싸둔다. 4시간이 지나면 첩포를 제거하고, 시험부위를 깨끗하게 닦은 후 1시간 후에 홍반과 부종의 반응 등급을 매긴다.

이와 마찬가지로 (24 ± 2)시간, (48 ± 2)시간, (72 ± 2)시간 마다 반응 등급을 매긴다.

토끼 안자극성 시험은 사람의 안자극성을 예측하기 위하여 개발되었다. 드레이즈 (Draize)는 안자극성 평가를 돕기 위하여 등급 체계를 발표하였다. 눈 손상에 대한 평가를 돕기 위하여 도해가 들어 있는 지침이 발표되었다.

안자극에 미치는 영향을 조사하기 위한 대안으로 체외 방법이 개발 중에 있으나, (참고문헌 [26] 참조) ICCVAM에서 최근 평가한 4가지 체외 대체 시험 시스템 중 2 가지는 심각한 자극 및 부식을 위한 체내 동물시험을 대체할 수 있도록 충분히 발전되었다.  BCOP 시험법(Bovine Corneal Opacity and Permeability test)과 ICCVAM 시험방법 평가보고가 그것이다[107]. 약한 자극제(irritnats)에 대해서는 체내 시험이 여전히 필요할 수 있다.

Research Institute for Fragrance Material Monographs의 향료와 방향유에 의한 피부 자극의 광범위한 사람 대상 자료는 Food and Cosmetic Toxicology에 발표되었다. 참고문헌 [5]에는 추가적인 배경 정보가 제시되어 있다. OECD 지침 프로그램에 있는 화학 물질들에 대해 사람에게 미치는 국소적인 피부 영향과 관련된 OECD 지침을 개발해야 한다는 필요성은 아직 합의되지 못한 상태이다.

F.2 피부 감작을 위한 감작성 시험

사람에게서 감작은 1회 또는 반복적인 피내 노출 이후에 나타나며, 면역 체계 요소에 의해 시작되고, 유도된다. 가장 중요한 것은 합텐 (화학 물질)이 피부에 실제로 존재해야하며, 침투할 수 있어야 한다는 것이다. 합텐은 면역원성 복합체를 형성하는 피부 단백질과 반응을 한다. 표피/피부 경계에 있는 랑게르한스 세포 (Langerhans cells)는 특정한 림프구에 대한 항원을 만들어 면역 반응이 일어나도록 활성화시킨다. 이들 가운데 비율이 낮은 림프구는 오래 살아있는 기억세포이며, 이들은 항 참조가 진행되는 동안 주요한 활성 인자로 작용한다. 따라서 나중에 재-노출되면 활성화된 림프구에 의해 분비된 림포카인과 손상 부위에 모인 여타의 염증 세포들이 매개하는 부작용의 원인이 될 수 있다.

1895년에 야다손 (Jadassohn)은 임상 환자들을 수은 접촉 알레르기에 노출시키기 위하여 첩포(patch) 시험방법을 이용하였다. 이러한 혁신적인 접근법은 사람과 동물의 접촉 알레르기를 예측하고 진단하려는 이후의 시험들의 과학적인 근거가 되었다. 화학 물질의 잠재적인 감작성을 평가하기 위한 예상적/예측적 방법은 기니피그를 이용한 피부 감작성 시험을 완전히 입증해낸 란트슈타이너 (Landsteiner)와 체이스(Chase)의 선구적인 연구에 뒤이어 개발되었다.

매그누슨과 클리그만은 기니피그 시험의 다양한 변수를 조사하고, 피내 주사(프루인드 완전 보조제, FCA를 이용하거나 이용하지 않은)를 한 다음 동일한 부위에 시험원자재를 국소적으로 적용하는 기니피그 극대화 시험 (GPMT) 과정을 제시하였다. 시험원자재가 비자극성인 경우에는 본래의 시험과정에 앞서 사전 처리를 해야 한다. “약하다”는 의미에는 양성 반응자의 발생률이 0이라는 의미가 포함되어 있기 때문에, 정의에 의해 그것은 약한 감작제를 검출한다. 이는 민감한 시험방법으로 광범위하게 사용되고 있다. 프루인드 완전 보조제의 사용으로 시험방법의 민감도가 증대되었으며, 일부의 경우에서는 문제가 되는 화합물의 잠재적 감작성이 과대평가될 수도 있다.

1965년에 뷰러 (Buehler)는 사람에게 사용되는 과정을 모방하고, 노출을 최적화하는 방법으로 폐쇄형 첩포 (폐쇄를 시키는)의 사용을 옹호하였다 (사람의 반복 손상 첩포 시험방법 : HRIPT), 폐쇄형 첩포 과정은 민감하고, 중간정도부터 심각한 정도 까지의 감작제를 정확하게 예측할 수 있는 것으로 나타나, HRIPT의 과정 동안 예상되는 부작용에 대한 사람의 노출을 피할 수 있도록 한다. 제시된 자료에 의해 피내 주사와 개방형 국소 적용보다 폐쇄 방법이 우수한 것으로 나타났다. 면역 체계를 자극하기 위하여 보조제를 사용하지 않았다. 이 방법은 가장 약한 감작제를 검출할 만큼 충분히 민감하며, 위험 평가 과정에 사용해도 될 만큼 충분히 유연한 기법으로 인정받고 있다. 그러나 폐쇄형 첩포(patch) 시험 (뷰러 시험) 방법은 GPMT에 비해서는 민감도가 떨어진다.

미국의 폐쇄형 첩포 방법과 유럽의 GPMT는 가장 빈번하게 사용되고 있는 안전성 평가 방법이다. 이들은 또한 OECD와 EU의 현행 시험 지침에서도 선호하고 있는 시험방법이기도 하다. 기니피그 감작 평가에서 얻어지는 결과들은 시험결과에 대한 실험실간의 편차를 나타낼 수 있는 동물관련 요소 및 기술적인 요소에 의해 좌우되는데, 그러한 요소들의 예에는, 동물의 혈통, 성별, 나이, 시험 환경 상태, 동물의 시험부위, 털 제거 방법 (자르기/면도) 또는 화학적 탈모, 첩포 모양, 시험원자재의 양, 폐색의 질, 노출 시간과 조직 반응 해석법 등이 있다. 이외에도 수많은 시험방법들이 사용되고, 조사되고 있으며, 지지자들의 옹호를 받고 있다. 이들 가운데에는 현재 조사자들에 의한 적절한 검증과 승인만 있다면 규제를 위한 목적에 적합한 것으로 간주되는 것들도 있다. 어떠한 경우에도 시험과정은 원본 참조에 따라 실시되어야 한다. 기타 시험방법에 대한 목록은 표 F.1에 제시되어 있다.

참고문헌 [49]는 피부 감작성 시험에 대한 최신의 자료들이 수록되어 있다.

표 F.1 지연성 접촉 감작 시험의 대안적 빙법들

1. 프루인드 완전 보조제 시험

2. 분리 보조제 시험

3. 개방형 피내 단자 시험

4. 마우어 (Mauer) 최적화 시험

5. 기니 피그 발바닥 시험

6. 누적 접촉 강화 시험

7. 긁힌 피부 (보강제와 첩포(patch)) 시험

8. 마우스 귀 부종 시험

GPMT와 뷸러시험법(Buehler test) 폐쇄형 첩포 시험 외에, 현재 국부적인 림프절 평가 방법 (LLNA)이 현행 기니피그 시험방법에 대한 유일한 대안이자 동물 관리를 향상시키는 방법으로 OECD(Organization for Economic Cooperation and Development)의 승인을 받았다.(참고문헌 [88] 참조) LLNA는 화학물질의 과민반응 활동의 측정에 대해 검증되었다.(참고문헌 [94], [95] 참조)

시험의 과학적 근거는 시험물질에 국부적으로 노출되었을 때 3H-메틸 티미딘 (methyl thymidine)과 마우스의 배출 림프절(draining lymph nodes)의 림프구가 결합되는 양으로 감작을 측정하는 것이다. 여기에는 유발단계가 포함되어 있지 않다. 알고자 하는 종점(endpoint)은 자극 지수인데 이것은 대조동물의 림프절에 결합된 티미딘의 양에 대한 투여된 동물의 림프절에 결합된 티미딘의 양의 비율을 나타낸다. 만약 자극 지수가 3 (SI > 3)을 초과한다면, 시험은 양성이다. LLNA의 실험실간 평가와 실험실내 평가는 실험실들 간에서 그리고 실험실들 내에서 재현할 수 있는 투여량-반응 관계를 입증해 주었다. 그러나 LLNA로는 자극성 물질과 알레르기성 물질을 구분하기가 어렵다는 사실도 보고되었다. 그 결과 자극성과 알레르기성을 모두 갖추고 있는 물질일 경우에 LLNA는 알레르기성을 과대평가하거나, 자극제에 대해 가양성을 나타낼 수도 있다. 그러나 LLNA는 시험 기간이 보다 짧고, 종점이 보다 객관적이며, 시험에 필요한 물질의 양이 보다 적고, 프루인드 완전 보조제 주사법이 생략되어 있기 때문에 기니피그 평가법에 비해 진보한 방법이다. 유세포 분석 검사와 세포 활성 표지자 분석법을 이용해 시험과정을 진보시킬 수 있다. 독성학에 대한 LLNA 정례 방법에는 사실상 이들을 표준으로 할 수 있는 지의 여부가 결정되어 있지 않다. 반면, LLNA는 보다 한정된 범위 내에서 시험 용매를 선정하도록 한다. 대부분의 시험에는 아세톤과 올리브유를 혼합한 물질이 사용되고 있다. 최근의 연구는 다른 용매를 사용하면 결과도 달라질 수 있다는 사실을 보여주고 있다. 더욱이 LLNA에서는 림프절을 채취하기 이전에 유도 처리를 하고 그 후에 동물들을 안락사 시키기 때문에 교차 반응성 유형이나 유발단계를 시험할 수가 없다.

림프절 평가 방법의 대안은 발바닥에 피하 투여를 하는 오금림프절 검사 (popliteal lymph node assay; PLNA)이다. 오금림프절 검사에서는 림프절 활성화를 직접 측정하는 것 외에 시험대상 화학물질이 유발시키는 면역제어를 보다 명확하게 하기 위하여 표지 항원을 이용한다.

위험성 평가 과정은 단일 모델이나 일률적인 접근법에 의존해서는 안 되며, 또한 사용자의 안전을 최대한으로 보장하기 위하여 신중하게 시행되어야 한다. 일반적으로 위험성 평가는 동물 시험 모델과 사람 시험 모델 모두를 필요로 한다. 이론적으로 증명되고 및/또는 승인된 경우에는 모델과 접근법을 유연하게 선정할 수 있어야 한다.

적절하게 시행되고, 시험농도에 사용 조건 이상의 충분한 안전 요인이 있다면 기니피그의 음성 시험은 마지막 시험이 될 수 있다. 그러나 완제품의 사용량을 충분히 고려하지 않고 발병률 및/또는 심각성만을 바탕으로 시험원자재의 등급을 분류하는 일은 삼가 하여야 한다.

제품에 대한 알레르기 반응의 위험성, 즉 다시 말해 발병률과 강도는 일반적으로 다음의 4가지 요소에 따라 결정된다; 화학물질 알레르겐이 감작에 미치는 영향, 제품에 들어있는 알레르겐의 양, 생체 이용률, 노출조건, 화학물질의 상대적인 감작 가능성은 기존의 감작 수준을 유도하는데 필요한 최소한의 유도 농도로 규정할 수 있다. 농도가 낮을수록 더 강력한 감작제이다. 제품에 들어 있는 잔여 알레르겐의 수준이 GPMT로 구한 최소 유도 농도를 초과하는 경우, 사용자들에게서 알레르기성 접촉 피부염이 상당수 발견되었다.

한편, 혼합물과 제품에 대한 예측적 시험은 훨씬 덜 검증되었고, 제품 구성물질의 시험 후에 실시될 수 있다. 따라서 시험 설계와 결과에 대한 분석은 불확실성한 면이 있지만, 몇몇의 사례들은 이러한 시험방법의 가능성을 입증해주고 있기도 하다. 사람에게 접촉성 피부염을 일으키는 스웨터에서 용출한 아세톤 용출액의 동물 시험에서 알레르겐 (포스겐 클로로페닐히드라존, phosgene chlorophenylhydrazones)이 입증되었다. 또 다른 사례는 사람한테 접촉성 피부염을 일으키는 고무장화에서 용출한 아세톤/클로로폼 용출액의 동물 시험인데 이 시험에서는  메르캅토벤조티아졸 (mercaptobenzothiazole)과 디벤조티아질이황화물 (dibenzothiazyldisulfide)이 원인 알레르겐인 것으로 밝혀졌다. 적합한 유기 용매 사용의 중요성이 명확하게 입증되었는데, 그 예로 생리식염수 용출물은 기니피그의 피부 감작성을 유도해내지 못했지만, 유기 용매로 용출한 용출액은 기니피그의 피부 감작성을 유도해냈다.

일본의 의료용 물질과 기기의 기본적인 생물학적 시험에 관한 지침 (Guidelines of Basic Biological Test of Medical Material and Devices, 1995)에서는 유기 용매로 검체를 준비하는 과정을 채택하였는데, 잔류물을 얻기 위하여 용매를 증발시키고, 동물의 피부 감작성을 유도할 수 있는 잔류물(혼합물)의 최소 희석 비율을 가지는 원자재로부터 산출된 잔류물의 비율을 비교함으로써 위험성을 평가하는 방법을 채택하고 있다.

피부 감작을 시험하기 위한 체외 방법이 아직까지 통상적으로 사용되고 있지 않지만, 화장품에 대한 동물시험의 이용을 금지하는 유럽의 새로운 규정에 비춰볼 때, 감작제의 확인을 위해 새로운 전략이 이용될 수 있을 것 같다. (참고문헌 [14], [108], [111], [112], [113] 참조)

참고문헌

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제12장 고분자 소재 의료기기에서 얻어진 분해산물의 확인과 정량

(관련규격: ISO 10993-13:2010)

1 적용범위

본 장에서는 임상에서 사용될 고분자 의료기기의 분해 산물을 정량하고, 확인하기 위해 모의환경에서 시험방법을 설계할 때 필요한 일반 요건에 대한 지침을 제시한다.

본 장에서는 분해 산물을 생성하는 두 가지 방법으로 모의환경에서의 실시간 분해 시험과 스크리닝 방법으로서의 가속 분해 시험을 설명한다. 체내 사용위치에서 중합되는 원재료의 경우에는 중합된 상태거나 경화된 것을 이용하여 시험한다. 얻어진 자료는 고분자의 생물학적 평가에 사용된다. 본 규격은 비흡수성 고분자만을 고려한다. 흡수성 고분자의 경우에는 비슷하지만 적절히 변경된 과정들을 적용할 수 있다.

본 장에서는 고분자 의료기기 완제품이 화학적으로 변경되어 생성되는 분해 산물만을 다룬다. 사용하는 동안 기계적 응력(mechanical stress), 마모(wear), 전자기방사선(electromagnetic radiation) 또는 효소, 기타 단백질 및 세포 활동과 같은 생물학적 요인들에 의해 유도된 의료기기의 분해에는 적용되지 않는다.

주) 고분자의 환경응력균열 (environmental stress cracking, ESC)을 다룬 정보가 분해 시험의 설계를 위한 보조 자료로 포함되어 있다(부록 B 참조).

가용성 분해 산물과 파편의 생물학적 작용은 본 장에 제시되어 있지 않지만, 제1장(ISO 10993-1), 제15장(ISO 10993-16) 및 제16장(ISO 10993-17)의 원리에 따라 평가하여야 한다.

의료기기에 사용되는 고분자 원재료의 범위가 광대하기 때문에 특정한 분석 기법을 지정할 수 없다. 분해 산물의 허용 수준에 관한 특정한 요건은 이 규격에 제시되어 있지 않다.

2 정의

본 장의 목적을 위해 다음 용어와 정의를 적용한다.

2.1 잔류 단량체(residual monomer)

고분자 사슬을 만드는데 사용하는 화합물로서, 반응하지 않고 최종적으로 만들어진 고분자 내에 여전히 남아있는 화합물

2.2 분해 산물(degradation product)

고분자 원재료의 분해에서 유래된 화합물(연속적인 화학 반응에 의하여 생성된 화합물도 포함된다.)

2.3 고분자 원재료(polymeric material)

단량체라고 불리는 단위로 형성된 가교 분자 및/또는 긴 사슬로 되어 있는 원재료

2.4 가수분해(hydrolytic degradation)

물에 의해 고분자의 화학적 결합이 끊어지는 것

주) 물은 중성이거나 산성 또는 알칼리성일 수 있으며, 화합물 또는 이온을 부가적으로 함유할 수 있다.

2.5 산화분해(oxidative degradation)

하나 이상의 산화제(oxidizing agents)에 의해 고분자의 화학적 결합이 끊어지는 것

2.6 파편(debris)

고분자 원재료의 분해에 의해 생성된 미립자 원재료

3 분해 시험방법

3.1 일반적인 과정

3.1.1 시험 설계

제8장(ISO 10993-9)에 따라, 분해 산물의 생성, 확인, 정량을 위해 분해 시험을 이용하여야 한다. 가속 시험에서 분해를 관찰한다면, 분해 산물의 확인 및 정량이 위험(risk) 분석에 대한 충분한 정보를 제공해 줄 수 있다. 가속시험에서의 분해산물의 확인과 정량에서 위험 분석에 대한 충분한 자료를 얻지 못한다면 실시간 시험을 시행하여야 한다. 준수하여야 하는 일련의 단계들은 이 규격에 상세하게 설명되어 있다.

주) 가속 분해 시험은 스크리닝 시험으로 사용할 수 있다. 가속 시험에서 분해가 관찰되지 않는다면, 실시간 분해 시험을 실시할 필요가 없다.

3.1.2 검체 준비

선택된 방법에 대한 구체적인 언급이 없다면, 검체 준비의 전반적인 사항은 제11장(ISO 10993-12)을 따르도록 해야 한다.

3.1.3 초기 원재료특성 규명

초기 원재료특성을 규명하는데 사용하는 분석 방법은 조사 대상 고분자 원재료에 적합한 것이어야 한다. 사용된 분석 기법은 기록하고, 정당성을 입증하여야 한다.

이 규격의 부록 A에는 고분자 원재료의 특성을 규명하기 위한 분석 방법 목록과 그 적용범위가 제시되어 있다.

3.1.4 시험용액 및 장치

3.1.4.1 시험용액

3.1.4.1.1 일반사항

시험보고서에서 사용된 모든 시험 용액(들)을 설명하고 타당성을 입증하여야 한다.

시험 용액은 고분자 의료기기의 사용 환경과 가능한 한 비슷하게 선정되어야 한다.

사용환경을 그대로 모방할 수 없는 경우에는 분해를 위한 첫 번째 스크리닝 과정으로 3.1.4.1.2와 3.1.4.1.3의 시험용액을 사용할 수 있다. 이러한 시험용액은 체내환경에서보다 고분자 원재료의 분해를 더 유발할 수도 덜 유발할 수도 있다.

특정 고분자 또는 특정 사용 환경을 위해서는 다른 시험 용액을 선정할 수 있다.

주) 파편 또는 분해 용액의 생물학적 평가를 실시하는 경우에는 항균 또는 항진균 첨가제가 이러한 평가를 방해할 수 있으므로, 실시간 분해 시험기간 동안에 멸균 환경을 유지하는 것이 필요할 수 있다.

3.1.4.1.2 가수분해용 시험용액

가수분해를 하는 경우 다음의 시험용액이 제안된다.

1) ISO 3696에 따른 2등급의 분석 실험용 물

2) 완충용액

주) 가수분해 시험에서 사용된 완충용액의 예는 ISO 13781을 참조한다.

3.1.4.1.3 산화분해용 시험용액

산화분해를 하는 경우 다음의 시약이 제안된다.

1) 예들 들어 3% 과산화수소 용액과 같은 물과 과산화수소, 약전 등급

2) 펜톤 시약(Fenton's reagent) [희석한 과산화수소 용액과 철(Ⅱ) 염의 혼합물, 예들 들어, 100㎛ol Fe2+와 1mmol H2O2].

이러한 산화 용액들은 시간이 연장되거나 온도가 상승하면 안정적이지 않을 수 있다. 따라서 산화 능력은 적합한 범위 내로 유지되도록 해야 한다.

이러한 안정성 범위를 기록하고, 정당성을 입증하여야 한다.

3.1.4.2 용기

시험 용액에 따라 폐쇄형 시스템에 화학등급유리기구(chemical grade glassware), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene) 또는 폴리프로필렌(polyproplyene) 용기를 이용하여야 한다. 용기에 의한 오염물질을 평가하기 위하여 대조군을 이용하여야 한다. 용기가 분석을 하는데 방해 요인이 아니라는 사실을 입증하여야 한다.

3.1.4.3 저울

질량 손실을 측정하는데 사용하는 저울은 요구되는 정밀도(precision)로 초기 검체질량을 측정할 수 있는 것이어야 한다. 재흡수 되도록 설계된 원재료의 경우, 1%의 정밀도가 적합하며, 분해되지 않도록 설계된 원재료의 경우에는 최소한 0.1%의 정밀도를 이용하여야 한다. 최종 검체 질량에 대한 저울의 정밀도는 총 검체 질량에 대해 흡수성 고분자의 경우 0.1%, 안정한 고분자의 경우에는 0.01%가 되어야 한다.

질량 손실을 측정하는 방법의 표준편차와 정밀도를 시험보고서에 명시하여야 한다.

3.1.4.4 건조 장치

오염이나 휘발성 분해 산물의 손실 없이 질량을 유지하면서 시험검체를 건조시킬 수 있는 장치를 이용하여야 한다.

시험보고서에 장치를 기술하고 명확하게 하여야 한다.

3.1.4.5 진공 기구(Vacuum source)

건조 장치 내에서 충분한 진공 상태(< 0.5kPa)를 만들어낼 수 있는 장치가 적합하다.

시험보고서에 장치를 기술하고 명확하게 하여야 한다.

3.1.4.6 분리 장치

분해 시험을 하는 동안 생성된 파편을 분리할 수 있는 장치를 이용하여야 한다. 이러한 장치에는 불활성 필터, 온도 조절 원심 분리기 또는 이들을 결합한 장치가 포함될 수 있다.

시험보고서에 장치를 기술하고 이를 명확하게 규정하여야 한다.

3.1.5 시험검체의 개수

각각의 시험 기간 동안 최소한 세 개의 시험검체를 이용하여야 한다. 시험검체는 완제품 자체이거나 또는 완제품을 대표하는 검체 이어야 한다. 각각의 검체를 위하여 별도의 용기를 사용하여야 한다. 각 시험 기간에 대해 공시험액을 이용하여야 한다.

타당한 통계적 분석이 필요한 경우에는 각각의 시험 기간마다 보다 많은 검체를 이용하여야 한다.

3.1.6 시험검체의 모양과 크기

분해 산물을 적합한 양으로 생성하는데 있어 시편의 크기와 모양이 중요하다. 완성된 의료기기의 부분을 시험검체로 이용하는 경우에는 일반적으로 생물학적 환경과 접촉을 하지 않는 표면은 피하거나 최소화하여야 한다.

질량 밸런스(mass balance)를 측정하기 위해서 분해 용액과 일정 질량 간의 평형이 적절한 시간 내에 이루어 질 수 있도록 검체의 표면적과 모양, 크기를 선정하여야 한다.

둘 이상의 원재료로 구성되는 의료기기의 경우에는, 원재료들의 복합적인 효과를 고려해야 한다. 본 규격에 따라 시험이 되지 않는 경우에는 해당 의료기기의 다른 대표적인 원재료가 시험 용액에 추가 되어야 한다.

주 1) 어떤 조건 하에서는 의료기기의 제조에 사용되는 것과 동일한 공정, 세척, 멸균 방법을 이용하여 시험검체를 제작해야 할 수도 있다.

주 2) 재흡수될 수 있는 고분자로는 분해 용액과 평형을 이루지 못할 수도 있다.

3.1.7 질량/부피 비율

시험 용액 부피에 대한 시험검체 질량 비율은 최소한 1g : 10ml이 되어야 한다. 검체를 완전히 시험 용액에 담가야 한다.

사용된 비율을 시험보고서에 기록하고, 그 타당성을 입증하여야 한다.

1g : 10ml의 비율은 실용적이라는 이유로 선정된 것이다. 그러나 이 비율을 이용할 때, 분해 산물의 방출이 분해 과정을 방해할 수 있으며, 분해 속도에 영향을 미치고, 분해 반응(들)의 평형에 영향을 미칠 수 있다는 사실을 고려하여야 한다.

3.1.8 검체의 전처리

질량 밸런스(mass balance)를 설정하기 위하여 일정한 질량으로 건조시켜야 한다. 의료기기에 휘발성 성분이 함유되어 있는 경우에는 적합한 건조 방법을 선정하여야 한다.

이러한 경우에는 시험보고서에 건조 방법과 건조 조건을 명시하고, 그 타당성을 입증하여야 한다.

3.1.9 pH 범위

시험 용액의 pH가 적당한 경우에는 적합한 범위 내에서 pH를 유지하여야 한다. 선정된 pH는 사용하려는 부위 (예들 들어, 위는 산성)에 적합한 것이어야 한다. 염증성 반응이 일어나는 것과 같은 생리적 현상에 의해 유도된 pH의 변화를 고려하여야 한다.

시험보고서에 pH를 기록하고, 그 타당성을 입증하여야 한다.

주1) 온도가 상승 하면 pH 값이 변경될 수 있다.

pH 값이 적합한 범위로 유지되지 않는 경우에는 생성된 분해 산물이 생물학적 조건 하에서 생성되는 것과 동일하지 않을 수도 있다.

3.1.10 질량 밸런스(mass balance)의 측정

시험 용액에서 검체를 제거할 때에는 적당량의 분석용 정제수(2등급 이상, ISO3696)로 검체를 세척하여야 한다. 물로 세척하여 방출된 파편과 세척한 물을 시험 용액에 첨가하여야 한다. 분리 장치로 얻은 파편과 검체를 일정한 질량으로 건조시킨 후 질량 밸런스(mass balance)를 측정하여야 한다.

주) 세척 횟수가 많아지면 희석으로 인해 용출물(leachables)에 대한 유체 상(fluid phase) 분석을 불가능하게 할 수 있다.

3.1.11 최종 원재료특성 규명

최종 원재료특성은 초기 원재료특성을 규명하는데 사용한 방법과 동일한 방법을 이용하여 규명하여야 한다(3.1.3 참조).

3.2 가속 분해 시험

3.2.1 온도

37℃ 이상의 온도와 고분자의 연화 범위 또는 융해 범위 이하의 온도를 선정한다. 타당한 사유가 없는 한 (70 ± 2)℃를 이용하여야 한다.

선정된 온도를 시험보고서에 기록하고, 타당성을 입증하여야 한다.

주 1) 온도가 높을수록 낮은 온도에서는 일어나지 않는 첨가제의 용해도에서의 변화와 부반응(side reactions)이 나타날 수도 있다. 고분자 원재료 첨가물의 열 특성을 고려하는 것을 권장한다.

주 2) 융해 범위(melting range)에 대한 정보를 얻기 위해 시차주사열량계(Differential scanning calorimetry)를 사용할 수 있다.

3.2.2 시험 기간

30일 이상 사용하는 의료기기의 경우에는 2일과 60일의 시험 기간을 이용하여야 한다. 30일 이하로 사용하는 의료기기의 경우에는 2일과 7일의 시험 기간을 이용하여야 한다. 의료기기의 사용목적이나 조사 대상 고분자에 따라 추가적인 시험 기간을 선정할 수 있다.

선정된 시험 온도가 70℃가 아닌 경우에 시험기간의 조정이 필요할 수 있다.

시험 기간을 기록하고, 그 타당성을 입증하여야 한다.

주) 흡수성(resorbable) 고분자로 만들어진 의료기기의 경우에는 의료기기의 보전성(integrity)이 상실될 때까지 시험 기간을 지속할 수 있다(각 원재료별로 규명된 바에 따라).

3.3 모의환경에서 실시간 분해 시험방법

3.3.1 온도

(37 ± 1) ℃에서 시험을 시행한다.

3.3.2 시험 기간

30일 이상 사용할 예정인 의료기기의 경우에는 1개월, 3개월, 6개월 그리고 12개월의 시험 기간을 이용하여야 한다. 30일 이하로 사용하는 의료기기의 경우에는 30일을 포함하여 네 가지 대체 시험 기간을 이용하여야 한다. 의료기기의 사용목적이나 조사 대상 고분자에 따라 추가적인 시험 기간을 선정할 수 있다.

시험 기간을 기록하고, 그 타당성을 입증하여야 한다.

주) 흡수성(resorbable) 고분자로 만들어진 의료기기의 경우에는 의료기기의 보전성(integrity)이 상실될 때까지 시험 기간을 지속할 수 있다(각 원재료별로 규명된 바에 따라).

4 시험과정

4.1 일반사항

준수해야 하는 단계들은 4.2, 4.3과 표 18에 설명되어 있다.

주) 가교 고분자 시스템을 평가하는 경우에는 분자량/분자량분포를 측정하는 대신에 가교의 밀도를 측정하고, 질량 밸런스(mass balance)를 계산하여 더 이상의 조치를 취할 것인지의 여부를 결정한다.

4.2 초기 원재료특성 규명

초기 원재료특성은 의료기기 완제품에 함유된 벌크 고분자, 잔류물, 그리고 첨가제에 대하여 기술하여야 한다. 소급 분석을 하기가 어렵기 때문에 이러한 정보는 원재료의 제조업자나 공급자에게 얻는 것이 가장 바람직하다. 고분자의 순도와 원재료의 제작에 사용된 첨가제의 특성을 완전히 규명하는 것이 중요하다(3.1.3 참조).

4.3 가속 분해 시험

4.3.1 초기 질량의 측정

일정한 질량이 되도록 시험검체를 건조시킨다. 시험검체의 질량을 측정한다.

건조 방법과 조건을 시험보고서에 기술하고 그 타당성을 입증해야 한다.

4.3.2 검체, 파편, 용액의 분리

4.3.2.1 필터에 의한 분리

실온과 진공 상태에서 일정한 질량으로 필터를 건조시킨다. 필터의 질량을 측정한다. 무게를 측정한 필터를 이용하여 분해 용액에서 생길 수 있는 파편을 검체로부터 분리한다. 필요한 경우, 진공 필터나 압력 필터를 이용할 수 있다. 분석 등급의 물(analytical grade water)을 이용하여 필터의 내용물을 세 번 세척한다.

4.3.2.2 원심 분리기를 이용한 분리

건조하고 깨끗한 원심 분리용 튜브의 질량을 측정한다. 원심 분리용 튜브로 분해 시험검체 용액을 옮긴 후 분리를 하기 전에 튜브를 밀봉한다. 단단한 파편 침전물을 만들기 위하여 원심 분리기에서 튜브를 회전시킨다. 별도의 용기에 상층액을 조심스럽게 따른다. 분석 등급의 물(analytical grade water)로 침전물을 재현탁 시킨 후 다시 회전을 시킨다. 앞서 상청액을 따라냈던 별도의 용기에 상층액을 다시 따라내어 첨가한다. 이러한 과정을 두 번 더 반복한다.

4.3.3 분석

4.3.3.1 질량 밸런스(mass balance)의 측정

실온의 진공 상태에서 일정한 질량이 되도록 필터와 필터의 내용물 또는 원심 분리용 튜브와 튜브의 내용물을 건조시킨다. 필터와 필터의 내용물 또는 원심 분리용 튜브와 튜브의 내용물 질량을 측정한다. 검체의 질량 손실을 측정한다.

4.3.3.2 최종 원재료특성 규명(검체와 파편)

적합한 방법으로 분자량과 분자량분포를 측정한다(3.1.11 참조).

4.3.4 평가

4.3.4.1 일반사항

표 18에 나와있는 시험 과정의 흐름도를 준수한다.

4.3.4.2 사례 1 (NO/NO)

질량 밸런스(mass balance)와 분자량/분자량분포에 변화가 없음.

분해가 관찰되지 않았다. 시험을 종료한다. 실시간 분해 시험은 필요하지 않다.

주) 일부 상황에서는 제8장(ISO 10993-9)에 따라 조사를 더 실시하여 이러한 결과를 확인할 필요가 있을 수 있다.

4.3.4.3 사례 2 (NO/YES)

질량 밸런스(mass balance)에는 변화가 없지만, 분자량/분자량분포가 변경됨.

분해 산물의 벌크 검체와 파편을 확인한다. 필요한 경우 실시간 분해 시험을 진행한다.

4.3.4.4 사례 3 (YES/NO)

질량 밸런스(mass balance)가 변경되었지만, 분자량/분자량분포는 변경되지 않음.

고분자가 분해되지 않고, 유체 상에 함유되어 있는 용출물(leachables)은 식품의약품안전청 고시「의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통 기준규격」에 따라 평가하여야 한다. 필요한 경우, 실시간 분해 시험을 진행한다.

주) 용출물(leachables)은 저온에서 생성될 수 없다. 용출물의 위험 평가(risk assessment)에 따라 모의 환경에서 실시간 분해 시험을 고려할 수 있다.

4.3.4.5 사례 4 (YES/YES)

질량 밸런스(mass balance)가 변경되고, 분자량/분자량분포도 변경됨

유체 상에서 고분자 분해 산물과 용출물(leachables)을 확인 및 정량하고 분해 산물의 벌크 검체와 파편을 확인한다. 필요한 경우, 실시간 분해 시험을 진행 한다.

주) 분해와 용출(leaching)는 저온에서 발생하지 않을 수 있다. 용출물(leachables)과 고분자 분해산물의 위험 평가(risk assessment)에 따라 모의 환경에서 실시간 분해 시험을 고려할 수 있다.

표 18  시험 절차

초기 원재료특성 규명
가속 시험(4.3 참조) 및 필요한 경우, 실시간 시험 실시(4.4 참조)
가속 분해 시험															모의 환경에서의 실시간 분해 시험
검체	파편					유체상									검체				파편			유체상
고체상과 유체상 분리 검체 및 파편 건조 질량 밸런스 설정															고체상과 유체상 분리 검체 및 파편 건조 질량 밸런스 설정
최종 원재료특성 규명															최종 원재료특성 규명
평가															평가
질량 밸런스의 변화 : (Y) 예 또는 (N) 아니오 분자량/분자량분포의 변화 : (Y) 예 또는 (N) 아니오															질량 밸런스의 변화 : (Y) 예 또는 (N) 아니오 분자량/분자량분포의 변화 : (Y) 예 또는 (N) 아니오
N/N		N/Y					Y/N			Y/Y				N/N		N/Y				Y/N			Y/Y
분해가 관찰되지 않았다. 시험을 종료한다. 실시간 분해 시험이 필요하지 않다. (4.3.4.2의 주 참조)		분해 산물의 벌크 검체/파편 확인한다. 그리고/또는 실시간 분해시험을 진행한다.					고분자가 분해되지 않음. 유체상에서 용출물을 확인하고 정량한다. 그리고/또는 실시간 분해 시험을 진행한다.			유체상에서 고분자 분해 산물과 용출물을 확인하고 정량한다. 그리고/또는 실시간 분해 시험을 진행한다.				분해가 관찰되지 않았다. 시험을 종료한다. (4.4.4.2의 주 참조)		분해 산물의 벌크 검체/파편을 확인한다.				고분자가 분해되지 않음. 유체상에서 용출물을 확인하고 정량한다.			유체상에서 고분자 분해 산물과 용출물을 확인하고 정량한다.

4.4 모의환경에서 실시간 분해 시험

4.4.1 초기 질량의 측정

일정한 질량이 되도록 시험검체를 건조시킨다. 시험검체의 질량을 측정한다.

4.4.2 검체, 파편 그리고 용액의 준비

4.4.2.1 필터에 의한 분리

실온과 진공 상태에서 필터를 일정한 질량으로 건조시킨다. 필터의 질량을 측정한다. 무게를 측정한 필터를 이용하여 분해 용액에서 생길 수 있는 파편을 검체로부터 분리한다. 필요한 경우, 진공 필터나 압력 필터를 이용할 수 있다. 분석 등급의 물(analytical grade water)을 이용하여 필터의 내용물을 세 번 세척한다.

4.4.2.2 원심 분리에 의한 분리

건조되고 깨끗한 원심 분리용 튜브의 질량을 측정한다. 원심 분리용 튜브로 분해 시험검체 용액을 옮긴 후 분리를 하기 전에 튜브를 밀봉한다. 단단한 파편 침전물을 만들기 위하여 원심 분리기에서 튜브를 회전시킨다. 별도의 용기에 상층액을 조심스럽게 따른다. 분석용 정제수(2등급 이상, ISO3696)로 침전물을 재현탁 시킨 후 다시 회전을 시킨다. 앞서 상층액을 따라냈던 별도의 용기에 상층액을 다시 따라내어 첨가한다. 이러한 과정을 두 번 더 반복한다.

4.4.3 분석

4.4.3.1 질량 밸런스(mass balance)의 측정

실온과 진공 상태에서 일정한 질량이 되도록 필터와 필터의 내용물 또는 원심 분리용 튜브와 튜브의 내용물을 건조시킨다. 필터와 필터의 내용물 또는 원심 분리용 튜브와 튜브의 내용물 질량을 측정한다. 검체의 질량 손실을 측정한다.

4.4.3.2 최종 원재료특성 규명(검체와 파편)

적합한 방법으로 분자량과 분자량분포를 측정 한다(3.1.11 참조).

4.4.4 평가

4.4.4.1 일반사항

표 18에 나와있는 시험 과정의 흐름도를 준수한다.

4.4.4.2 사례 1 (NO/NO)

질량 밸런스(mass balance)와 분자량/분자량분포에 변화가 없음

분해가 관찰되지 않았다. 시험을 종료한다.

주) 일부 상황 하에서는 제8장(ISO 10993-9)에 따라 조사를 더 실시하여 이러한 결과를 확인할 필요가 있을 수도 있다.

4.4.4.3 사례 2 (NO/YES)

질량밸런스(mass balance)에는 변화가 없지만, 분자량/분자량분포가 변경됨

분해 산물의 벌크 검체/파편을 확인한다.

4.4.4.4 사례 3 (YES/NO)

질량 밸런스(mass balance)가 변경되었지만, 분자량/분자량분포는 변경되지 않음.

고분자가 분해되지 않았으며, 유체 상에 함유되어 있는 용출물(leachables)은 식품의약품안전청 고시「의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통 기준규격」에 따라 평가하여야 한다.

4.4.4.5 사례 4 (YES/YES)

질량 밸런스(mass balance)가 변경되고, 분자량/분자량분포도 변경됨.

유체 상에서 고분자 분해 산물과 용출물(leachables)을 확인 및 정량하고 분해 산물에 대한 벌크 검체와 파편을 확인하고, 해당되는 경우 제1장(ISO 10993-1) 및/또는 제16장(ISO 10993-17)을 시행한다.

5 시험보고서

시험보고서는 다음의 정보들을 포함하여야 한다.

1) 시험원재료, 로트 번호 또는 배치 번호, 시험된 검체의 크기와 개수

2) 시험 용액과 조건

3) (해당되는 경우) 특이성, 민감도, 검출 한도 그리고 정량 한도를 포함하여 사용된 시험방법에 대한 상세한 설명과 정당성 입증

4) 정밀도(precision)를 포함하여 질량 손실을 측정하는데 사용된 방법

5) 검체의 질량/부피 비율, 검체의 모양

6) 검체 전처리방법과 건조 방법

7) 선정된 pH

8) 시험 온도

9) 시험 기간

10) 시험결과

(1) 질량 밸런스(mass balance)

(2) 분자량/분자량분포 (가교 밀도)

(3) 용액, 파편 및/또는 벌크 고분자로 실시한 시험결과

(4) 확인된 분해 산물

(5) 최종 결정에 대한 이론적 근거

11) 결론

부록 A

(참조)

분석 방법

다음의 분석 방법들은 해당되는 경우 고분자 원재료 및/또는 분해산물의 특성을 규명하기 위하여 제시된 것이다.

1) 용액 점도법 (분자 질량의 평균 계산, 분지 형성[branching])

2) 팽창도 (가교 밀도)

3) 유동학 (rheology: 융해 범위, 융해 점도, 열 안정성, 분자량분포)

4) 크로마토그래피 방법 (예들 들어, 잔류 단량체, 잔류 첨가제, 잔류 용출물[leachables]을 위한 가스 크로마토그래피 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피 ; 분자량 평균과 분자량분포 변화를 위한 크기별 배제 크로마토그래피/겔 투과 크로마토그래피[size exclusion/gel permeation chromatography]) ; 확인을 위한 질량 분석법)

5) 분광법 (예들 들어, 자외선 분광법, 적외선 분광법, 핵자기 공명, 확인, 조성, 분포를 위한 질량 분광법 : 중금속과 촉매 함량을 위한 원자 흡수 분광법)

6) 열 분석법 (예들 들어 융해 범위 또는 연화점, 혼합물, 유리 전이를 위한 시차 주사 열 계량계[DSC; differential scanning calorimetry])

의료기기 완제품에는 여러 공급업체로부터 제공받은 여러 가지 원재료가 포함되어 있을 수 있기 때문에 분석 작업을 최소화하기 위하여 집중적인 문헌연구를 하고, 공급업자에게 믿을 만한 분석 자료를 요청하는 것이 권장된다.

추가 지침은 제17장(ISO 10993-18)과 ISO 10993-19에 제시되어 있다.

부록 B

(참조)

고분자 원재료의 환경응력균열 (ESC)

B.1 일반사항

환경응력균열(ESC)은 화학적 또는 생물학적 환경에 대한 노출과 잔류 또는 가해진 응력으로 유발되는 고분자재료의 균열(crack) 현상이다. 이러한 균열들은 균열  사이를 이어주는 물질(bridging material)에 의해 그물모양으로 균열이 퍼져나가는 크레이징 현상을 보일 수도 있다. 균열의 특성은 사용된 고분자의 종류에 따라 달라질 수 있다. 이외에도 균열에 의해 저분자량 분해 산물이 발생할 수 있다. ESC 시험의 목적은 의료기기에 사용할 원재료가 환경적으로 응력 균열될 가능성이 있는지를 측정하는 것이다. ESC 시험을 통해 응력균열을 확인한 경우, 다른 방법을 사용하여 부산물의 화학적 특성, 생물학적 시험 및 독성학적 위험 평가를 해야 한다.

B.2 영향을 받은 고분자의 유형

ESC는 여러 해 동안 다양한 고분자계에서 나타났다. 의료기기에 사용되는 고분자계 중에서 ESC가 관찰되었던 예로 폴리우레탄(Polyurethanes), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylates), 폴리올레핀(polyolefins), 폴리스티렌(polystyrenes) 및 폴리카보네이트(polycarbonates)가 있다. 사용된 고분자의 화학적 성질이 원자재의 ESC에 영향을 미치는 유일한 요인은 아니며, 원재료의 미세구조도 영향을 미친다. 고분자의 비결정영역(amorphous region)은 결정 영역(crystalline region) 보다 ESC에 더 민감하다. 의료기기 제조 중에 고분자의 가공과정에서 최종 원재료의 미세구조에 영향을 미쳐 잔류 응력이 유도될 수 있다. 결과적으로, 최종 원재료의 미세구조와 잔류 응력을 통해 부분적으로 ESC에 민감할 수 있는 정도를 측정한다.

B.3 시험 모델

B.3.1 ESC는 응력과 환경 요인이 나타날 때만 발생하므로, 시험 중인 의료기기에 대한 시험 시스템 모델을 통해 두 요인을 규정해야 한다.

B.3.2 시험 시스템 모델을 개발할 때는 제조공정 중에 생기는 고분자의 내부응력과 의료기기 완제품의 사용 중에 생길 수 있는 응력의 유형을 고려해야 한다. 예를 들어, 사용 중에 주기응력(cyclic stresses)이 생기는 의료기기(예; 좌심실 보조 장치)는 사용 중에 정적 응력(static stress)만 발생하는 의료기기와는 다른 시험 모델이 필요하다. 이러한 고려사항을 통해 적용할 응력 모델의 최종 선정하여야한다.

B.3.3 임계 변형 수준(critical strain level) 아래에서는 ECS가 발생하지 않을 것이다. 따라서 응력 모델은 이 수준 이상의 변형을 허용해야 한다. 이 임계 변형 수준은 원재료와 환경에 따라 다르다. 최고의 시나리오와 최악의 시나리오가 모두 시험 시스템 모델 설계의 일부분이 될 수 있다.

B.3.4 시험이 이루어질 적합한 환경 모델(즉, 시약 또는 시험용액)의 개발에 관한 논의를 위해서는 3.1.4를 참조한다.

주) 가수분해 과정(hydrolytic mechanisms)의 경우에는 에스테라아제(esterase), 우레아제(urease) 또는 파파인(papain) 같은 액체 및/또는 효소를 포함한 용액이 적합할 수 있다. 산화과정의 경우에는 물과 AgNO3, 예를 들어, 0.1 mol/L AgNO3 용액을 사용할 수 있다. 그러나 은 미립자는 생물학적 평가를 촉발시키고 이에 영향을 미칠 수 있다. 또한 산화과정의 경우에는 희석한 과산화수소 용액과 코발트(II) 염의 혼합물, 예를 들어 5%∼10%의 H2O2 및 0.05 mol/L ∼ 0.1 mol/L 염화코발트를 사용할 수 있다.

B.3.5 동물 모델이 가장 타당한 환경 모델이 될 수 있다(예를 들어, 제6장 참조).

B.4 결과 평가

B.4.1 생물학적 영향

ESC는 다양한 생물학적 영향을 미치는 분해산물을 방출할 수 있다. 본 규격은 이러한 영향들을 시험하는 가장 좋은 방법을 결정할 수 있는 지침을 제공한다. 특히 제1장은 사용자가 시험 시 고려해야 하는 생물학적 영향의 유형에 대한 지침을 제공한다. 이러한 영향에는 독성학적 영향(toxicological effects)과 국소 조직 영향(local tissue effects)이 포함되지만 이에 국한된 것은 아니다.

B.4.2 의료기기 성능

의료기기의 성능은 ESC의 결과로 저하될 수 있다. 사용자는 의료기기가 ESC 후에 여전히 의도된 대로 성능을 발휘하는지 확인하기 위해 의료기기의 성능을 평가해야 한다. 의료기기 개별 규격과 ISO 14971은 사용자가 이런 확인을 하는데 도움이 될 수 있다.

B.5 결과 보고

B.5.1 시험 시스템 모델을 선정하게 된 이론적 근거를 기록해야 한다.

B.5.2 모델 시험 시스템에 대한 상세한 설명에는 최소한 다음과 같은 정보를 포함해야 한다.

1) 시험된 원재료

2) 의료기기 완제품과 시험 검체와의 관련성

3) 적용한 응력의 수준 및 유형

4) 환경의 선정

5) 시험 기간

6) 시험 결과(본 규격의 다른 장을 따라 실시하는 시험은 개별 규격에서 요구하는 보고 계획서를 사용해야 한다).

제13장 세라믹 소재 의료기기에서 얻어진 분해산물의 확인과 정량을 위한 체제

(관련규격: ISO 10993-14:2001)

1 적용범위

본 장에서는 정량을 위하여 세라믹(유리 제품을 포함)에서 분해 산물의 용액을 얻는 두 가지 방법을 기술한다. 또한 분해 산물을 확인하기 위하여 이 용액의 분석과 관련된 지침을 제시한다. 본 장의 성격은 일반적이기 때문에 가능한 한 적합한 사용 조건 하에서 분해 산물의 생성을 다루고 있는 제품 개별 표준을 가장 먼저 고려하여야 한다.

본 장에서는 체외 시험을 실시하는 동안 세라믹의 화학적 분해로 생성되는 분해 산물만을 다룬다. 외부 에너지나 기계적 응력으로 유도된 분해는 포함되지 않는다. ISO 6872와 ISO 9693에는 화학적 분해 시험이 포함되어 있지만, 분해 산물의 분석은 다루지 않는다.

의료기기에 사용된 세라믹의 범위와 결과의 정확도와 정밀도에 대한 다른 요건 때문에 확인된 특정 분석 기법은 없다. 더 나아가 본 장에서는 분해 산물의 허용 수준에 관한 특정한 요건을 제시하지 않는다.

이 원자재들은 생물 의학적 응용을 목적으로 하지만, 본 장에서는 이들의 분해 산물에 대한 생물학적 작용(biological activity)은 다루지 않는다.

2 정의

본 장에서는 다음 용어 및 정의뿐만 아니라 제1장(ISO 10993-1) 및 제8장(ISO 10993-9)에 수록되어 있는 용어 및 정의를 적용한다.

2.1 세라믹(ceramics): 비금속의 무기 화합물인 일반적으로 결정화된 물질

2.2 공 디스크(blank disc): 완성된 의료기기에 사용하기 위하여 기질 물질로 만든 코팅하지 않은 원형판

2.3 잔류물(retentate): 여과 후에 여과지에 남아있는 용해되지 않은 고형물

2.4 여과액(filtrate): 여과지를 통과한 용액

3 시험과정

3.1 원리

본 장은 두 가지 시험방법으로 구성된다. 첫 번째 시험방법은 낮은 pH에서 실시하는 극한 용액 시험으로 가능성 있는 분해 산물의 관찰을 위해 대부분의 세라믹을 선별해주는 체의 역할을 한다. 두 번째 시험은 생체 내 pH에서 실시하는 모의시험이다. 이들 시험방법의 선택 과정에 관한 흐름도는 그림 4에 제시되어 있다.

세라믹 코팅뿐만 아니라 과립 형태의 세라믹 그리고 벌크 세라믹도 본 장에 설명되어 있는 시험방법을 이용하여야 한다.

권고된 시험 시편(specimen)나 권고된 용액 부피와 차이가 있는 경우, 타당성을 명백하게 입증하여야 한다.

시작

극한 용액 100ml에

5g이 완전히 녹는가?

용액에 10g 사용

극한 시험 시행

어떤 물질이 녹아있는가?

모의 시험 시행

보고

용액에 5g 사용

끝

Yes

No

No

Yes

그림 4 선택 과정에 관한 흐름도

3.2 치과용 의료기기의 시험

3.2.1 개요

본 장은 조직 환경에 최악으로 노출되는 상황을 모방하고자 하는 시험에 적용된다. 구강에 노출되는 치과용 세라믹 (예들 들어 세라믹 베니어링 물질)의 경우에는 ISO 6872에 제시되어 있는 시험 환경이 더 적합하다. 그러나 치과용 임플란트 스템(stems)과 같이 구강에 노출되지 않는 의료기기의 경우에는 본 장의 3.4항을 적용하여야 한다.

3.2.2 구강에 노출되는 치과용 의료기기의 시험방법

구강에 노출되는 치과용 의료기기의 경우에는 ISO 6872 : 1995의 8.4에 제시되어 있는 방법을 극한 용액 시험방법으로 이용하여야 한다.

3.2.3 시편(specimen)의 특성규명

시편의 특성은 3.4.4에 설명되어 있는 바에 따라 규명하여야 한다. 시편의 밀도가 이론상 최대 밀도 값의 99%이상이고, 시편의 평균 표면 거칠기(Ra)가 5㎛ 이하인 경우에는 직접적인 기하학적 측정으로 표면적을 계산할 수 있다.

표면적을 지나치게 과소평가하는 것을 피하기 위하여 기하학적 측정에서는 표면 거칠기가 심하지 않아야 한다.

3.2.4 분석

분석을 위하여 3.4.7.6에서 3.4.7.11에 설명되어 있는 바에 따라 잔류물에서 여과액을 분리하여야 한다.

3.3 일반적 시험 기법

3.3.1 질량 측정

최소한 정밀도가 0.0005g인 저울을 이용하여 질량을 측정하여야 한다. 모든 질량은 6번 반복하여 측정하여야 한다.

3.3.2 건조 기법

측정된 질량 값의 변화가 < 0.1%가 될 때까지 (100 ± 2)℃ 온도의 오븐에서 계속하여 건조하여야 한다. 일반적으로 이러한 과정은 하룻밤 동안 건조를 시키고, 다음날 2시간 간격마다 질량을 측정하여 수행한다.

3.4. 극한 용액 시험방법

3.4.1 원리

극한 용액 시험은 pH가 낮은 구연산 완충액을 주로 이용하는 시험방법이다. 여기에서는 최악의 저급한 사용 환경을 pH값 3으로 정의한다. pH가 3 이하인 환경에 노출되는 의료기기의 경우에는 pH가 이보다 낮은 용액을 이용하여야 하며, 그 타당성을 제시하여야 한다. 극한 용액과 시험 시편 사이에 화학적 반응이 일어나는 경우에는 유사한 pH에서 다른 극한 용액 시험의 타당성을 입증하고, 실행하여야 한다.

3.4.2 적용 범위

본 시험은 모든 세라믹에 적용할 수 있다. 원자재가 혈액 pH (대략 pH 7.35에서 pH 7.45) 에서 존재할 것이기 때문에 모든 원자재에 있어 낮은 pH에서의 분해 기전이 혈액 pH에서의 기전과 동일하지 않을 수 있다는 사실에 주목하여야 한다. 그러나 그럼에도 불구하고, 이러한 엄격한 시험은 분해 산물이 생길 수 있는 극단적인 조건이기 때문에 대부분의 원자재를 선별하는 체로 이용할 수 있다.

용액에서 원자재를 원자재의 용해성 한도까지 용해시킬 것을 권고한다. 용해성 한도 종점까지 시험을 가속시키기 위하여 과립상 시편에 대해 시험을 실시한다.

3.4.3 극한 시험검체 준비

3.4.3.1 시편 구성

원자재의 용도에 적합한 방법에 따라 제작한 시편을 과립 모양으로 만들어야 한다. 시편이 세라믹 코팅제인 경우에는 기질 물질에서 이를 제거하고, 적합한 크기의 과립 모양으로 만들어야 한다. 일부 조건 (예들 들어, 얇은 코팅)에서는 세라믹 물질의 양이 극한 시험을 시행하기에 불충분할 수 있다. 이러한 경우에는 시험의 규모를 축소하여 시험 용액 20ml당 1g의 비율로 준비한 검체를 이용할 수 있다. 이러한 과정을 마치고 나면 대안적으로 선정한 크기의 검체를 이용하기 위하여 질량 측정의 정밀도와 정확성을 적합한 범위로 조정하여야 하며, 타당성을 입증하여야 한다.

3.4.3.2 과립 제작(Granulation)

텅스텐 카바이드(tungsten carbide) 재질의 막자 사발과 공이로 분쇄하여 과립을 제작하여야 한다.

3.4.3.3 크기 결정

과립 모양의 시편은 ISO 3310-1에 기술된 것과 같은 건조선별 방법을 사용하여 400㎛의 선별체는 통과하여야 하고, 315㎛의 선별체에는 남아있어야 한다.

이러한 크기의 과립을 제작할 수 없는 경우,(예들 들어, 코팅제를 분쇄하여야 하기 때문에) 본 장의되어 있는 크기보다 작은 과립을 사용하여야 하며, 그 크기를 기록하여야 한다.

주) 본 절에 설명되어 있는 것보다 작은 크기의 입자를 사용하는 경우에는 용해가 증대될 수 있으며, 따라서 용해 산물의 양은 감소되지 않을 것이고, 생물학적 안전성에 관한 위험(risk) 분석도 손상을 입지 않을 것이다.

3.4.3.4 시편 준비

시작 물질의 질량은 3.4.4.3항에 제시되어 있는 원자재의 용해도 특성에 따라 결정된다.

- 용해성이 낮은 과립 모양의 물질의 경우에는 (5.00 ± 0.05)g을 이용하여야 한다.

- 용해성이 높은 과립 모양의 물질의 경우에는 (10.00 ± 0.05)g을 이용하여야 한다.

3.4.4 극한 시험검체의 특성규명

3.4.4.1 표면적 특성의 규명

예들 들어, ASTM D4780에 제시되어 있는 바와 같은 적합한 방법에 따라 가스 흡착 작용을 통하여 시편의 특성을 규명하여야 한다.

3.4.4.2 밀도

ISO 5017에 따라 시편의 밀도 특성을 규명하여야 한다.

3.4.4.3 가용성의 특성규명

제조업자나 기타 공급업자로부터 입수할 수 있는 원자재에 관한 정보로부터 다음의 방법을 이용하여 원자재의 특성을 ‘고’ 용해성 물질 또는 ‘저’ 용해성 물질로 규명하여야 한다.

- 결정 과정에 대한 흐름도인 그림 4을 참고한다.

- (5.00 ± 0.05)g의 원자재가 3.4.7.1에서 3.4.7.5까지 설명되어 있는 시험을 실시하는 동안 100ml에서 완전히 용해될 것으로 예상되는 경우에는 용해성이 높은 원자재로 간주하여야 한다.

- (5.00 ± 0.05)g의 원자재가 100ml에서 완전히 용해되지 않을 것으로 예측되는 경우에는 용해성이 낮은 원자재로 간주하여야 한다.

- 정보를 이용할 수 없는 경우에는 고 용해성 물질로 간주하여야 한다.

3.4.4.4 미세 구조와 X-선 특성규명

X-선 회절 분석기를 이용하여 X-선 회절법을 실시하여야 한다. 해상도와 재현성은 0.02°이상이 되어야 한다. 미세 구조 분석은 ISO 6474에 설명되어 있는 바에 따라 실시하여야 한다.

3.4.5 시험 장비

3.4.5.1 시험 용기

250ml 폴리프로필렌 용기나 고밀도 폴리에틸렌 용기를 이용하여야 한다. 각각의 시험을 위하여 새로운 시편 용기를 사용하여야 한다. 시험 용액이 오염될 수 있으므로 유리 용기를 이용해서는 안 된다.

3.4.5.2 뷰흐너 깔때기

용해되지 않은 입자를 보유하기에 적합한 흡인 여과기 (Bűchner funnel)나 이와 유사한 유형의 여과기를 이용하여야 한다.

3.4.6 구연산 완충액

구연산 완충액은 신선하게 준비하여야 하며, pH는 (37 ± 1)℃의 온도에서 pH 3.0 ± 0.2가 되어야 한다. 용액은 다음에 따라 준비하여야 한다.

1000ml 용적 측정용 플라스크에 담긴 500ml 물에 21g의 구연산 1수화물(monohydrate)을 용해시킨다. 1 mol/l의 수산화나트륨 용액을 200ml 첨가하고, 물 (ISO 3696, 등급 2)로 눈금까지 희석한다. 이 용액 40.4ml에 0.1 mol/l 염산 59.6ml를 혼합하여 구연산 완충용액을 제조한다.

3.4.7 시험과정

3.4.7.1 뚜껑이 없이 용기의 무게를 측정한다.

3.4.7.2 용기와 시편의 무게를 측정한다. 시편이 있는 용기와 시편이 없는 용기의 질량 차이를 시편의 질량으로 기록한다.

3.4.7.3 구연산 완충용액 (100 ± 1)ml를 첨가한다. 시편이 용액에 접촉을 하고 있는지 신중하게 확인하여야 한다.

3.4.7.4 (37 ± 1)℃로 온도를 조절한 환경에서 (120 ± 1)시간 동안 시편이 담긴 용기를 놓아둔다. 회전 운동이나 상하운동을 이용하여 2Hz로 용기를 교반시켜야 한다. 120시간 이전에 시험 시편이 완전히 용해되는 경우에는 시험을 종료하고, 시험보고서에 시간을 기록한다.

3.4.7.5 용기와 시편을 옮긴 후 실온에서 냉각시킨다.

3.4.7.6 여과 잔류물이 없는 여과재(예들 들어, 여과지)의 질량을 측정하기 위하여 여과재의 무게를 측정한다.

3.4.7.7 여과 작용을 통해 시편을 제거한 후 분석을 위하여 여과액을 보관한다. 여과액을 유리 용기에 보관해서는 안 된다.

3.4.7.8 구연산 완충액을 제거하기 위하여 소량의 물 (ISO 3696, 등급 2)로 여과재와 여과잔류물을 세 번씩 세척한다.

3.4.7.9 여과 잔류물이 남아 있는 여과재와 시편을 일정한 질량으로 건조시킨다.

3.4.7.10 여과 잔류물이 남아 있는 여과재의 무게를 측정한다. 여과 잔류물이 있는 여과재와 여과 잔류물이 없는 여과재 사이의 질량 차이가 여과 잔류물의 질량이다.

3.4.7.11 여과 잔류물 질량과 시편 질량 사이의 차이가 용해된 물질의 질량이다.

3.5 모의 용액 시험방법

3.5.1 원리

모의시험은 3.5.6에 명시된 바와 같이 pH 7.4 ± 0.1의 완충 용액을 주로 이용한다. 이는 정상적인 사람의 pH 수준을 모방한 것이다.

3.5.2 적용 범위

본 시험은 모든 세라믹에 적용할 수 있다.

주) 본 시험에서의 분해 기전은 극한 시험에서의 분해 기전과 동일하지 않을 수도 있다.

3.5.3 모의시험 시편 구성

3.5.3.1 코팅된 세라믹

3.5.3.1.1 공디스크

시험용 시편은 공디스크를 코팅하여 준비하여야 한다.

공 디스크는 완성된 의료기기에서와 동일한 준비 기법과 동일한 기질 물질을 이용하여 지름이 (36 ±1)mm, 두께는 (2 ± 0.1)mm가 되어야 한다.

3.5.3.1.2 코팅된 디스크

완성된 의료기기의 제작에 사용된 코팅 기법을 이용하여 공 디스크의 모든 면을 코팅하여야 한다.

주) 표면적 대 부피 비율이 감소하기 때문에 본 방법을 이용하는 경우 시험의 민감도가 감소될 것이다.

3.5.3.2 기타 모든 세라믹

완성된 의료기기를 제조하는데 사용한 방법으로 제작한 시편에서 3.4.3.2와 3.4.3.3.에 설명되어 있는 방법을 이용하여 시험 시편을 과립 모양으로 만들어야 한다.

3.5.4 모의시험검체의 특성규명

3.5.4.1 개요

코팅된 검체의 경우에는 표면적, 미세 구조 특성과 X-선 특성을 기록하여야 한다. 다른 모든 세라믹의 경우에는 밀도, 표면적, 미세 구조 특성과 X-선 특성을 기록하여야 한다.

3.5.4.2 밀도

ISO 5017에 따라 밀도에 대한 시편의 특성을 구명하여야 한다.

3.5.4.3 미세 구조 특성과 X-선 특성

X-선 회절 분석기를 이용하여 X-선 회절법을 실시하여야 한다. 해상도과 재현성은 0.02° 이상이 되어야 한다. 미세 구조 분석은 ISO 6474에 설명되어 있는 바에 따라 실시하여야 한다.

3.5.4.4 표면적 특성의 규명

예들 들어, ASTM D4780에 제시되어 있는 바와 같은 적합한 방법에 따라 가스 흡착 작용을 통하여 시편의 특성을 규명하여야 한다.

3.5.5 시험 장비

3.5.5.1 시험 용기

250ml 폴리프로필렌 용기나 고밀도 폴리에틸렌 용기를 이용하여야 한다. 각각의 시험마다 새로운 시편 용기를 이용하여야 한다. 시험 용액이 오염될 수 있으므로 유리 용기를 이용해서는 안 된다.

3.5.5.2 뷰흐너 깔때기

용해되지 않은 입자를 보유하기에 적합한 흡인 여과기 (Bűchner funnel)나 이와 유사한 유형의 여과기를 이용하여야 한다.

3.5.6 완충용액

신선한 TRIS-HCL 완충액을 새로이 준비하여야 한다. 500ml 물 (ISO 3696, 등급 2)에 13.25g의 트리스 (하이드록시메틸) 아미노메타인 (tris (hydroxymethyl) aminomethane)을 용해시킨다. (37 ± 1)℃의 온도에서 1 mol/l의 염산을 적절히 넣어 pH를 pH 7.4 ± 0.1로 조정한다. 물 (ISO 3696, 등급 2)로 1000ml까지 만든다.

3.5.7 코팅된 디스크 시험과정

3.5.7.1 개요

모의시험 조건 하에서 분해 산물이 생성되는 지의 여부를 측정하기 위하여 코팅된 디스크와 코팅되지 않은 디스크를 모두 모의시험 용액에 노출시킨다.

3.5.7.2 공 디스크 시험

3.5.7.2.1 노출 시험을 위하여 시험 용기에 공 디스크를 넣는다.

3.5.7.2.2 공 디스크가 담긴 용기에 완충액을 (100 ± 1)ml 첨가한다. 용액과 공 디스크가 완전히 접촉을 하고 있는지 신중하게 확인하여야 한다.

3.5.7.2.3 (37 ± 1)℃로 온도를 조절한 챔버에서 (120 ± 1)시간 동안 공디스크가 담긴 용기를 놓아둔다. 회전 운동이나 상하 운동을 이용하여 2Hz로 용기를 교반시켜야 한다.

3.5.7.2.4 시편이 담긴 용기를 옮긴 후 실온과 같아질 때까지 둔다.

3.5.7.2.5 용액을 여과하고, 분석을 위하여 여과액을 남겨둔다.(“4. 여과액의 분석” 참조)

3.5.7.3 코팅된 디스크 시험

3.5.7.3.1 각각의 시험 시편용 공디스크의 질량에서 코팅된 디스크의 질량을 빼서 세라믹 코팅제의 질량을 측정한다.

코팅제의 질량을 측정하기 위하여 코팅하기 전과 코팅 한 후에 각각의 디스크의 무게를 측정하여야 한다.

3.5.7.3.2 노출 시험을 위하여 시험 용기에 코팅된 디스크를 넣어둔다.

3.5.7.3.3 코팅된 디스크가 담긴 용기에 완충액을 (100 ± 1)ml 첨가한다. 용액과 코팅된 디스크가 완전히 접촉을 하고 있는지 신중하게 확인하여야 한다.

3.5.7.3.4 (37 ± 1)℃로 온도를 조절한 챔버에서 (120 ± 1)시간 동안 코팅된 디스크가 담긴 용기를 놓아둔다. 회전 운동이나 상하 운동을 이용하여 2Hz로 용기를 교반시켜야 한다.

3.5.7.3.5 시편이 담긴 용기를 옮긴 후 실온에서 냉각 시킨다.

3.5.7.3.6 여과재 (예들 들어, 여과지)의 무게를 측정한다.

3.5.7.3.7 용액을 여과하고, 분석을 위하여 여과액을 남겨둔다 (“4. 여과액의 분석” 참조).

3.5.7.3.8 소량의 물 (ISO 3696, 등급 2)로 여과재와 여과 잔류물을 세 번씩 세척한다.

3.5.7.3.9 일정한 질량으로 여과 잔류물이 남아 있는 여과재와 시편을 건조시킨다.

3.5.7.3.10 여과 잔류물이 있는 여과재의 무게를 측정한다. 여과 잔류물이 있는 여과재와 여과 잔류물이 없는 여과재 사이의 질량 차이가 여과 잔류물의 질량이다.

3.5.7.3.11 여과 잔류물의 질량과 코팅제의 원래 질량 사이의 차이가 용해된 원자재의 질량이다.

3.5.8 시험과정 (기타 모든 세라믹)

3.5.8.1 뚜껑 없이 용기의 무게를 측정한다.

3.5.8.2 용기와 시편의 무게를 측정한다. 시편이 있는 용기와 시편이 없는 용기의 질량 차이를 시편의 질량으로 기록한다.

3.5.8.3 (100 ± 1)ml의 완충액을 첨가한다. 용액과 시편이 완전하게 접촉을 하고 있는지 신중하게 확인하여야 한다.

3.5.8.4 (37 ± 1)℃로 온도를 조절한 환경에서 (120 ± 1)시간 동안 시편이 담긴 용기를 놓아둔다. 회전 운동이나 상하운동을 이용하여 2Hz로 용기를 교반시켜야 한다. 120시간 이전에 시험 시편이 완전히 용해되는 경우에는 시험을 종료하고, 시험보고서에 시간을 기록한다.

3.5.8.5 용기와 시편을 옮긴 후 실온에서 냉각 시킨다.

3.5.8.6 여과 잔류물이 없는 여과재의 질량을 측정한다.

3.5.8.7 여과를 통하여 시편을 제거하고, 분석을 위하여 여과액을 남겨둔다. 여과액은 유리 용기에 보관해서는 안 된다.

3.5.8.8 소량의 물 (ISO 3696, 등급 2)로 여과재와 여과 잔류물을 세 번씩 세척한다.

3.5.8.9 여과 잔류물이 남아 있는 여과재와 시편을 일정한 질량으로 건조시킨다.

3.5.8.10 여과 잔류물이 있는 여과재의 무게를 측정한다. 여과 잔류물이 있는 여과재와 여과 잔류물 없는 여과재 사이의 질량 차이가 여과 잔류물의 질량이다.

3.5.8.11 여과 잔류물 질량과 시편 질량 사이의 차이가 용해된 물질의 질량이다.

4 여과액의 분석

4.1 개요

각각의 실험을 시행한 이후에는 용액을 정량적으로 그리고 정성적으로 3번 분석하여야 한다.

분석 기법에 있어서 시험방법의 수, 정밀도, 정확도, 실행은 다양하고 가변적이다. 가능하다면, 유도 결합 플라즈마 광도법 (Inductively Coupled Plasma Spectroscopy, ICP)를 이용하여 검체를 분석하여야 한다. 원자 흡수 분광법 (Atomic Absorption Spectroscopy, AAS)과 같은 다른 시험방법은 덜 유용하긴 하지만, 요구되는 농도 수준에서의 정보를 제시해 줄 수 있다.

4.2 분석해야 하는 원소 또는 화학 물질의 선정

여과액 속에 있는 분석해야 할 화학물질 또는 원소는 재료 속에 존재한다고 알려진 화학성분과 원료에 일반적으로 알려진 치환 물질에 기인하는 소량 원소와 같은 예상 불순물과 제조 중에 재료에 첨가한 예상 첨가물을 포함하여야 한다. 여과액의 부피는 최초 부피에 따라 125ml 혹은 250ml로 한다. 더 큰 부피는 타당성을 제시하여야 한다.

4.3 분석 방법의 민감도

적용된 시험방법은 충분히 민감하여야 한다 (예들 들어, 원자 흡수 분광법 또는 질량 분광법에서 최소한 10-6). 정량 한도보다 높게 검출된 구성 원소만을 기록한다. 가능한 경우에는 적합한 국제 표준에 따라 위해요소(hazard)가 있는 물질을 기록하여야 한다.

5 시험보고서

시험보고서에는 특성을 규명하고, 시험하며, 분석을 하는 동안 본 규격에 따라 확인된 모든 자료가 포함되어야 한다.

a) 시험 기관

b) 측정 일자

c) 시험이 본 장에 따라 수행되었다는 언급과 타당성이 입증된 표준 시험 계획안으로부터 변경된 사실에 대한 사유를 기술한 언급.

d) 배치 번호나 로트 번호를 포함하여 시험원자재에 대한 설명

e) 시험의 유형

1) 고 용해성

2) 저 용해성

3) 극한 (구강내)

4) 극한 (이 규격)

5) 모의시험

f) 표면적과 방법

g) 검체 밀도, 미세 구조와 X-선 회절 패턴

h) 시험 기간

i) 시험결과

1) 시편 질량

2) 첨가된 용액의 양

3) 건조 시간

4) 여과 잔류물의 질량

5) 용해된 물질의 질량

6) 여과액의 질량

7) 화학적 분석과 방법 (코팅된 시편의 경우에 세라믹 분해 산물은 코팅된 디스크의 여과액과 공디스크의 여과액을 비교 분석함으로서 기질로부터 나온 분해 산물과 구별한다.

8) 여과액에서 확인된 각각의 성분에 대하여 총 표면적 당 용해된 질량을 계산

참고문헌

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[6] ASTM D4780, Standard Test Method for Determination of Low Surface Area of Catalysts by Multipoint Krypton Adsorption

제15장 분해 산물과 용출물에 관한 독성동태시험

(관련규격: ISO 10993-16:2010)

1 적용범위

본 장에서는 의료기기와 관련된 독성동태 시험을 설계하고 실행하는 방법에 대한 원리를 제시한다. 부록 A는 의료기기의 생물학적 평가에 독성동태 시험을 포함할 때 고려하여야 하는 사항들에 관한 설명이다.

2 정의

본 장에서는 이 규격의 제1장(ISO 10993-1)과 다음의 용어 및 정의를 적용한다.

2.1 흡수(absorption)

혈액 및/또는 림프계로 물질이 들어가는 과정

2.2 생체 이용율(bioavailability)

특정 물질의 전신 흡수 정도

2.3 생분해(biodegradation)

생물학적 환경에 기인하는 분해

주) 생분해는 체외(in vitro) 시험으로 모형화 될 수 있다.

2.4 생체 흡수(bioresorption)

생체재료(biomaterial)가 생리적 환경에서 분해되고, 그 생성물(들)이 배설 및/또는 흡수되는 과정

2.5 제거율(clearance)

대사 및/또는 배설에 의하여 인체 또는 인체의 일부에서 특정 물질이 제거되는 비율

2.6 Cmax

단위 부피당 질량으로 표시되는 혈장에 있는 특정 물질의 최대농도

주) 체액이나 조직의 최대농도를 참조하는 경우, Cmax, 간과 같은 적합한 식별자가 있어야 하고, 단위 부피 당 질량 또는 질량으로 표시하여야 한다.

2.7 분해 산물(degradation product)

원자재의 화학적 분해에 의해 유래된 원자재의 산물

2.8 분포(distribution)

흡수된 물질 및/또는 이들의 대사 물질이 인체 내에서 순환을 하고, 분배되는 과정

2.9 배설(excretion)

흡수된 물질 및/또는 이들의 대사 물질이 인체에서 제거되는 과정

2.10 용출액(extract)

시험 또는 대조물질의 용출 결과로 생기는 액체

2.11 반감기(half-life)

t1/2

동일한 인체 체액이나 조직에서 특정 물질의 농도가 그 초기값의 50%까지 감소하는데 걸리는 시간

2.12 용출물(leachable)

저장 또는 사용조건에서 의료기기 또는 구성품에서 유래되어 나올 수 있는 화학성분

주) 용출물(예; 첨가제, 고분자 원자재의 단량체 또는 올리고머 성분)은 일반 용출 조건으로 모의된 실험 조건에서 용출할 수 있다.

2.13 평균 체류 시간(mean residence time)

인체에 남아있는 특정 물질을 양적으로 추정할 수 있도록 해주는 반감기와 관련이 있는 통계적 모멘트

2.14 대사(metabolism)

흡수된 물질이 효소 및/또는 비효소 반응에 의하여 인체 내에서 구조적으로 변화되는 과정

주) 최초 반응 산물은 배설되기 이전에 효소 반응이나 비효소 반응에 의해 실질적으로 변경될 수 있다.

2.15 시험물질(test substance)

독성동태 시험에 사용하는 용출물(leachable)이나 분해 산물

2.16 tmax

cmax가 관찰되는 시각

2.17 분포량(volume of distribution)

Vd

인체 내의 단일 구획에서 특정 양의 시험물질이 균일하게 분포되어 있는 경우,

시험물질을 포함하는 명확한 부피를 나타내는 단일 구획 모델에 대한 매개 변수

3 독성동태 시험의 설계 원리

3.1 독성동태 시험은 사례별로 설계하여야 한다.

3.2 시험 방법은 시험을 시작하기 전에 작성하여야 한다. 이러한 방법에는 시험방법을 포함하여 시험 설계가 명확하게 제시되어야 한다. 명확하게 제시하여야 하는 세부적인 부분은 제3.3항에서 제3.8항, 그리고 제4항에 제시되어 있다.

3.3 독성동태 시험에 사용할 방법을 결정하기 위하여 용출시험(leaching studies)의 결과를 고려하여야 한다. 화학적 특성과 물리화학적 특성, 원자재의 표면 형태와 용출물의 생화학적 특성에 대한 정보도 또한 고려하여야 한다.

주) 용출물의 방출 정도와 속도는 표면에서의 농도, 원자재 내에서 표면까지의 이동, 생리학적 환경에서의 용해도와 유속에 좌우된다.

3.4 잠재적인 독성이 있는 분해 산물이나 특성이 규명된 용출물(leachable)로 독성동태 시험을 시행할 것을 권고한다. 그러나 혼합물에 대한 독성동태 시험은 특정한 조건 하에서 실행 가능하다. 용출액(extract liquid)이나 의료기기나 원자재를 분쇄하거나 가루로 만든 형태는 예외적인 환경에서 사용할 수 있으며, 시험 설계 시에 타당성을 입증하여야 한다.

3.5 분석 방법은 생물학적 체액과 조직에서 대사 물질과 용출물(leachable) 그리고 분해 산물을 검출하고, 이들의 특성을 규명할 수 있는 것이어야 한다. 이를 위해서 관련된 본 규격(의료기기 생물학적 안전에 관한 공통기준 규격) 또는 ISO 10993의 다른 장을 참고하여야 한다. 이는 시험보고서에 모두 기록하여야 한다(4.1.11 참조). 정량적 분석 방법은 세부적이고, 민감하며 재현할 수 있는 것이어야 하며, 분석 물질의 예측 농도 범위 이상으로 선형성을 나타내는 자료를 산출하여야 한다. 분석 방법의 타당성을 보고서에 제시하여야 한다.

3.6 시험 설계는 측정할 분석 물질 수준에서 생리학적 체액, 조직 또는 배출물을 명확하게 제시하여야 한다.

주) 혈액은 채취하기에 편리하기 때문에 종종 흡수 시험과 동역학적 매개 변수에 대한 체액으로 선정된다. 전혈, 혈청 또는 혈장 중 어느 것을 분석할 것인지를 제시하고, 이러한 선정의 타당성을 입증하여야 한다. 순환 단백질이나 적혈구의 결합은 체외에서 측정할 수 있다.

3.7 시험보고서에는 검체에서의 분석대상물질의 결합에 대한 정보(예들 들어, 양과 친화도)가 포함되어야 하며, 분석대상물질의 농도가 과소평가되지 않았음을 입증하여야 한다.

3.8 동역학적 매개 변수를 측정할 수 있도록 적절한 간격을 가지는 충분한 자료점이 있어야 한다. 이론적으로 여기에는 몇몇의 말기 반감기가 포함되어야 한다. 실제로 분석 방법의 제약으로 인하여 절충을 해야 할 수도 있다.

4 시험방법에 관한 지침

4.1 일반적 고려사항

4.1.1 적합한 성별과 종으로 시험을 실시하여야 한다. 건강하고 젊은 동물 성체를 최소한 7 일 동안 시험 조건에 순응시켜야 한다. 개별대사우리를 사용하는 경우에는 각각의 동물을 개별 대사 우리로 옮긴 후 최소 24시간동안 순응시켜야 한다. 환경조건은 동물의 사용과 관리에 제시된 지침(제2장 실험동물관리)을 준수하도록 한다.

별도의 규정이 없는 한 시험기간 동안 일반 실험동물용 동물사료와 식수를 자유롭게 주도록 한다. 실험동물은 각각의 시험기간 별로 무작위 군 분리 하여야 한다. 소동물의 경우 최소한 군당 3마리를 이용하여야 하며, 대동물의 경우 최소한 군당 2마리를 이용하여야 한다. 명시된 적절한 시점에 동물을 안락사 시켜야 한다.

4.1.2 관련 검체 안의 시험물질에 적합한 것으로 입증된 평가 과정이 존재하고, 시험물질의 대사 특성이 잘 규명되어 있는 경우에는 비 방사능 표지 시험물질이 유용할 수 있다.

4.1.3 필요한 경우 시험물질은 대사적으로 안정한 위치에서 가급적이면 14C나 또는 3H 그리고 적정한 방사 화학적 순도 (>97 %)로 방사능 표지를 하여야 한다. 3H를 이용하는 경우에는 삼중수소 교환(tritium exchange) 의 가능성을 고려하여야 한다. 해당되는 경우에는 방사능으로 표지된 화합물을 비 방사능 표지 물질로 희석하여야 한다.

4.1.4 방사능으로 표지된 화합물을 이용하는 경우에는 시험물질의 특정한 활동이나 방사 화학적 순도를 미리 알고 있어야 한다.

4.1.5 시험물질은 적합한 경로를 통해 투여하여야 한다. 이러한 경로는 의료기기의 사용목적에 적합한 것이어야 한다. 시험물질(용출물 혹은 분해 산물)의 물리 화학적 특성을 고려하여 적합한 용매를 사용하여 준비하여야 하며, 시험에 적절한 투여경로 및 용량을 적용하여야 한다. 제안된 투여조건에서의 검체의 안정성에 대한 정보가 확보되어야 하며 이를 보고서에 기술하여야 한다.

주) 시험 설계에는 흡수율의 비교를 위하여 다른 경로(들)의 포함을 요구할 수 있다.

4.1.6 투여량 평형 시험의 경우 시험동물은 대사 우리(metabolism cages)에서만 사육하여야 한다.

4.1.7 사후 방출 미생물이나 자발적인 변성을 예방하기 위하여 소변과 배설물은 온도가 낮은 용기(또는 분석을 방해하지 않도록 보존제가 담겨 있는 용기)에 채집하여야 한다. 전혈이나 혈장을 분석하는 경우에는 적합한 항응고제를 이용하여 채혈하여야 한다.

4.1.8 가능하다면 어느 곳에서든 투여하기 전에 대조 표준을 채집하여야 한다. 일부 시험에서는 시험동물에서 대조 표준(예들 들어, 조직)을 채집하는 것이 불가능하며, 이들은 대조군에서 얻어야 한다.

4.1.9 채집 시간은 수행하려는 시험의 유형에 적합하여야 하며, 필요하다면, 분, 시간, 하루, 주 또는 달의 기간으로 실행할 수 있다. 배설물과 관련된 시험의 경우에는 일반적으로 최소한 96 시간 동안 24 시간을 주기로 한다. 혈액 검체가 필요한 경우에는 최대 72시간 동안 수 분에서 수 시간까지의 제시된 스케쥴 예정 범위에 따라 혈액을 채혈한다.

4.1.10 적합한 우수 실험실 기준(good laboratory practice)에 따라 독성동태 시험을 실시하여야 한다.

4.1.11 시험보고서에는 다음의 관련 정보들이 포함되어야 한다.

1) 실험동물의 계통, 공급처, 연령, 성별, 사육환경조건, 사료

2) 시험물질과 검체, 순도, 안정성, 형태(formulation), 투여한 양

3) 투여 경로를 포함한 시험 조건

4) 분석 방법, 용출법, 검출법, 검증

5) 원자재의 전반적인 회수율

6) 매 시점마다 결과에 대한 도표 작성

7) 품질 기준이나 우수 실험실 기준 이행 상태

8) 결과에 대한 검토

9) 결과의 해석

4.2 특정한 유형의 시험에 대한 지침

4.2.1 개요

4.2.1.1 위험평가에 필요한 정보를 얻기 위하여 시험을 설계하여야 하며, 이에 따라 일반적으로 모든 측면을 시험할 필요는 없다.

4.2.1.2 흡수, 분포, 대사, 배설 시험은 하나의 시험으로 몇몇의 측면을 총체적으로 시험하거나 이들 측면 가운에 하나를 개별적으로 시험할 수 있다.

4.2.1.3 시험의 설계에 따라 흡수율, 혈장농도 대 시간 곡선 하의 면적(area under the plasma concentration versus time curve), 1차 모멘트 혈장 농도 대 시간곡선 하의 면적(area under the first moment plasma concentration versus time curve) 분포량, cmax, tmax, 반감기, 평균 체류 시간, 배설율 및 제거율을 포함한 여러 가지 동역학적 매개변수를 결정할 수 있다.

4.2.1.4  동역학적 매개변수는 특정한 분자들에 대해서만 결정할 수 있으므로, 평가 방법은 이러한 분자들에 민감하고 특정한 것이어야 한다. 관련 화합물의 정확한 동역학적 매개변수는 정맥내 투여를 한 후에만 결정할 수 있다. 따라서 동역학적 매개변수 시험의 설계에 제한된 정맥내 투여 시험을 포함해야 할 수도 있다. 이는 소량의 흡수된 투여량을 계산할 수 있도록 해주며, 다른 시험에서 추정된 매개변수를 수정하는데 이용한다.

4.2.1.5 적합한 동역학적 모델을 이용하여 동역학적 매개변수를 결정하여야 한다. 동역학적 매개변수를 추정할 수 있는 컴퓨터 프로그램은 다양하다. 사용하기 전에 소프트웨어의 타당성을 입증하여야 하며, 이러한 입증 사항을 문서로 기록하여야 한다. 모델링에서 프로그램에 도입된 가설과 선택사항들을 문서화하여야 한다.

4.2.2 흡수

흡수는 시험물질의 물리 화학적 형태와 용액(vehicle) 그리고 투여 경로에 따라 좌우된다. 이는 혈액, 혈청, 배설물 그리고 조직의 농도를 통하여 추정할 수 있다. 완전한 생체 이용율 시험을 고려하여야 한다. 기타 필요한 정보와 방사능 표지 물질의 이용 가능성 그리고 평가 방법에 따라 적합한 유형의 시험을 선정한다. 흡수상(absorption phase)에서 충분한 검체를 채집할 수 있는 경우에만 동역학적 매개변수 시험에서 확실한 흡수율 상수를 산정할 수 있다.

주) 체외 방법이 화학 물질의 피부 흡수와 위장 흡수에 대한 중요한 정보를 제공해 줄 수 있다.

4.2.3 분포

4.2.3.1 일반적으로 분포 시험에는 방사능으로 표지된 화합물이 필요하다. 시험은

- 해부된 조직에서 측정된 수준을 정량하며,

- 전혈 자기 방사법(WBA; whole-body autoradiography)을 이용하여 정성 분석하고,

- WBA(whole-body autoradiography) 표준 등급을 이용하여 준정량 할 수 있다.

4.2.3.2 일반적으로 분포 시험에서 검체를 추출하는 시간은 시험물질의 배설에 따라 tmax,, 24 시간, 168 시간 또는 그 이상의 긴 시간 동안이어야 한다. 추가적인 자료가 필요한 경우에는 중간 시간을 이용할 수 있다. 대체적으로 검체는 초기의 흡수상(phase of absorption)과 배설상(phase of elimination)에서 자주 추출한다. 그러나 동역학적 매개변수를 최상으로 추정할 수 있기 때문에 (이론상으로 반감기 3에서 4) 배설상(elimination phase)에서 더 많이 추출해야만 한다. 주요한 결정요소는 분석감도이다.

4.2.4 대사와 배설

4.2.4.1 대사 우리(metabolism cages)는 시험 기간 내내 소변과 배설물을 따로 채집할 수 있는 것이어야 한다. 최대 14일 까지 시험을 하는 경우에는 시험의 마지막까지 매 24 시간마다 소변과 배설물을 따로따로 채집하여야 한다. 일부 시험 설계에서는 그 사이에 동물이 희생될 수도 있다. 시험물질이나 시험물질의 대사 물질이 급속하게 배설될 것 같은 경우에는 24 시간 전에 검체를 채집할 수 있다. 보다 장기간 동안 시험하는 경우에는 단기 시험에서와 마찬가지로 최초의 기간에 검체를 추출하여야 한다. 그 이후에는 평가 기간 당 24 시간을 주기로 지속적으로 검체를 추출하여야 한다.

주) 장기간(prolonged periods) 동안 대사 우리(metabolism cages)를 사용하는 것은 동물 복지에 해로울 수 있다. 장기간 시험의 경우, 불연속 적으로 검체를 채취할 수 있으며, 이러한 결과를 연속적인 검체 수집으로 외삽 할 수 있다.

4.2.4.2 동물의 시체 및/또는 개별 동물의 표적 기관은 분석을 위하여 보관하여야 하며, 혈장 및 전혈에서의 농도를 분석하기 위하여 혈액을 채혈 하여야 한다. 희생되어야 하는 시간에 대사 우리에서 검체를 채집한 후에는, 우리(cage)와 올가미를 적합한 용액으로 세척하여야 한다. 발생되는 세척물을 함께 모아서 부분 대표성분으로 분석을 위하여 보존할 수 있다.

4.2.4.3 방사능 표지 화합물을 사용하는 경우 [아래의 주) 참조]에 시험물질의 회수율 또는 예측된 회수율은 이론적으로 (100 ± 10) %가 되어야 한다. 각 부분에 있는 시험물질의 양은 적절한 환경에서 방사능으로 표지된 화합물과 방사능으로 표지되지 않은 화합물에 대하여 적합한 것으로 입증된 과정에 따라 분석하여야 한다. 방사능으로 표지된 화합물을 사용하는 경우에는 특정한 평가 방법을 사용하지 않는 한, 모 성분(parent compound)과 대사산물을 모두 평가하는 것이 바람직하다. 방사능으로 표지된 화합물을 배설물(대변 및/또는 소변)이나 인체에서 충분하게 회수할 수 없는 경우에는 배설되는 공기의 채취를 고려하여야 한다.

주) 명시된 회수 범위를 모든 경우에 달성할 수 있는 것은 아니며, 보고서에 차이가 나는 이유를 설명하고, 검토하여야 한다.

4.2.4.4 생물학적 환경에서의 방사능 수준은 예를 들어, 액체섬광계수법으로 측정하여야 한다. 그러나 이것이 화합물과 대사 물질의 혼합 농도를 나타내고, 그것으로부터 어떤 동역학적 매개 변수도 유도해 낼 수 없음에 유의하여야 한다. 대사 물질의 분리를 반드시 고려하여야 하는 경우에는 다수의 용출 과정과 크로마토그래피 과정(예들 들면, 고성능액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 가스-액체 크로마토그래피와 같은)이 포함되기도 하며, 원자재 결과물의 특성을 화학적인 방법과 물리화학적 기법(예들 들면, 질량 분광법, 핵자기 공명 분광법)으로 규명하여야 한다.

조직, 세포, 균질 현탁액 그리고 분리된 효소를 체외 대사 시험에 사용하는 경우에는 이를 문서화하여야 한다. 이들 방법은 화합물을 적합한 부위에 이용할 수 없는 경우 체내에서 일어나지 않을 수도 있는 잠재적인 대사를 규명해준다. 체내와 비교된 체외 대사의 속도와 정도에는 종종 차이가 있다.

부록 A

(규정)

독성동태 시험 시 고려하여야 하는 환경

A.1 사용되는 대부분의 의료기기에는 잠재적인 위해 요소가 존재한다. 화학적 특성평가(chemical characterization)는 화학적 위험 요소(잠재적 위험)를 규명하며(제17장, ISO 10993-18과 ISO 14971 참조), 이는 독성동태 시험에 앞서 고려되어야 한다. 하지만 화학적 특성평가에서 확인된 모든 확인 가능한 의도되거나 의도되지 않은 용출물 그리고 분해 산물에 대한 독성동태 시험이 필요하거나 가능한 것은 아니며, 이는 모든 의료기기에 대해서 마찬가지다.

A.2 의료기기의 생물학적 평가 방법의 일부분으로써 독성동태 시험의 필요성은 의료기기의 사용목적과 함께 최종산물과 이의 구성 화학물질 그리고 의도되거나 의도되지 않은 용출물과 분해 산물을 참작하여 고려되어야 한다.

활성 성분과 용출물 및/또는 분해 산물 간에 있을 수 있는 독성동태 상호작용도 고려해야 한다.

A.3 적절하게 검증되고, 합리적이며 실질적으로 이용 가능하며, 신뢰성 및 재현이 확보 된 체외 방법의 적용이 체내 시험보다 우선적으로 고려되어야 한다(제1장, ISO 10993-1). 적절한 시험방법이 있는 경우 체외 시험법(예: 조직, 균등질 또는 세포)은 가능성보다는 개연성 있는 분해 산물의 연구에 적용되어야 한다. 제2장(ISO 10993-2)은 고려해야 하는 모든 체내 시험에 적용된다.

A.4 다음과 같은 경우에는 독성동태 시험을 고려하여야 한다.

1) 의료기기가 생체 흡수 되도록 설계되어있는 경우

2) 의료기기가 영구 접촉 이식물이며, 생분해 또는 상당히 부식되는 것(금속원자재)으로 알려져 있거나 또는 그럴 가능성이 있는 경우 및/또는 의료기기에서 용출물의 이동이 발생하는 경우

3) 잠재적 독성 또는 반응성 분해 산물과 용출물의 상당한 양이 임상적으로 사용하는 동안 의료기기에서 인체로 방출될 수 있거나 방출되는 것으로 알려져 있는 경우나 그럴 가능성이 있는 경우

4) 활성 성분의 상당한 양이 의료기기에서 방출되는 것으로 알려져 있는 경우나 그럴 가능성이 있는 경우

주) ‘상당한 양’이라는 의미는 조사대상 화학 물질의 특성에 좌우된다.

A.5 다음과 같은 경우에는 독성동태 시험을 실시하지 않는다.

1) 분해 산물과 용출물(leachable)에 관련된 충분한 독성동태 자료나 독성 자료가 이미 존재하는 경우

2) 활성 성분과 관련된 충분한 독성동태 자료나 독성 자료가 이미 존재하는 경우

3) 특정한 의료기기의 분해 산물과 용출물의 방출비율 또는 예상 방출비율이 임상적인 노출에서 안전 수준인 것으로 입증된 경우(제16장, ISO 10993-17 참조)

4) 분해 산물과 용출물의 임상적인 노출이 역사적 경험을 참고하여 안전하다고 문서화된 경우

A.6 금속, 합금 그리고 세라믹의 분해 산물과 용출물(leachable)은 일반적으로 독성동태 시험의 타당성을 입증하기에는 너무 적은 양으로 방출된다.

A.7 원자재가 복잡하고 내인성이거나 분석적으로 구별할 수 없는 내인성 산물과 아주 유사한 산물을 포함하는 경우 독성동태 시험이 일반적으로 실현가능하지 않다.

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